羅 輝，楊 波，李亞蕾*，羅瑞明，張杏亞，馬思麗，姬 琛

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

秦川牛是陜甘寧地區(qū)優(yōu)勢(shì)畜種，近5 年存欄量在300萬(wàn) 頭左右，年均出欄量有100萬(wàn) 頭左右，年產(chǎn)肉量在50萬(wàn) t以上，具有一定地域特色。秦川牛肉質(zhì)細(xì)致、肉味濃郁、營(yíng)養(yǎng)全價(jià)，肉用性能好。其背最長(zhǎng)肌具有瘦肉比例高、大理石花紋豐富等特點(diǎn)，可用于制作高檔牛排，提升附加值，因此本研究選用秦川牛背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象。

目前肉類行業(yè)無(wú)論是在活體動(dòng)物中還是在屠體中缺乏一種快速、客觀的技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)評(píng)估牛肉貯藏過(guò)程中的品質(zhì)指標(biāo)變化。解決這一技術(shù)難題能提高牛肉行業(yè)的效率，并提高工業(yè)生產(chǎn)更高質(zhì)量肉制品的能力。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，必須確定影響肉質(zhì)性狀變化的潛在機(jī)制，為此，研究肉質(zhì)的科研工作者普遍認(rèn)為，在試圖開(kāi)發(fā)預(yù)測(cè)肉品質(zhì)的技術(shù)之前，首先要揭示負(fù)責(zé)調(diào)控表觀變化的基因和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。這樣便于準(zhǔn)確地管理肉類質(zhì)量性狀，并為生產(chǎn)者開(kāi)發(fā)基因選擇方案，以優(yōu)化種牛品質(zhì)。在過(guò)去的幾十年里，人們?yōu)閷?shí)現(xiàn)這一目標(biāo)已經(jīng)做出了許多嘗試，特別是利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來(lái)研究肉類品質(zhì)變化，以更好地揭示牛肉嫩度的潛在機(jī)制。Sawdy等研究表明牛背最長(zhǎng)肌貯藏7 d后嫩度與肌球蛋白重鏈斷裂有關(guān)，在肌肉嫩化過(guò)程中，肌球蛋白輕鏈1、2和重鏈1的表達(dá)量明顯降低；李升升利用非標(biāo)記定量（label-free quantitative，LFQ）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究牦牛平滑肌貯藏過(guò)程嫩度的變化機(jī)理，結(jié)果表明SLC25A4、Calpastatin、TPM3、UQCRC1、LMOD1、THBS4和ZYX 7種蛋白可能是牦牛平滑肌貯藏期嫩度變化的指示蛋白；Jia等也利用LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)牛胸最長(zhǎng)肌肌漿蛋白進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在貯藏的前期peroxiredoxin-6表達(dá)量高的組隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)嫩度也會(huì)顯著增高，由此可以通過(guò)檢測(cè)活體組織或屠宰后不久牛胸最長(zhǎng)肌中peroxiredoxin-6含量來(lái)預(yù)測(cè)嫩度變化，因此peroxiredoxin-6可作為肉類嫩度的潛在蛋白標(biāo)記物；Poleti等利用高清晰度質(zhì)譜儀（high definition mass spectrometry，HDMS）檢測(cè)Nellore牛背最長(zhǎng)肌蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)118種蛋白質(zhì)的豐度發(fā)生了顯著變化，經(jīng)過(guò)生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要富集在丙酮酸代謝、分解代謝、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合和鈣離子結(jié)合等途徑，由此推斷能量代謝和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化可能影響到嫩度。在幾十年的研究中，人們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷揭示了調(diào)控嫩度變化的指示蛋白，調(diào)控嫩度的蛋白質(zhì)圖譜也在逐漸完善，嫩度變化預(yù)測(cè)技術(shù)也有了部分理論的支撐。但不同牛品種之間表現(xiàn)也會(huì)有較大差異，秦川牛背最長(zhǎng)肌嫩度變化機(jī)理報(bào)道鮮有發(fā)現(xiàn)，本研究希望能進(jìn)一步完善這一理論基礎(chǔ)。

本研究中利用4維-LFQ（4 dimension-LFQ，4D-LFQ）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選秦川牛差異蛋白，4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相對(duì)于3維蛋白質(zhì)組學(xué)在質(zhì)荷比（/）、離子強(qiáng)度和保留時(shí)間3個(gè)維度添加了離子淌度（mobility）。離子淌度為牛肉肌肉組織這種復(fù)雜樣品體系的蛋白組檢測(cè)提供了更多可能，可根據(jù)離子的截面和形狀進(jìn)一步對(duì)蛋白進(jìn)行分離鑒定，使蛋白組檢測(cè)數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確、全面。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25 月齡秦川公牛 甘肅省平?jīng)鍪袥艽h旭康食品有限責(zé)任公司。

蛋白酶抑制劑 德國(guó)Calbiochem 公司；胰酶美國(guó)Promega公司；乙腈 美國(guó)Fisher Chemical公司；甲酸瑞士Fluka公司；三氟乙酸、尿素、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、三乙基碳酸氫銨、三氟乙酸 美國(guó)Sigma公司；BCA試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；pH校準(zhǔn)液上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 那艾精密儀器（上海）有限公司；205便捷式pH計(jì) 德國(guó)德圖集團(tuán)；MiniVac Alpha冷凍離心機(jī) 美國(guó)Scan speed公司；timsTOF Pro質(zhì)譜儀、NanoElute超高效液相色譜儀 德國(guó)Bruker公司；Forma 994超低溫冰箱 美國(guó)Thermo公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀英國(guó)Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選用3 頭生長(zhǎng)發(fā)育正常、體壯無(wú)病、25 月齡左右的去勢(shì)秦川公牛，屠宰后取牛兩側(cè)背最長(zhǎng)肌并分割為質(zhì)量約（100f10）g的肉樣，隨機(jī)分成5 組并置于透氣性為23.5 g/（m?d）的聚乙烯保鮮袋中。立即取其中一組樣品檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)（視為宰后第0天樣品），將蛋白質(zhì)組學(xué)、能量物質(zhì)檢測(cè)和剪切力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所用樣品置于液氮中保存。其他4 組貯藏于0～4 ℃的冰箱中，分別在第2、4、6、8天時(shí)取出，測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

1.3.2 能量物質(zhì)含量的測(cè)定

稱取50 mg樣品置于離心管中，加入4 ℃預(yù)冷的1 mL 混合液（含0.6 mol/L高氯酸和1 mmol/L乙二胺四乙酸），勻漿2 min后4 ℃、10 000h條件下離心10 min，取700 μL上清液加入0.2 mL 1 mol/L NaOH。搖勻后反應(yīng)5 min，取0.5 mL混合溶液用聚碳酸酯濾膜過(guò)濾后于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎酶呦嘁合嗌V法檢測(cè)ATP、ADP、AMP、NADH的含量。流動(dòng)相為220 mmol/L硫酸鉀緩沖液（含10%甲醇并使用四丁基氫氧化銨調(diào)節(jié)至pH 6.5），等度洗脫，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.3.3 剪切力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]測(cè)定樣品剪切力，以表征樣品的嫩度。取出貯藏在0～4 ℃環(huán)境下的肉樣，插入熱電偶溫度計(jì)至肉樣中央并置于蒸煮袋中，在85 ℃水浴鍋中加熱，待肉樣中心溫度達(dá)80 ℃時(shí)取出，流動(dòng)自來(lái)水沖洗蒸煮袋將肉樣冷卻至室溫，切除表面，避開(kāi)筋腱等部分，平行于肌纖維方向用口徑為1.27 cm的取樣器切割制作肉柱，用質(zhì)構(gòu)儀“V”型剪切刀檢測(cè)肉柱，剪切刀垂直于肌纖維方向，剪切速率與剪切距離分別為1.5 mm/s、40 mm，每個(gè)肉樣檢測(cè)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 pH值測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]的方法，pH計(jì)使用前用pH校準(zhǔn)液校正，取4 cmh4 cmh4 cm樣品（60 g左右）背最長(zhǎng)肌，探頭沿肌纖維方向插入肉樣內(nèi)部，每個(gè)樣品取5個(gè)點(diǎn)測(cè)定，結(jié)果取平均值。

1.3.5 4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度

參照文獻(xiàn)[18]的方法提取蛋白質(zhì)。4 ℃預(yù)冷后的研缽放入適量樣品和液氮研磨成粉末狀，加樣品4 倍體積的裂解緩沖液（等體積的8 mol/L尿素和1%蛋白質(zhì)酶抑制劑）。超聲裂解后移入離心管，4 ℃、12 000h條件下離心10 min，取上清液利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。

參照文獻(xiàn)[19]的方法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行胰酶酶解。取上述蛋白溶液加入二硫蘇糖醇溶液，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度為5 mmol/L。56 ℃避光環(huán)境下還原30 min再加入100 mmol/L碘代乙酰胺溶液，將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)至1 mmol/L，25 ℃避光環(huán)境下靜止12 min。用四乙基溴化銨溶液將樣品中的尿素稀釋到2 mol/L以下，按照蛋白質(zhì)量的2%添加胰酶，37 ℃酶解12 h，再按照蛋白質(zhì)量的1%添加胰酶，37 ℃酶解4 h。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析：使用NanoElute超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行肽段分離，流動(dòng)相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液，用來(lái)溶解蛋白片段；流動(dòng)相B為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-乙腈溶液；流速為300 nL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?～3 min，4%～6% B；3～70 min，6%～25% B；70～82 min，25%～32% B；82～87 min，32%～80% B；87～90 min，80%～100% B。肽段分離后注入到capillary離子源中進(jìn)行電離，電壓設(shè)置為1.4 kV，使用飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)肽段母離子及其二級(jí)碎片進(jìn)行檢測(cè)和分析，設(shè)置掃描范圍100～1 700/。通過(guò)平行累積串行碎裂模式（parallel accumulation serial fragmentation，PASEF）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。將采集后一級(jí)質(zhì)譜用10 次PASEF模式采集母離子電荷數(shù)在0～5范圍獲得二級(jí)譜圖，為了避免母離子的重復(fù)掃描串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為24 s。

1.3.6 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

二級(jí)質(zhì)譜的數(shù)據(jù)檢索采用Maxquant（v1.6.6.0）軟件進(jìn)行。各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置如下：選擇Bos_taurus_9913_PR_20190915.fasta（37 948 條序列）為數(shù)據(jù)庫(kù)，加入常見(jiàn)的污染庫(kù)排除污染蛋白質(zhì)的影響，加入反庫(kù)特征信息匹配排除計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽(yáng)性率（false discovery rate，F(xiàn)DR）影響；酶切方式為Trypsin/P，Main search與First search的二級(jí)碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度為0.04 Da，一級(jí)母離子質(zhì)量誤差容忍度設(shè)為40h10Da；肽段最大修飾數(shù)、漏切位點(diǎn)數(shù)和肽段最小長(zhǎng)度分別設(shè)置為5、2、7。固定修飾為半胱氨酸烷基化，可變修飾為蛋白N端的乙?；图琢虬彼岬难趸?。肽匹配圖譜鑒定的FDR和蛋白鑒定均設(shè)置為1%。

1.3.7 生物信息學(xué)分析

篩選出的差異蛋白質(zhì)利用軟件ClusterProfiler（3.4.4）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，比對(duì)后獲得差異基因的基因本體（gene ontology，GO）（包括生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC））功能信息。利用String 10.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org/）和Cytoscape 3.6.1軟件繪制差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.8 肌原纖維小片化指數(shù)的測(cè)定

稱取肉樣1 g使用冷凍研磨儀攪碎后置于離心管中，加入10 mL肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）緩沖液（含100 mmol/L氯化鉀、11.2 mmol/L磷酸氫二鉀、8.8 mmol/L磷酸二氫鉀、1 mmol/L乙二醇雙四乙酸、1 mmol/L氯化鎂、1 mmol/L疊氮化鈉），4 ℃、1 200 r/min勻漿3 min，然后4 ℃、1 000h離心15 min收集上清液；加入10 mL MFI緩沖液重懸沉淀并按上述步驟再次勻漿后離心，收集上清液；再加入5 mL預(yù)冷MFI緩沖溶液使沉淀充分懸浮后用200 目篩過(guò)濾，再用5 mL MFI緩沖液清洗離心管，然后用200 目篩過(guò)濾，合并上清液和濾液，并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定混合溶液的蛋白質(zhì)量濃度。用MFI緩沖液調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL左右，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值帶入下式計(jì)算MFI。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 25軟件進(jìn)行單因素分析，采用鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。采用Origin 2018軟件作圖，采用微生信在線平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行秦川牛肉背最長(zhǎng)肌差異蛋白數(shù)據(jù)分析并作圖。采用SPSS 25軟件分別對(duì)差異蛋白表達(dá)量與剪切力、能量物質(zhì)含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，篩選出與嫩度相關(guān)的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程中ATP、ADP、AMP、NADH含量的變化

采用高效液相色譜法測(cè)定了秦川牛背最長(zhǎng)肌不同貯藏期能量物質(zhì)含量。如表1所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，ATP的含量呈顯著下降趨勢(shì)（＜0.05），由0 d時(shí)的（10.15f0.60）μmol/g下降至8 d時(shí)的（0.50f0.20）μmol/g，其中在0～2 d下降速率較快，在2～8 d下降速率較為緩慢，第8天時(shí)基本檢測(cè)不出ATP，ADP、AMP的含量在整個(gè)貯藏期（0～8 d）均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。秦川牛宰后肌肉細(xì)胞中ATP進(jìn)行著不可逆的降解過(guò)程，由于ATP含量的減少，ADP、AMP含量隨之減少。貯藏過(guò)程中NADH含量變化可反映組織細(xì)胞中氧化還原和能量變化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中NADH含量逐漸降低，說(shuō)明宰后肌肉細(xì)胞發(fā)生變化，使細(xì)胞呼吸功能失調(diào)，氧化磷酸化進(jìn)程受阻，引起NADH含量出現(xiàn)顯著下降的現(xiàn)象。

表1 秦川牛背最長(zhǎng)肌不同貯藏時(shí)間下ATP、ADP、AMP、NADH含量變化Table 1 Changes in ATP, ADP, AMP and NADH contents in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle with storage time

2.2 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程剪切力的變化

嫩度是影響秦川牛肉口感的重要品質(zhì)屬性，也是影響消費(fèi)者購(gòu)買欲的重要指標(biāo)。咀嚼破碎肉制品時(shí)口腔所受的抵抗力大小可稱為肉制品的嫩度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以剪切力表征嫩度。如圖1所示，秦川牛肉在貯藏過(guò)程中剪切力總體呈先上升后下降的趨勢(shì)（＜0.01），其下降幅度大于上升幅度。第0天時(shí)剪切力為（120.25f5.15）N，在第4天時(shí)達(dá)到最大值，為（157.94f2.53）N，第8天時(shí)又降至（93.41f5.08）N，通過(guò)以上剪切力的變化可以看出秦川牛背最長(zhǎng)肌在貯藏中的嫩度變化情況，在0～4 d時(shí)逐漸降低，第4天時(shí)到達(dá)最低點(diǎn)，之后逐漸升高，直至第8天。

圖1 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏期間剪切力變化Fig.1 Changes in shear force of longissimus dorsi muscle with storage time

2.3 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程中pH值變化

秦川牛背最長(zhǎng)肌在貯藏過(guò)程中pH值變化情況如圖2所示，宰后0 d時(shí)pH值為6.78f0.02，在0～2 d貯藏期內(nèi)下降速率較快，2～4 d貯藏期下降速度放緩后到達(dá)最低點(diǎn)5.37f0.03，4～8 d時(shí)呈緩慢上升趨勢(shì)，8 d時(shí)上升至5.50f0.04。整體下降幅度大于上升幅度。無(wú)氧條件下，機(jī)體通過(guò)無(wú)氧糖酵解產(chǎn)能的同時(shí)產(chǎn)生乳酸；此外，宰后ATP水解產(chǎn)生磷酸，這些酸性物質(zhì)長(zhǎng)期積累并無(wú)法分解與轉(zhuǎn)運(yùn)，使得肌肉組織的pH值迅速下降。

圖2 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏期間pH值的變化Fig.2 Changes in pH in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle with storage time

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析及關(guān)鍵蛋白質(zhì)篩選結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中采用4D-LFQ對(duì)貯藏0、4、8 d的樣品蛋白質(zhì)豐富度變化進(jìn)行定量分析，利用Maxquant（v1.6.6.0）軟件對(duì)所得的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜檢索，共檢索確定蛋白1 149個(gè)，設(shè)置1.200 倍為差異顯著倍數(shù)，共篩選出120個(gè)差異顯著的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步確定數(shù)據(jù)的可信度，對(duì)差異蛋白進(jìn)行了聚類分析與主成分分析。

秦川牛背最長(zhǎng)肌差異蛋白豐富度層次聚類分析如圖3A所示，各組的3個(gè)平行樣品均可聚為一類，說(shuō)明樣品重復(fù)性較好，且不同貯藏時(shí)間樣品差異明顯；同時(shí)，4、8 d的樣品距離更近，與0 d樣品相區(qū)分。差異蛋白的主成分分析結(jié)果如圖3B所示，PC1、PC2的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到72.23%，因此這兩個(gè)主成分可較好地代表差異蛋白表達(dá)的信息。PC1能將0 d與其他樣品區(qū)分開(kāi)，PC2能將4 d與8 d樣品區(qū)分開(kāi)。綜上可判斷，秦川牛背最長(zhǎng)肌差異蛋白0、4、8 d樣品重復(fù)性較好且有顯著差異，具有一定代表性和可信度。

圖3 秦川牛肉背最長(zhǎng)肌差異蛋白整體數(shù)據(jù)分析結(jié)果Fig.3 Analysis of differential proteins between longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle stored for different periods

采用SPSS 25軟件對(duì)差異蛋白表達(dá)量與剪切力進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，篩選出與嫩度變化相關(guān)的11種差異蛋白，如表2所示。

表2 秦川牛背最長(zhǎng)肌與嫩度相關(guān)的差異蛋白Table 2 Differential proteins related to beef tenderness in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle

2.5 差異蛋白GO注釋結(jié)果

對(duì)秦川牛肉背最長(zhǎng)肌篩選出的差異蛋白進(jìn)行GO分析后，所涉及到的生物過(guò)程與細(xì)胞組分前10的條目情況如圖4所示，生物過(guò)程主要集中在氧化還原過(guò)程（ATP5F1D、NDUFA6、NDUFB5、SUCLA2）、線粒體組織（ATP5F1D、NDUFA6、NDUFB5）、NADH脫氫酶符合體組裝（NDUFA6、NDUFB5）、細(xì)胞呼吸（ATP5F1D、SUCLA2）等過(guò)程；細(xì)胞組分主要集中在催化復(fù)合物（NDUFA6、PPP3R1、NDUFB5、HNRNPK、PSMD13）、線粒體蛋白質(zhì)復(fù)合物（ATP5F1D、NDUFA6、NDUFB5、ATP5F1C）、細(xì)胞器內(nèi)膜（ATP5F1D、NDUFA6、NDUFB5、ATP5F1C）、肌纖維膜（PPP3R1、CAMK2D）等。

圖4 秦川牛肉背最長(zhǎng)肌差異蛋白GO分析結(jié)果Fig.4 Gene ontology (GO) analysis of differential proteins in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle

2.6 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖5是利用Cytoscape 3.6.1軟件和String 10.0數(shù)據(jù)庫(kù)制作的差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。此網(wǎng)絡(luò)圖聚類系數(shù)為0.691，蛋白質(zhì)相互作用富集值為1.39h10。如圖5所示，ATP5D、ATP5C1、SUCLA2、SUCLG1、NDUFB5、NDUFA6的相互作用較為強(qiáng)烈，通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)在氧化還原過(guò)程，線粒體組織條目有較密切互作關(guān)系，分析發(fā)現(xiàn)以上6種蛋白質(zhì)組成的集團(tuán)均參與調(diào)解宰后能量代謝，最終通過(guò)ATP含量和pH值變化影響嫩度變化；CAMK2D與PPP3R1的相關(guān)作用較為強(qiáng)烈，分析發(fā)現(xiàn)兩者具有協(xié)同關(guān)系，共同參與細(xì)胞凋亡，促進(jìn)MFI的增大，肌原纖維受到破壞，最終使得嫩度降低；CTSD、HNRNPK、PSMD13暫未與其他蛋白發(fā)現(xiàn)相互作用。

圖5 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Interaction network between differential proteins

2.7 pH值、能量物質(zhì)含量及相關(guān)差異蛋白對(duì)嫩度的影響

利用SPSS 25軟件對(duì)表2中11種蛋白質(zhì)的表達(dá)量與能量物質(zhì)含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，篩選出6種與能量變化相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，結(jié)果如表3所示，它們分別為ATP5F1D、ATP5F1C、NDUFA6、NDUFA6、SUCLA2、SUCG1。

表3 差異蛋白質(zhì)表達(dá)量與能量物質(zhì)含量的相關(guān)性Table 3 Correlation between expression of differential proteins and energy substance contents

表2中ATP5F1D是ATP合酶的亞基δ，ATP5F1C是ATP合酶亞基γ，這兩種蛋白質(zhì)參與ATP合成酶的組裝，是ATP合酶5個(gè)亞基中的2個(gè)，對(duì)ATP合酶催化活性有重要作用，承擔(dān)著離子傳遞的作用。ATP含量合酶參與ATP的合成與消耗，所以ATP合酶直接影響機(jī)體細(xì)胞的供能和耗能，其表達(dá)量也會(huì)直接反映細(xì)胞中能量需求情況和三羧酸循環(huán)產(chǎn)能的情況。由表3可知，ATP5F1D、ATP5F1C表達(dá)量與能量基礎(chǔ)物質(zhì)ATP含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）。表2中NDUFA6為NADH脫氫酶的附件亞基。NADH脫氫酶參與線粒體內(nèi)膜上的呼吸作用，對(duì)電子從NADH傳遞給輔酶Q有催化作用，NDUFA6表達(dá)量與能量基礎(chǔ)物質(zhì)ATP含量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與NADH含量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）。ATP5F1D和NDUFA6在0～4 d的貯藏過(guò)程中均有高水平的表達(dá)，ATP5F1D上調(diào)1.819 倍，NDUFA6上調(diào)1.467 倍。兩者均是糖酵解過(guò)程中關(guān)鍵酶的組件，其高水平的表達(dá)說(shuō)明機(jī)體細(xì)胞在切斷氧氣供應(yīng)時(shí)，能提高參與產(chǎn)能的酶含量，利用無(wú)氧糖酵解過(guò)程產(chǎn)能，在此過(guò)程中大量產(chǎn)生乳酸，使得肌肉pH值下降。

琥珀酰輔酶A合成酶在檸檬酸循環(huán)中發(fā)揮作用，在琥珀酸硫激酶的催化下，琥珀酰輔酶A高能鍵水解生成琥珀酸，同時(shí)使GDP磷酸化生成GTP，GTP再與ADP作用生成ATP。表2中SUCLA2作為琥珀酸-CoA連接酶[ADP形成]亞基β，提供酶的核苷酸特異性，并與底物琥珀酸結(jié)合，而輔酶A和磷酸的結(jié)合位點(diǎn)在α亞基。而篩選出SUCG1就是琥珀酸-CoA連接酶[ADP形成]亞基α。通過(guò)表3也可以看出，SUCLA2的表達(dá)量與ATP、NADH含量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），與ADP、AMP顯著正相關(guān)（＜0.05）；SUCG1表達(dá)量與ATP含量呈含量顯著正相關(guān)（＜0.05）。表2中NDUFB5與NDUFA6同為NADH脫氫酶的附件亞基，在磷酸氧化過(guò)程中有著同等作用，從表3中也可以看出NDUFB5的表達(dá)量與ATP、NADH含量均呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。從表2可以看出，SUCLA2的表達(dá)量在0～8 d調(diào)整0.762 倍，NDUFB5的表達(dá)量在4～8 d調(diào)整0.497 倍，SUCG1的表達(dá)量在4～8 d調(diào)整0.742 倍。SUCLA2、NDUFB5、NDUFA6是在三羧酸循環(huán)、呼吸電子鏈傳遞、通過(guò)化學(xué)滲透耦合進(jìn)行ATP合成、解偶聯(lián)蛋白質(zhì)中起關(guān)鍵作用的蛋白，在4～8 d的貯藏期內(nèi)均有下調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明無(wú)氧糖酵解過(guò)程可能會(huì)受到抑制，能量和乳酸的生成量相應(yīng)減少。

秦川牛屠宰后血液流動(dòng)停止，肌肉細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)以上蛋白表達(dá)量，啟動(dòng)糖酵解過(guò)程產(chǎn)能，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，0～4 d時(shí)秦川牛肉的ATP的含量減少至（1.20f0.45）μmol/g，為初始狀態(tài)的11.82%，在能量物質(zhì)ATP下降到宰前初始含量的20%以下時(shí)，肌纖維發(fā)生交聯(lián)，肌肉會(huì)出現(xiàn)僵直現(xiàn)象，由圖1可知，在0～4 d貯藏期秦川牛肉剪切力也隨之上升，4 d后能量物質(zhì)含量下降速率有所減慢，對(duì)肌肉收縮的影響可能會(huì)減小。無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生能量的同時(shí)產(chǎn)生乳酸；此外宰后ATP水解產(chǎn)生磷酸，這些酸性物質(zhì)，使得肌肉組織的pH值迅速下降。4 d時(shí)pH值為5.37f0.03，低pH值改變了質(zhì)子的穩(wěn)態(tài)，降低了肌原纖維蛋白之間的靜電斥力，導(dǎo)致肌肉纖維不可逆?zhèn)认蚴湛s（肌節(jié)延伸），使得肉嫩度變差；低pH值使纖維蛋白暴露出更多水解位點(diǎn)，有助于水解酶的水解作用；低pH值會(huì)降低溶酶體膜的穩(wěn)定性，使得肌肉細(xì)胞釋放內(nèi)源水解酶，同時(shí)pH值的降低會(huì)使肌肉細(xì)胞處于酸性環(huán)境，打破細(xì)胞中的離子平衡，促進(jìn)鈣離子的釋放，Ca濃度的提高會(huì)激活鈣蛋白酶，降解纖維蛋白，促使嫩度升高，但pH值的降低也會(huì)使得-鈣激活酶發(fā)生自溶現(xiàn)象，降低酶活性，降低肌原纖維蛋白的水解速率；也有研究表明pH值小于5.8時(shí)，組織酶D對(duì)水解鴕鳥(niǎo)纖維有促進(jìn)作用，由此可判斷pH值會(huì)影響到內(nèi)源酶的催化活性，對(duì)肌原纖維蛋白的降解速率產(chǎn)生一定影響。通過(guò)圖6也可以看出，剪切力和ATP含量、pH值均呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。綜上可推測(cè)，0～4 d能量物質(zhì)含量的減少和pH值的降低會(huì)使得肌肉的僵直，肌肉嫩度降低，4～8 d能量物質(zhì)含量變化較小，對(duì)肌肉的影響也會(huì)相應(yīng)降低，長(zhǎng)期低pH值下的各種途徑綜合作用對(duì)嫩度提高的速率和嫩度提高的程度均有影響。

圖6 秦川牛背最長(zhǎng)肌能量物質(zhì)含量、pH值和剪切力之間的相關(guān)系數(shù)Fig.6 Correlation coefficients between energy substance contents, pH and shear force

2.8 與MFI相關(guān)的差異蛋白對(duì)宰后秦川牛肉嫩度變化的影響

秦川牛肉在貯藏過(guò)程中MFI變化情況如圖7所示，在整個(gè)貯藏過(guò)程中MFI呈顯著上升趨勢(shì)（＜0.05），由0 d時(shí)28.50f5.1持續(xù)增長(zhǎng)至8 d時(shí)的99.98f1.20，變化了250.81%。此結(jié)果與李升升對(duì)牦牛平滑肌嫩度形成機(jī)理研究中的MFI增加趨勢(shì)一致。

圖7 秦川牛背最長(zhǎng)肌不同貯藏時(shí)間MFI變化情況Fig.7 Changes in MFI of longissimus muscle of Qinchuan cattle with storage time

利用SPSS 25軟件將表2中11種與嫩度相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量與與MFI進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選出5種（CTSD、PSMD13、PPP3R1、CAMK2D、HNRNPK）與MFI有關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，相關(guān)性分析結(jié)果如表4所示。

表4 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏期間剪切力、MFI與差異蛋白含量相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients between shear force, MFI and differential protein contents

CTSD為組織蛋白酶D，位于溶酶體，pH值降低等因素會(huì)影響溶酶體膜穩(wěn)定性，使得CTSD被釋放，后經(jīng)過(guò)ADAM30D切割后可激活活性，在蛋白質(zhì)的降解與細(xì)胞凋亡中起作用，CTSD在0～8 d中的表達(dá)量上調(diào)1.303 倍（表2），CTSD表達(dá)量與剪切力呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與MFI呈顯著正相關(guān)（＜0.05），CTSD的高表達(dá)可能會(huì)出現(xiàn)肌肉細(xì)胞更高水平的自噬。PSMD13是26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基13，26S蛋白酶體非ATP酶可以去除可能損害細(xì)胞功能的錯(cuò)誤折疊或受損的蛋白質(zhì)，還可以通過(guò)去除不再需要的功能蛋白質(zhì)，維持蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡，同時(shí)參與細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，PDMD13在0～8 d中上調(diào)1.336 倍（表2），PSMD13表達(dá)量與剪切力呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與MFI呈顯著正相關(guān)（＜0.05），PSMD13表達(dá)量發(fā)生變化會(huì)影響到細(xì)胞凋亡和受損蛋白質(zhì)去除。HNRNPK是與mRNA結(jié)合的主要蛋白質(zhì)，可能在核內(nèi)不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）的核代謝中通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活和抑制發(fā)揮作用，在糖基化中起促進(jìn)作用，作為抑癌基因/的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，在/和/誘導(dǎo)中起作用；在轉(zhuǎn)錄抑制方面，它通過(guò)與/誘導(dǎo)的非編碼RNA（-）相互作用發(fā)揮作用，這種相互作用是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所發(fā)生的，HNRNPK在0～8 d調(diào)整0.722 倍（表2），HNRNPK表達(dá)量與剪切力呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與MFI呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），HNRNPK在貯藏期內(nèi)的異常表達(dá)，會(huì)直接影響到肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。

研究中發(fā)現(xiàn)了兩種關(guān)鍵蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中具有協(xié)同作用。PPP3R1是鈣調(diào)磷酸酶B亞基1型，是一種鈣調(diào)節(jié)蛋白刺激的蛋白磷酸酶，提供細(xì)胞對(duì)Ca的敏感性，在4～8 d上調(diào)1.309 倍，提高了細(xì)胞對(duì)鈣離子的敏感性。CAMK2D是鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II型亞基δ，CAMK2D通過(guò)靶向鈣離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與細(xì)胞鈣離子內(nèi)流、肌漿網(wǎng)鈣釋放、肌漿網(wǎng)鈣攝取，影響細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)和興奮收縮偶聯(lián)的調(diào)節(jié)，CAMK2D表達(dá)量在4～8 d上調(diào)1.506 倍。由表4可以看出，PPP3R1表達(dá)量與剪切力呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與MFI呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）；CAMK2D表達(dá)量與剪切力呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與MFI呈顯著正相關(guān)（＜0.05）。初步判斷PPP3R1和CAMK2D在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中具有協(xié)同作用，CAMK2D促進(jìn)細(xì)胞對(duì)Ca的吸收，提高細(xì)胞中Ca的濃度；PPP3R1可提高細(xì)胞對(duì)鈣離子的敏感性，Ca超負(fù)荷的積累是觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素，這兩種蛋白同時(shí)在4～8 d時(shí)高表達(dá)，共同作用促使細(xì)胞凋亡進(jìn)程的發(fā)生，降低肌原纖維結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，使得嫩度提高。

MFI可直接反映肌纖維的降解程度，增大原因是由于Z線蛋白的降解和肌原纖維細(xì)胞凋亡。宰后無(wú)氧糖酵解導(dǎo)致pH值降低，使得細(xì)胞離子失衡，鈣離子濃度升高；降低溶酶體膜與細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，釋放并激活內(nèi)源酶，CTSD、PSMD13、PPP3R1、CAMK2D、HNRNPK 5種參與細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)水解的蛋白豐富度發(fā)生了改變，加快了肌原纖維蛋白的水解與細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促使MFI升高了250.81%，降低了肌原纖維骨架強(qiáng)度，使得秦川牛背最長(zhǎng)肌嫩度升高。

2.9 能量物質(zhì)、pH值、MFI對(duì)秦川牛肉背最長(zhǎng)肌嫩度變化不同時(shí)間段產(chǎn)生影響的分析

秦川牛宰后能量和pH值變化較為迅速，對(duì)肌纖維收縮的影響較早，0～4 d時(shí)肌肉僵直對(duì)嫩度變化影響較大，4～8 d時(shí)隨著能量物質(zhì)趨于穩(wěn)定，對(duì)肌肉收縮的影響減小，對(duì)肌肉嫩度的影響也會(huì)隨之降低。低pH值與5種參與細(xì)胞凋亡有關(guān)的內(nèi)源酶相互作用使得MFI升高，是長(zhǎng)期積累的過(guò)程，當(dāng)MFI升高到一定程度，肌原纖維骨架強(qiáng)度顯著降低時(shí)，才會(huì)使得肌肉嫩度升高，由圖1剪切力數(shù)據(jù)可以看出MFI作用主要集中在4～8 d時(shí)，所以MFI作用具有滯后性。

3 結(jié) 論

秦川牛肉在貯藏過(guò)程中6種蛋白（ATP5F1D、ATP5F1C、NDUFB5、NDUFA6、SUCLA2、SUCG1）通過(guò)呼吸電子鏈傳遞、通過(guò)化學(xué)滲透耦合進(jìn)行ATP合成、解偶聯(lián)蛋白質(zhì)等途徑影響宰后糖酵解過(guò)程，ATP含量降至初始狀態(tài)（0 d）的11.82%，引起肌纖維發(fā)生交聯(lián)，肌肉會(huì)出現(xiàn)僵直，造成肌肉剪切力增大，嫩度下降。能量物質(zhì)含量宰后變化較快且后期穩(wěn)定，所以對(duì)肌肉嫩度影響主要集中在0～4 d時(shí)。宰后酸性物質(zhì)的積累造成肌肉pH值下降，導(dǎo)致肌原纖維蛋白之間的靜電斥力減小，影響了肌肉收縮；參與細(xì)胞鈣離子濃度、促使肌原纖維受體暴露、調(diào)節(jié)內(nèi)源酶活性等過(guò)程使得嫩度升高。5種蛋白（PPP3R1、CAMK2D、HNRNPK、PSMD13、CTSD）通過(guò)肌纖維膜、膜蛋白復(fù)合物、細(xì)胞器內(nèi)膜、鈣信號(hào)通路調(diào)控肌纖維細(xì)胞的凋亡和蛋白的水解，造成肌原纖維結(jié)構(gòu)被破壞，使得MFI逐漸升高，肌原纖維骨架強(qiáng)度降低，促使肌肉嫩度升高。長(zhǎng)期低pH值和5種與細(xì)胞凋亡和蛋白水解有關(guān)的內(nèi)源酶相互作用下的MFI升高是逐漸積累的過(guò)程，作用時(shí)間滯后，從剪切力數(shù)據(jù)可以看出，MFI途徑對(duì)嫩度降低的影響主要集中在4 d后。