柳康靜，宋玉昆，王海濤，喬鳳至，侯 率，譚明乾*

（大連工業(yè)大學食品學院，食品交叉科學研究院，國家海洋食品工程技術研究中心，海洋食品精深加工協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

納米粒子具有較小的體積、較高的比表面積，被廣泛應用于食品安全評價、食品加工、食品包裝和營養(yǎng)輸送等各個領域。納米粒子可以通過皮膚、呼吸道和胃腸道進入富含生物大分子的組織液、淋巴和血液中，因此它們不可避免地會與體液內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類、多糖等生物大分子發(fā)生相互作用。

烤牛肉味道鮮美，深受人們喜愛。研究人員在烤牛肉中發(fā)現(xiàn)了由加工誘導產(chǎn)生的內(nèi)源性碳點（carbon dots，CDs）?？九Ｈ獗皇秤煤?，其中的CDs首先在口腔中與唾液發(fā)生短暫的相互作用后，通過食道進入pH值為2～3的胃部，胃內(nèi)為強酸性環(huán)境，含有胃蛋白酶等消化酶，牛肉CDs的存在會與胃中的胃蛋白酶發(fā)生相互作用。隨后，CDs通過幽門括約肌進入pH值為6～7的小腸，同樣會與腸道胰蛋白酶發(fā)生相互作用。有研究表明外源性納米粒子可以與消化蛋白酶發(fā)生相互作用，進而影響酶活性，Sun Yujing等報道了納米二氧化鈦與胃蛋白酶在模擬胃液中的相互作用，隨著納米粒子濃度的增加，胃蛋白酶的固有熒光被猝滅，吸收峰減弱，表明二氧化鈦納米粒子可以與胃蛋白酶發(fā)生相互作用，導致芳香族氨基酸殘基微環(huán)境發(fā)生變化。Wang Yihui等的研究證明聚苯乙烯納米粒子可以與3種消化酶（胃蛋白酶、-淀粉酶和胰蛋白酶）發(fā)生相互作用，熱力學實驗結(jié)果顯示相互作用主要由范德華力和氫鍵驅(qū)動。然而，目前對于食品加工過程產(chǎn)生的內(nèi)源性納米粒子與消化蛋白酶的相互作用及其對人類健康的直接和間接影響仍然知之甚少。

本研究首先從280 ℃條件下的烤牛肉中分離出CDs，利用透射電子顯微鏡觀察CDs的形貌和粒徑，通過體外模擬消化實驗研究烤牛肉CDs進入模擬人體口腔、胃和小腸內(nèi)的消化過程；然后利用熒光光譜和同步熒光光譜探究烤牛肉CDs與消化酶之間相互作用的熒光猝滅機制，接著通過紫外-可見光譜和熒光壽命分析進一步驗證烤牛肉CDs與消化酶相互作用的熒光猝滅機制，再利用傅里葉變換紅外光譜、Zeta電位和熒光熱力學分析研究烤牛肉CDs與消化酶的作用方式；最后通過酶活力測定和酪蛋白水解度分析探究CDs對消化酶活性的影響，以期為闡明CDs與消化蛋白酶的結(jié)合機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉 大連甘井子區(qū)仟和農(nóng)貿(mào)市場；胃蛋白酶和胰蛋白酶 美國Sigma公司；人工唾液、胃液和小腸液上海源業(yè)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV230II半制備高效液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司；JEM-2100透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；J-1500圓二色光譜儀 日本分光株式會社；F-2700熒光分光光度計 日本日立有限公司；Lambda 35紫外-可見光譜儀、Frontier傅里葉變換紅外光譜儀美國珀金埃爾默股份有限公司；FLS980穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀 英國愛丁堡儀器公司；DT-1202納米激光粒度電位分析儀 美國分散科技公司。

1.3 方法

1.3.1 烤牛肉CDs的制備

烤牛肉中CDs的制備方法參考本課題組前期研究方法進行了改進。取新鮮牛肉500 g，切碎制成牛肉餅放入烤箱，280 ℃烘烤30 min，待烤牛肉降至室溫后，浸泡于1 000 mL乙醇中，利用磁力攪拌12 h，過濾除沉淀，濾液在60 ℃、60 r/min條件下蒸發(fā)除乙醇，再用50 mL超純水重溶。然后使用150 mL三氯甲烷充分振蕩，萃取3 次脫脂，收集上層水相部分10 000 r/min離心10 min后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至10 mL。濃縮液過0.22 μm的濾膜后使用半制備ODS-BP色譜柱純化，以10%甲醇-水溶液作為流動相，流速18 mL/min，熒光檢測器激發(fā)波長為380 nm，發(fā)射波長為400 nm，收集洗脫液，蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得到烤牛肉CDs粉末，于－20 ℃儲存?zhèn)溆?，采用透射電子顯微鏡對CDs的形貌和粒徑分布進行觀察和分析，加速電壓為60 kV，放大倍數(shù)為300 000 倍，通過Image J 軟件計算CDs粒徑。

1.3.2 體外模擬消化分析

參考本課題組前期報道，配制1h10mol/L烤牛肉CDs溶液，取3 mL樣品溶液加至3 mL人工唾液中，使用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，37 ℃恒溫水浴振蕩5 min，然后向樣品-唾液混合液中加入7.5 mL人工胃液，使用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0，37 ℃恒溫水浴振蕩2 h，最后向樣品-唾液-胃液混合液中加入11.25 mL人工小腸液，使用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，37 ℃恒溫水浴振蕩2 h。對照組向混合液中加同體積去離子水，分別測定上述各樣品組溶液熒光強度。熒光猝滅率按式（1）計算。

1.3.3 熒光光譜分析

分別配制1h10mol/L胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液，加入不同濃度的CDs溶液混合，使CDs的終濃度分別為0、2h10、4h10、6h10、8h10、10h10、12h10mol/L，在25 ℃、激發(fā)波長為280 nm的條件下進行熒光光譜掃描，測定消化蛋白酶的熒光強度。根據(jù)Stern-Volmer方程（式（2））計算相互作用的猝滅常數(shù)。

式中：和分別為無CDs和有CDs時消化蛋白酶的熒光強度；為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；[]為CDs的濃度/（mol/L）；為雙分子猝滅速率常數(shù)，生物分子的最大擴散速率常數(shù)為2h10mol/（Lgs）；為在無猝滅劑情況下消化蛋白酶的平均熒光壽命，取生物大分子的值，為10 ns。

1.3.4 同步熒光光譜分析

掃描激發(fā)波長為265～280 nm時斯托克斯位移（Δ）每移動15 nm對應的發(fā)射光譜，分析酪氨酸殘基所處微環(huán)境的變化，同樣掃描激發(fā)波長為220～280 nm時Δ每移動60 nm對應的發(fā)射光譜，考察色氨酸殘基所處微環(huán)境的變化。

1.3.5 紫外-可見吸收光譜分析

采用紫外-可見吸收光譜儀對溶液紫外-可見吸收光譜進行掃描，使用去離子水校零，掃描波段設置為200～700 nm。

1.3.6 熒光壽命分析

采用穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀對溶液熒光壽命進行測定，激光光源發(fā)射波長320 nm，使用多指數(shù)運算擬合并通過式（3）計算CDs的熒光壽命（）。

式中：τ為時間分辨衰變壽命/ns；A為τ的貢獻百分比/%。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

將溴化鉀（KBr）放入馬弗爐中加熱4 h（350 ℃），移至干燥皿中備用。稱取100 mg KBr于研缽中充分研磨，放入壓片機下壓3 min（20 MPa），掃描作為空白背景，取1 mg樣品粉末和100 mg KBr充分混合，重復上述操作壓片，掃描得到樣品傅里葉紅外光譜。

1.3.8 烤牛肉CDs與消化蛋白酶相互作用的Zeta電位分析

配制濃度為1h10mol/L的胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液，加入CDs使其終濃度分別為0、1h10、1h10、1h10mol/L和1h10mol/L，采用納米激光粒度電位分析儀對CDs與消化蛋白酶相互作用前后的Zeta電位進行測定。

1.3.9 烤牛肉CDs與消化蛋白酶相互作用的熱力學分析

采用式（4）計算結(jié)合常數(shù)（）和結(jié)合位點數(shù)（），截距代表lg，斜率代表。

式中：為CDs與消化蛋白酶相互作用的熒光強度；[]為CDs的濃度/（mol/L）。

若在研究溫度范圍內(nèi)焓變（Δ）保持不變，則根據(jù)范特霍夫方程（式（5））可以計算出焓變（Δ）和熵變（Δ）。

式中：為理想氣體常數(shù)/（J/（molgK））；為溫度/K。

通過Δ和Δ計算出不同溫度下樣品的吉布斯自由能（Δ）（式（6））。

1.3.10 烤牛肉CDs與消化蛋白酶相互作用的圓二色光譜分析

配制濃度為1h10mol/L的胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液，加入CDs使其終濃度分別為0、1h10、1h10、1h10mol/L，在室溫下記錄胃蛋白酶和胰蛋白酶的信號強度，通過Yang’s方程計算胃蛋白酶和胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)相對含量。

1.3.11 烤牛肉CDs與消化蛋白酶相互作用的酶活力分析

配制濃度為1h10mol/L的胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液，分別加入不同濃度CDs，使CDs終濃度分別為0（對照）、1h10、1h10、1h10mol/L和1h10mol/L，37 ℃水浴5 min，分別使用胃蛋白酶和胰蛋白酶活力試劑盒對酶活力進行測定。

1.3.12 烤牛肉CDs與消化蛋白酶相互作用對酪蛋白水解度的影響分析

消化蛋白酶與CDs相互作用對酪蛋白水解度的影響實驗參照Cao Xiaoqiong等的方法，以酪蛋白在體外消化過程中的水解度來評價消化蛋白酶與CDs相互作用對酶活力的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用平均值±標準差表示實驗數(shù)據(jù)，顯著性分析使用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析法進行（以＜0.05表示差異顯著），使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤牛肉CDs的形貌和粒徑

從280 ℃下烤制30 min的牛肉中分離純化出CDs，通過透射電子顯微鏡觀察CDs的形貌和粒徑，如圖1A所示，CDs呈球形，分散性良好，粒徑在1.5～4.0 nm范圍內(nèi)呈正態(tài)分布（圖1B），平均粒徑為（2.70±0.06）nm，與之前的研究結(jié)果相似。

圖1 CDs的透射電子顯微鏡圖像（A）和粒徑分布直方圖（B）Fig.1 Transmission electron microscope image of CDs (A) and size distribution of CDs (B)

2.2 烤牛肉CDs的體外模擬消化分析結(jié)果

烤牛肉被食用后，CDs會伴隨烤牛肉進入消化系統(tǒng)，因此探究烤牛肉CDs的消化過程對于闡明其在體內(nèi)的分布情況非常有意義。圖2A為模擬消化步驟示意圖，使用人工唾液、胃液和腸液分別模擬CDs進入人體后在口腔、胃和小腸內(nèi)的消化過程。如圖2B所示，向CDs溶液中加入人工唾液，37 ℃孵育5 min后，與對照組相比，熒光強度僅下降（0.36±0.65）%，說明唾液對CDs影響很小。繼續(xù)向混合液中加入人工胃液，調(diào)節(jié)pH值至2.0后37 ℃孵育2 h，此時酸性環(huán)境使唾液失活，CDs僅受人工胃液的影響，與對照組相比，熒光強度下降了（25.03±0.94）%，說明胃液對CDs的熒光強度有顯著的抑制作用。最后，加入人工腸液并調(diào)pH值至7.0后37 ℃孵育2 h，熒光強度下降了（6.29±0.46）%，熒光強度稍有恢復，可能是由pH值的變化或消化液對CDs表面官能團的消化作用引起的。Wang Yihui等對雪花啤酒中的CDs進行了體外模擬消化研究，結(jié)果顯示CDs的熒光強度在人工唾液中猝滅7.7%，胃液中猝滅65.2%，腸液中猝滅4.6%，消化后仍可見熒光信號。

圖2 CDs體外模擬消化過程的示意圖（A）和模擬唾液、胃液和腸液的消化過程對CDs熒光強度的影響（B）Fig.2 Schematic diagram of in vitro digestion procedure of CDs (A)and effect of simulated saliva juice, gastric juice and small intestinal juice on the fluorescence intensity of CDs (B)

2.3 烤牛肉CDs的熒光光譜分析結(jié)果

從上述體外模擬消化實驗結(jié)果可以看出，胃液和腸液對CDs的熒光強度影響最大，胃蛋白酶和胰蛋白酶是食物消化過程中不可或缺的消化蛋白酶，故對CDs與兩種蛋白酶的相互作用進行熒光光譜分析。如圖3A、C所示，向胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液中加入CDs后，胃蛋白酶和胰蛋白酶的固有熒光被猝滅，隨著CDs濃度的增加（0～12.0h10mol/L），二者的熒光強度呈現(xiàn)濃度依賴性降低；圖3B和圖3D分別為CDs對胃蛋白酶和胰蛋白酶的Stern-Volmer方程曲線，可見曲線存在較好的線性關系，說明在此條件下有且僅有一種猝滅機制。一般來說，分子間相互作用的熒光猝滅機制主要包括靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是由熒光團和猝滅劑之間相互作用形成非熒光基態(tài)絡合物所引起，動態(tài)猝滅則由激發(fā)態(tài)壽命期間熒光團與猝滅劑之間產(chǎn)生的碰撞所引起。通常情況下，一般認為當雙分子猝滅速率常數(shù)遠大于生物分子的最大擴散速率常數(shù)（2h10mol/（Lgs））時，即為靜態(tài)猝滅。通過計算得出CDs與胰蛋白酶和胃蛋白酶相互作用的雙分子猝滅速率常數(shù)分別為2.0h10mol/（Lgs）和1.99h10mol/（Lgs），大于生物分子的最大擴散速率常數(shù)，因此CDs與胰蛋白酶和胃蛋白酶之間相互作用的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。

圖3 CDs對胃蛋白酶（A）和胰蛋白酶（C）的熒光猝滅光譜圖以及對胃蛋白酶（B）和胰蛋白酶（D）的Stern-Volmer方程線性關系Fig.3 Fluorescence quenching spectra of pepsin (A) and trypsin (C) byCDs and Stern-Volmer curves of CDs versus pepsin (B) and trypsin (D)

2.4 烤牛肉CDs的同步熒光光譜分析結(jié)果

同步熒光光譜是一種通過控制激發(fā)波長和發(fā)射波長之間保持固定的波長間隔來探究熒光基團發(fā)色團周圍分子微環(huán)境變化的技術。胃蛋白酶和胰蛋白酶結(jié)構(gòu)中色氨酸和酪氨酸殘基是主要的內(nèi)在熒光團，圖4為不同濃度的CDs與胃蛋白酶、胰蛋白酶相互作用在固定波長間隔分別為Δ＝15 nm和Δ＝60 nm的同步熒光光譜。如圖4A、C所示，隨著CDs濃度的增加，胃蛋白酶和胰蛋白酶的熒光強度呈現(xiàn)濃度依賴性降低，發(fā)射峰位置未出現(xiàn)變化，說明CDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶的相互作用對色氨酸殘基周圍的微環(huán)境幾乎沒有影響；如圖4B和圖4D所示，隨著CDs濃度的增加，發(fā)射峰位置略有紅移，說明CDs的引入會使胃蛋白酶和胰蛋白酶酪氨酸殘基周圍的疏水性降低。結(jié)果與Sun Yujing等對食品級二氧化鈦納米粒子與胃蛋白酶在模擬胃液中相互作用的同步熒光光譜分析結(jié)果一致，二氧化鈦納米粒子的加入使胃蛋白酶熒光強度顯著降低，固定波長間隔為Δ＝60 nm時，最大發(fā)射波長從274 nm輕微移動到276 nm，酪氨酸殘基周圍的疏水性降低。

圖4 CDs對胃蛋白酶在Δλ＝60 nm（A）、Δλ＝15 nm（B）和胰蛋白酶Δλ＝60 nm（C）、Δλ＝15 nm（D）下同步熒光光譜的影響Fig.4 Effect of different concentrations of CDs on the synchronous fluorescence spectra of pepsin at Δλ = 60 nm (A) and Δλ = 15 nm (B), and trypsin at Δλ = 60 nm (C) and Δλ = 15 nm (D)

2.5 烤牛肉CDs的紫外-可見光譜和熒光壽命分析結(jié)果

如圖5A所示，胃蛋白酶-CDs復合物與胃蛋白酶吸收光譜不一致，無重疊，證明CDs與胃蛋白酶之間的猝滅方式為靜態(tài)猝滅，與Stern-Volmer方程得出的結(jié)論一致。在圖5B中可以觀察到同樣的結(jié)果，胰蛋白酶-CDs復合物與胰蛋白酶吸收光譜不一致，因此猝滅方式也為靜態(tài)猝滅。如圖5C和圖5D所示，采用時間分辨熒光光譜法測定胃蛋白酶、胃蛋白酶-CDs復合物、胰蛋白酶和胰蛋白酶-CDs復合物的熒光壽命，胃蛋白酶與CDs相互作用前后熒光壽命分別為3.95 ns和4.09 ns，胰蛋白酶與CDs相互作用前后熒光壽命分別為4.05和4.71 ns，熒光壽命變化不明顯，進一步證明CDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶相互作用的猝滅機制為靜態(tài)猝滅。

圖5 CDs與胃蛋白酶（A）和胰蛋白酶（B）相互作用的紫外-可見光譜圖以及與胃蛋白酶（C）和胰蛋白酶（D）相互作用的熒光壽命圖譜Fig.5 UV-Vis absorption spectra of pepsin (A) and trypsin (B)interacting with CDs, and fluorescence lifetime decay curves of pepsin (C)and trypsin (D) interacting with CDs

2.6 烤牛肉CDs的傅里葉變換紅外光譜和Zeta電位分析結(jié)果

圖6A和圖6B分別為CDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶相互作用的傅里葉變換紅外光譜圖，3 338～3 380 cm附近的吸收峰歸因于—OH或—NH伸縮振動，2 904～2 931 cm附近的吸收峰為—CH和—CH振動所引起，1 668 cm附近的峰是由酰胺I帶C＝O振動引起的，1 519 cm附近的峰歸因于酰胺II帶的NüH振動，酰胺III帶CüN基團吸收峰位于1 247～1 334 cm附近。在CDs與胃蛋白酶相互作用后，C＝O峰從1 785 cm移動到1 766 cm，CüN峰從1 247 cm移動1 230 cm，而CDs與胰蛋白酶相互作用在1 601 cm處出現(xiàn)了新的特征峰，吸收帶的轉(zhuǎn)移和新特征峰的出現(xiàn)說明CDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶相互作用是通過表面絡合吸附或靜電相互作用實現(xiàn)的。

通過監(jiān)測暴露于不同濃度CDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶相互作用后的Zeta電位變化可以確定二者相互作用后表面電荷的變化。如圖6C、D所示，隨著CDs濃度從0增加到1.0h10mol/L，胃蛋白酶體系的Zeta電位從（－13.39±0.29）mV增加到（－7.09±1.41）mV，胰蛋白酶體系的Zeta電位從（－12.44±0.58）mV增加到（－8.90±0.59）mV，實驗結(jié)果表明CDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶相互作用使Zeta電位增加，Gunawan等報道，表面電荷是影響蛋白質(zhì)與CDs結(jié)合的關鍵決定因素之一；因此，推測靜電相互作用參與了CDs與消化蛋白酶的結(jié)合。

圖6 CDs與胃蛋白酶（A）和胰蛋白酶（B）相互作用的傅里葉變換紅外光譜以及與胃蛋白酶（C）和胰蛋白酶（D）相互作用的Zeta電位Fig.6 FTIR spectra of pepsin (A) and trypsin (B) interacting with CDs and zeta potential of pepsin (C) and trypsin (D) interacting with CDs

2.7 烤牛肉CDs與消化蛋白酶相互作用的熱力學分析結(jié)果

圖7A和圖7B分別為烤牛肉CDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶相互作用相對熒光強度與CDs濃度的雙對數(shù)關系曲線，通過截距計算出結(jié)合常數(shù)（），斜率代表結(jié)合位點數(shù)（），圖7C和圖7D分別為通過的自然對數(shù)和溫度的倒數(shù)作出的范特霍夫曲線，其中通過斜率計算出相互作用中的焓變（Δ），通過截距計算出熵變（Δ），如表1和表2所示，通過計算可得出吉布斯自由能（Δ）。當溫度從298 K增加到318 K時，CDs與胃蛋白酶相互作用的從7.08h10L/mol增加至7.49h10L/mol，與胰蛋白酶相互作用的從1.59h10L/mol增加至7.18h10L/mol，說明溫度的升高有利于CDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶相互作用的穩(wěn)定性；胃蛋白酶體系下分別從0.83增加到1.06，胰蛋白酶體系下從0.69增加到1.03，說明隨著溫度的升高親和力逐漸增加，Δ和Δ均為正值，計算出Δ為負值，說明CDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶結(jié)合均主要由疏水相互作用介導的，這與Chakraborty等研究的血紅蛋白與碳量子點結(jié)合的驅(qū)動力結(jié)果一致，此外，研究表明熱加工三文魚的CDs與胃蛋白酶的相互作用中氫鍵為主要驅(qū)動力，與胰蛋白酶的相互作用主要由靜電和疏水相互作用介導?？梢酝茢?，相互作用的驅(qū)動力類型主要取決于CDs和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。

圖7 CDs與胃蛋白酶（A）和胰蛋白酶（B）相互作用的lg（（F0－F）/F）與lg[Q]之間的線性關系以及CDs與胃蛋白酶（C）和胰蛋白酶（D）相互作用的范特霍夫曲線-結(jié)合常數(shù)的自然對數(shù)與溫度倒數(shù)的線性關系Fig.7 Linear relationship between lg((F0?F)/F) and lg[Q] for interaction of pepsin (A) and trypsin (B) with CDs, and van’t Hoff plot of natural logarithm of equilibrium constant versus inverse temperature for interaction of pepsin (C) and trypsin (D) with CDs

表1 胃蛋白酶與CDs疏水相互作用熱力學參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters for interaction of trypsin with CDs

表2 胰蛋白酶與CDs疏水相互作用熱力學參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters for interaction of trypsin with CDs

2.8 烤牛肉CDs與消化蛋白酶相互作用的圓二色光譜分析結(jié)果

圓二色光譜法是一種研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法，研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化有利于更好地探究蛋白質(zhì)與生物分子相互作用。圖8A為不同濃度CDs對胃蛋白酶圓二色光譜的影響，胃蛋白酶在大約200 nm波長處存在強負峰，說明胃蛋白酶二級結(jié)構(gòu)中主要由-折疊構(gòu)象組成，以無序結(jié)構(gòu)為主。隨著CDs濃度的增加，出峰位置未發(fā)生變化，但圓二色光譜信號強度逐漸降低。使用分析軟件對胃蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)進行分析（圖8C），隨著CDs濃度的增加（1h10～1h??mol/L），-折疊相對含量從（51.20±1.84）%減小到（50.76±0.57）%，-轉(zhuǎn)角相對含量從（7.56±1.67）%增加到（8.60±1.37）%，這說明CDs與胃蛋白酶的結(jié)合會導致胃蛋白酶二級結(jié)構(gòu)的變化。圖8B為不同濃度CDs對胰蛋白酶圓二色光譜的影響，胰蛋白酶208 nm和222 nm波長處有兩個負峰，這是典型的-螺旋n-π*和π-π*結(jié)構(gòu)。隨著CDs濃度的增加（1h10～1h10mol/L），出峰位置出現(xiàn)略微紅移，圓二色光譜信號強度逐漸降低。使用分析軟件對胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)進行分析（圖8D），-螺旋相對含量從（13.70±1.01）%減小到（11.00±0.69）%，-折疊相對含量從（25.93±2.96）%增加到（31.83±0.46）%，-轉(zhuǎn)角相對含量從（19.63±1.73）%減小到（17.60±0.35）%，說明CDs與胰蛋白酶的結(jié)合會導致胰蛋白酶二級結(jié)構(gòu)的變化。Zhao Xingchen等研究表明，在與碳納米管相互作用時，-糜蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微的改變，-螺旋含量降低約3%，-折疊含量增加約7%。Wang Yihui等發(fā)現(xiàn)與淀粉納米粒子相互作用后，胃蛋白酶-折疊含量略有增加，淀粉納米粒子改變了胃蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)，導致肽的部分展開。

圖8 CDs與胃蛋白酶（A）和胰蛋白酶（B）相互作用的圓二色光譜圖以及胃蛋白酶（C）和胰蛋白酶（D）的α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角變化情況Fig.8 Circular dichroism spectra of pepsin (A) and trypsin (B)interacting with CDs and α-helix, β-sheet and β-turn of pepsin-CDs (C)and trypsin-CDs (D)

2.9 烤牛肉CDs與消化蛋白酶相互作用的酶活力分析結(jié)果

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化可能會使其生物活性和功能也隨之改變。以單一胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶活力作為對照，隨著CDs濃度從0增加到1.0h10mol/L，胃蛋白酶和胰蛋白酶的相對活力均呈現(xiàn)濃度依賴性減小，胃蛋白酶相對活力從100%降低到（61.11±7.36）%（圖9A），胰蛋白酶相對活力從100%降低到（51.28±3.62）%（圖9B），結(jié)果表明，CDs對胃蛋白酶和胰蛋白酶的活力均有一定影響，CDs濃度越大，影響越顯著。Sun Yujing等研究表明隨著二氧化鈦納米粒子濃度的增加，胃蛋白酶活性逐漸降低。Zhang Rui等發(fā)現(xiàn)炭黑與溶菌酶和超氧化物歧化酶相互作用可以改變酶的二級結(jié)構(gòu)，導致酶活性降低。綜上，CDs與消化蛋白酶相互作用后酶活力的降低與消化蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)改變相關。

圖9 不同濃度CDs對胃蛋白酶（A）和胰蛋白酶（B）相對活力的影響Fig.9 Activities of pepsin (A) and trypsin (B) in different concentrations of CDs

2.10 烤牛肉CDs與消化蛋白酶相互作用對酪蛋白水解度的影響

由圖10A可知，隨著時間的推移，酪蛋白在胃液中逐漸被水解，當在體系中加入CDs后，酪蛋白的水解度明顯減小，說明胃蛋白酶-CDs復合物的形成可以降低消化蛋白酶活力進而抑制酪蛋白的水解；從圖10B中也可以看出同樣的結(jié)果，說明胰蛋白酶-CDs復合物的形成同樣可以降低消化蛋白酶活力。人胃腸道中不同種類的消化蛋白酶對蛋白質(zhì)鏈中氨基酸之間的肽鍵具有不同的親和力，胃蛋白酶會裂解芳香氨基酸旁邊的肽鍵，而胰蛋白酶會裂解堿性氨基酸旁邊的鍵，因此，CDs與消化蛋白酶的相互作用可能改變了消化酶裂解相應鍵的性質(zhì)，從而改變了它們對酪蛋白水解的敏感性。

圖10 CDs對胃液（A）和腸液（B）中酪蛋白水解度的影響Fig.10 Influence of CDs on hydrolysis degree of casein in simulated gastric fluid (A) and small intestine fluid (B)

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，烤牛肉CDs以靜態(tài)猝滅的方式猝滅胃蛋白酶和胰蛋白酶的固有熒光，酪氨酸參與了二者的相互作用，紅外光譜和Zeta電位的分析結(jié)果進一步證明了二者的相互作用，CDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶結(jié)合方式均為靜電或疏水相互作用，并且結(jié)合后會影響其二級結(jié)構(gòu)，從而降低胃蛋白酶和胰蛋白酶的活力。探索CDs與蛋白質(zhì)的相互作用對于預測蛋白質(zhì)對CDs的吸附和CDs在胃腸道系統(tǒng)中的行為具有重要意義，本研究結(jié)果為內(nèi)源性CDs與消化蛋白酶相互作用提供了實驗依據(jù)，為評估CDs的安全性提供了參考。