鄭 滔, 謝曉玲, 鄧南翔, 車 通, 舒 兵*

(1. 廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006; 2. 廣東藥科大學(xué) 新藥研發(fā)中心, 廣東 廣州 510006)

G-四鏈體是由DNA鏈上連續(xù)富鳥嘌呤(G)序列形成的一種特殊的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)[1].越來(lái)越多的證據(jù)表明G-四鏈體參與多種重要的生物學(xué)過程,如端粒末端保護(hù)、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等,并且在細(xì)胞增殖、凋亡與衰老、腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中都扮演著重要的調(diào)控角色[2-4].生物信息學(xué)等研究表明,在染色體端粒末端、癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域以及mRNA的非翻譯區(qū)域等重要調(diào)控區(qū)域均存在大量可以形成G-四鏈體的潛在序列[5].

然而,現(xiàn)階段對(duì)G-四鏈體的研究只涉及到較少的基因序列,仍有大量G-四鏈體潛在形成序列有待實(shí)驗(yàn)證明[5].而且,G-四鏈體在細(xì)胞內(nèi)的形成過程、小分子靶向G-四鏈體之后下調(diào)癌基因的表達(dá)等方面仍然缺乏最直接的證據(jù)[6].這也是目前靶向G-四鏈體的藥物設(shè)計(jì)與開發(fā)一直未得到眾多科學(xué)家認(rèn)同的重要原因.因此,開發(fā)能夠?qū)-四鏈體結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速確證的方法和工具顯得尤為重要.

多取代咪唑作為發(fā)色團(tuán)主要應(yīng)用于有機(jī)光電二極管、有機(jī)光電管、半導(dǎo)體等領(lǐng)域[7].Chen等[8-9]發(fā)現(xiàn)在咪唑環(huán)的2位引入香豆素或者萘二甲酰胺熒光基團(tuán)分別得到化合物TSIZ01和IZNP-1(圖1),可以增加化合物對(duì)G-四鏈體的熒光識(shí)別作用.為獲得結(jié)構(gòu)多樣性的靶向G-四鏈體的熒光探針分子,本文擬以多芳基咪唑的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),通過結(jié)構(gòu)修飾以期得到結(jié)構(gòu)新穎且識(shí)別G-四鏈體的目標(biāo)化合物.有研究表明,在咪唑的1位引入較大的芳香結(jié)構(gòu),可以增加化合物對(duì)G-四鏈體的π-π堆積作用和熒光識(shí)別作用[10-11].為此,本研究在上述文獻(xiàn)的工作基礎(chǔ)上,通過在咪唑的1位引入具有芳香熒光性咔唑基團(tuán),設(shè)計(jì)得到新型多芳基咪唑類化合物CPD(圖1).采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定了CPD的紫外光譜,采用熒光光譜儀和分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了CPD與G-四鏈體相互作用的熒光性能和相互作用模式.

圖1 化合物TSIZ01、IZNP-1和CPD的結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南鞏義宇華有限公司);Fluoromax-4熒光光譜儀(賽默飛世爾科技公司);UV-2600紫外可見分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技公司);Advance Bruker 400M超導(dǎo)核磁共振波譜儀(瑞士BRUKER公司);Thermo超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技公司).4-氟苯甲醛、維生素B1(VB1)、三氯化鐵、N-甲基哌嗪、4-二甲氨基苯甲醛、3-氨基-9-乙基-9H-咔唑、NaOH、乙醇、醋酸、醋酸銨等均為分析純,無(wú)需進(jìn)一步處理.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程以4-氟苯甲醛為起始原料,在VB1/NaOH催化體系中發(fā)生安息香縮合反應(yīng)得到1,2-雙(4-氟苯基)-2-羥基乙酮(2).中間體2經(jīng)過三氯化鐵氧化得到羥基氧化產(chǎn)物2,2-雙(4-氟苯基)乙二酮(3).之后3與N-甲基哌嗪發(fā)生親核反應(yīng)得到2,2-雙(4-甲基哌嗪基苯基)乙二酮(4).N-甲基哌嗪的相對(duì)于化合物3的量大大過量,主要是為了使得化合物3能夠徹底反應(yīng)完全.最后,中間體4與4-二甲氨基苯甲醛、3-氨基-9-乙基-9H-咔唑在醋酸/醋酸銨體系中發(fā)生Debus-Radziszewski咪唑合成反應(yīng)得到了多芳基取代咪唑CPD(圖2).目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR和HRMS等方法確證.

圖2 化合物CPD的合成路線

1.2.11,2-雙(4-氟苯基)-2-羥基乙酮(2)的合成稱取3.6 g(0.01 mmol)維生素B1于250 mL燒瓶中,加入30.0 mL體積濃度95%乙醇,攪拌5 min,滴加5.0 mL質(zhì)量濃度10% NaOH溶液,攪拌20 min后,滴加10 g(0.08 mol)4-氟苯甲醛,滴加完畢后,保持pH=8～9,回流1 h.反應(yīng)畢,放冷至室溫,旋干溶劑,加入50 mL乙酸乙酯和20 mL水?dāng)嚢?分液,水層加乙酸乙酯(20 mL×3)萃取,合并有機(jī)相,用飽和食鹽水(100 mL×3)洗滌,無(wú)水硫酸鈉干燥后過濾,濾液減壓蒸除溶劑,硅膠柱層析(洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/6),共得到1,2-雙(4-氟苯基)-2-羥基乙酮(2),白色固體6.2 g,收率62%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.19～8.07(m,2H),7.47～7.28(m,4H),7.25～7.12(m,2H),6.16(s,1H).

1.2.22,2-雙(4-氟苯基)乙二酮(3)的合成 稱取5 g(20.16 mmol)中間體2于反應(yīng)瓶中,加入15 mL冰醋酸,5 mL水,8.6 g(53.0 mmol)三氯化鐵,反應(yīng)液于110 ℃油浴中加熱1 h后,停止反應(yīng),加入30 mL乙酸乙酯和20 mL水?dāng)嚢?分液,水層加乙酸乙酯(3×10 mL)萃取,合并有機(jī)層,飽和食鹽水(2×30 mL)洗滌,無(wú)水硫酸鈉干燥,過濾,旋干溶劑,硅膠柱層析(洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/32),共得到2,2-雙(4-氟苯基)乙二酮(3),白色固體4.1 g,收率83%,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.79～7.71(m,4H),7.53～7.43(m,4H).

1.2.32,2-雙(4-甲基哌嗪基苯基)乙二酮(4)的合成 稱取3 g(12.19 mmol)中間體3于反應(yīng)瓶中,加入30 mL DMSO,攪拌溶解后加入2.0 g(14.63 mmol)碳酸鉀和2.9 g(29.26 mmol)N-甲基哌嗪,反應(yīng)液于80 ℃油浴中加熱4 h.反應(yīng)畢,將體系放冷至室溫,加入50 ml乙酸乙酯,攪拌5 min后,將混合液倒入200 mL冰水中,攪拌5 min后分液,水層加乙酸乙酯(2×30 mL)萃取,合并有機(jī)層,加飽和食鹽水(2×30 mL)洗滌,無(wú)水硫酸鈉干燥,過濾,旋干溶劑,硅膠柱層析(洗脫劑：V(甲醇)/V(二氯甲烷)=1/50,含體積分?jǐn)?shù)0.5%氨水),共得到2,2-雙(4-甲基哌嗪基苯基)乙二酮(4),黃色固體3.5 g,收率70%,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.79(d,J=9.0 Hz,4H),6.79(d,J=9.1 Hz,4H),3.41～3.32(m,8H),2.55～2.47(m,8H),2.30(s,6H).

1.2.41-(1-(9-乙基-9H-咔唑-3-基)-4,5-雙(4-(4-甲基哌嗪基-1基)-苯基)-2-(4-二甲胺基)苯基-1H-咪唑(CPD)的合成 稱取0.5 g(1.23 mmol)中間體4于反應(yīng)瓶中,加入220.1 mg(1.47 mmol)4-二甲胺基苯甲醛、516.6 mg(2.46 mmol)3-氨基-9-乙基-9H-咔唑和947 mg(12.3 mmol)醋酸銨,加入10 mL冰醋酸,反應(yīng)體系于120 ℃油浴中加熱8h.反應(yīng)畢,放冷至室溫,加入50 mL乙酸乙酯和50 mL冰水?dāng)嚢?0 min后,滴加飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH=9～10,分液,水層加乙酸乙酯(3×10 mL)萃取,合并有機(jī)層,飽和食鹽水(2×30 mL)洗滌,無(wú)水硫酸鈉干燥,過濾,旋干溶劑,硅膠柱層析(洗脫劑：V(甲醇)/V(二氯甲烷)=1/30,含體積分?jǐn)?shù)1%氨水),共得到終產(chǎn)物CPD,黃色固體331.7 mg,收率37%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.97(d,J=7.7 Hz,1H),7.86(d,J=1.8 Hz,1H),7.57(d,J=8.8 Hz,2H),7.50(t,J=7.6 Hz,1H),7.43(d,J=8.2 Hz,1H),7.33(d,J=8.9 Hz,2H),7.26(s,1H),7.22(t,J=7.4 Hz,1H),7.18(dd,J=8.6 Hz,1H),7.04(d,J=8.7 Hz,2H),6.86(d,J=8.8 Hz,2H),6.67(d,J=8.8 Hz,2H),6.49(d,J=9.0 Hz,2H),4.35(q,J=7.1 Hz,2H),3.23(t,J=9.7 Hz,4H),3.13(t,J=8.8 Hz,4H),2.86(s,6H),2.60(t,J=9.7 Hz,4H),2.51(t,J=8.8 Hz,4H),2.37(s,3H),2.31(s,3H),1.46(t,J=7.2 Hz,3H).13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ:149.84,149.80,149.39,147.55,140.46,139.02,137.18,131.96,130.02,129.65,129.45,128.17,126.97,126.36,126.18,122.91,122.62,122.16,120.85,120.77,119.09,119.06,115.71,115.17,111.64,108.75,108.49,55.15,55.03,49.01,48.33,46.13,46.08,40.21,37.79,13.91.HRMS(ESI;m/z).計(jì)算值C47H52N8,[M+H]+729.431 5,理論值729.434 1.

1.2.5紫外光譜實(shí)驗(yàn) 首先,配制含濃度100 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、pH為7.4的DNA緩沖溶液buffer.稱取定量CPD固體,用DMSO溶解,濃度標(biāo)定為10.0 mmol/L,于-80 ℃下保存.使用時(shí)用buffer稀釋.使用紫外光譜儀測(cè)定濃度3.0 μmol/LCPD的紫外光譜.

1.2.6熒光光譜實(shí)驗(yàn) 配制含有濃度1.0 μmol/LCPD的溶液,以最大紫外吸收波長(zhǎng)340 nm為激發(fā)波長(zhǎng),以360 nm為發(fā)射波長(zhǎng),收集在360～650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光光譜,然后加入DNA溶液,混勻靜置30 s后再繼續(xù)掃描光譜,得到化合物干預(yù)不同DNA的熒光光譜.所用到的DNA序列(5'～3')包括：G-四鏈體形成序列c-myc(TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG)、c-kit(GGGCGGGCGCGAG-GGAGGGG)、bcl-2(GGGCGGGCGCGGGAGGAAGG-GGGCGGG)、vegf(GGGGCGGGCCGGGGGCGGGG)、k-ras(AGGGCGGTGTGGGAAGAGGGAAGAGGGGGAGG)、pdgf-B(GCGGGGCAGGGAGGGTGGAC-GC)、c-myb(GGGCTGGGCTGGGCGGGG)、RET(GGGGCGGGGCGGGGCGGGGG).雙鏈序列有ds26(CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG);單鏈序列有ss26(GGTTGGTGTGGTTGG)、dT21(TTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTT).所有DNA序列在95 ℃下加熱5 min后緩慢冷卻退火,其中不同類型的富G序列可以形成不同構(gòu)象的G-四鏈體結(jié)構(gòu).

1.2.7分子對(duì)接實(shí)驗(yàn) 從蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)中獲取G-四鏈體的晶體結(jié)構(gòu)作為受體模型,在進(jìn)行分子對(duì)接之前我們?nèi)コ龁捂淒NA及非必需結(jié)晶水分子.使用Molecular Operating Environment 2019(MOE)分子對(duì)接軟件對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢查矯正,使用MOE2019自帶的程序包進(jìn)行計(jì)算,對(duì)獲得的30個(gè)CPD構(gòu)象結(jié)果進(jìn)行富集分析,并對(duì)CPD與G-四鏈體的結(jié)合力自由能進(jìn)行計(jì)算.

2 結(jié)果與討論

2.1 合成與表征在本合成路線中,將VB1/NaOH催化體系應(yīng)用于安息香縮合反應(yīng)的合成方法,相比于傳統(tǒng)的氰化物(如氰化鉀、氰化鈉等)催化法,具有原料易得、毒性很低、便于操作、重現(xiàn)性好、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn).目前已經(jīng)較為廣泛地應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)的學(xué)生實(shí)驗(yàn)中.在制備標(biāo)題化合物的過程中,中間體4與4-二甲氨基苯甲醛、3-氨基-9-乙基-9H-咔唑在醋酸/醋酸銨體系中發(fā)生Debus-Radziszewski咪唑合成反應(yīng)得到標(biāo)題化合物.多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),產(chǎn)率較低.為此,主要考察了物料比對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率的影響.優(yōu)化結(jié)果顯示：當(dāng)反應(yīng)條件為：n(4)∶n(4-二甲氨基苯甲醛)∶n(3-氨基-9-乙基-9H-咔唑)∶n(醋酸銨)=1∶1.2∶2.0∶10時(shí),能以較高的產(chǎn)率得到目標(biāo)化合物.

2.2 化合物CPD與G-四鏈體相互作用的熒光性能評(píng)價(jià)利用紫外光譜和熒光光譜研究了CPD與G-四鏈體DNA及其他類型DNA的相互作用.首先使用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定了CPD的紫外光譜(圖3(a)).發(fā)現(xiàn)CPD在340 nm有最大紫外吸收.將1.0當(dāng)量的DNA分別加入到1.0 μmol/L的CPD溶液中,以340 nm為激發(fā)波長(zhǎng),以360 nm為發(fā)射波長(zhǎng),收集在360～650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光光譜,結(jié)果如圖3(b)～(d)和表1所示.

圖3 化合物CPD與G-四鏈體相互作用

在CPD單獨(dú)存在的情況下,在440 nm處有較弱的發(fā)射,熒光響應(yīng)值為16 950.然而,加入c-myc、c-kit、bcl-2、vegf、k-ras、pdgf-B、c-myb、RET G-四鏈體后,CPD與G-四鏈體發(fā)生了一定的相互作用,表現(xiàn)在390～550 nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度發(fā)生了一定的變化,并且CPD對(duì)不同G-四鏈體的熒光響應(yīng)具有一定的差異性.具體表現(xiàn)為：加入bcl-2、c-kit、pdgf-B、vegf、c-myb、RET G-四鏈體DNA后,CPD在440 nm處的最大發(fā)射峰強(qiáng)度略有增加,熒光響應(yīng)值分別為41 860、41 550、37 320、34 600、33 550、33 460,增幅約為CPD熒光響應(yīng)強(qiáng)度的2～3倍,可能的原因是CPD與這幾類G-四鏈體發(fā)生較弱的相互作用,導(dǎo)致其對(duì)這幾類G-四鏈體的熒光響應(yīng)較差.而加入k-ras和c-myc G-四鏈體DNA后,同其他G-四鏈體相比,CPD在440 nm處的最大發(fā)射峰強(qiáng)度顯著增加,其熒光響應(yīng)強(qiáng)度分別為80 590(4.8倍)和154 920(9.1倍).尤其是加入c-myc G-四鏈體,其熒光強(qiáng)度的增幅明顯高于其他類似的G-四鏈體,表現(xiàn)出一定的CPD識(shí)別c-myc G-四鏈體構(gòu)象的選擇性.在同樣情況下,單鏈DNA(T21和ss26)、雙鏈DNA(ds26)均不能使CPD的熒光產(chǎn)生明顯的增強(qiáng)(在440 nm處的最大熒光強(qiáng)度分別為12 400、25 980和20 670).以上結(jié)果表明化合物CPD可以作為k-ras和c-myc G-四鏈體的熒光探針,特別是靶向識(shí)別c-myc G-四鏈體.

表 1 CPD與G-四鏈體的熒光響應(yīng)強(qiáng)度

2.3 化合物CPD與G-四鏈體相互作用模式研究為了研究CPD靶向識(shí)別G-四鏈體的作用模式,選擇以CPD可以靶向識(shí)別的c-myc G-四鏈體為典型案例,進(jìn)行了分子對(duì)接分析,探討CPD與G-四鏈體之間的相互作用模式,結(jié)果如圖4所示.結(jié)果顯示CPD的四芳基咪唑骨架較好地堆積在c-myc G-四鏈體的四分體平面上,與四分體中的鳥嘌呤殘基存在π-π相互作用,從而把CPD的咪唑環(huán)與熒光基團(tuán)鎖定在一個(gè)近平面上.結(jié)合能計(jì)算結(jié)果顯示,CPD與c-myc G-四鏈體的結(jié)合自由能達(dá)到了-21.3 kcal/mol,表明CPD能很好地與c-myc G-四鏈體結(jié)合.而其他2個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲,使得CPD的兩條甲基哌嗪側(cè)鏈能夠伸進(jìn)G-四鏈體溝槽內(nèi),并與其磷酸骨架的發(fā)生較強(qiáng)的靜電相互作用.最終導(dǎo)致CPD的分子構(gòu)象發(fā)生變化,因而發(fā)射出熒光.

圖4 CPD與c-myc G-四鏈體的分子對(duì)接結(jié)果(PDB:2l7v)

3 結(jié)論

以4-氟苯甲醛為起始原料,通過安息香縮合反應(yīng)、氧化反應(yīng)、親核反應(yīng)、Debus-Radziszewski咪唑合成反應(yīng)等步驟合成得到了未見文獻(xiàn)報(bào)道的四芳基取代咪唑CPD.1H NMR、13C NMR、HRMS等確證其結(jié)構(gòu).熒光光譜實(shí)驗(yàn)研究表明CPD對(duì)部分G-四鏈體具有一定的熒光識(shí)別作用,特別是可以識(shí)別c-myc G-四鏈體,并表現(xiàn)出較好的選擇性,值得深入研究其作用機(jī)制.分子對(duì)接結(jié)果表明CPD的四芳基咪唑骨架能堆積在G-四分體上,導(dǎo)致原有的分子構(gòu)象發(fā)生變化,因而發(fā)射出熒光.在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),由于融合了較強(qiáng)的熒光基團(tuán),導(dǎo)致探針分子自身帶有一定的熒光響應(yīng),這勢(shì)必影響探針分子的靶向性,值得進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化,為新型靶向G-四鏈體的熒光探針的發(fā)現(xiàn)提供了思路.

致謝廣東省中藥局科研項(xiàng)目(20212117)和大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(202010573010)對(duì)本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意.