王歡歡，劉 靜，張靖菊，徐 飛

(國(guó)家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081)

乳酸是一種天然的有機(jī)酸，是重要的抗菌化合物[1]，屬于消毒防腐類藥，是公認(rèn)安全的GRAS(Generally recognized as safe，GRAS)添加劑[2]，廣泛應(yīng)用于飲食業(yè)、化妝品業(yè)、醫(yī)藥業(yè)和畜牧業(yè)等行業(yè)中[3]。乳酸主要有三種構(gòu)型[4]，分為D型、L型和DL型，由于D-乳酸、DL-乳酸對(duì)人體有一定的毒副作用，所以與飲食業(yè)相關(guān)的乳酸構(gòu)型為L(zhǎng)型。乳酸能抑制真菌的生長(zhǎng)[5]，有助于農(nóng)副產(chǎn)品的保存。有研究表明[6-8]，乳酸對(duì)部分革蘭氏陽(yáng)性菌、部分革蘭氏陰性菌和部分真菌都有殺滅和抑制作用，其對(duì)致病菌主要是通過(guò)延長(zhǎng)代時(shí)和破壞正常細(xì)胞膜電位來(lái)達(dá)到抑菌及殺菌作用[9]。乳酸作為原料藥收錄于2020版《中國(guó)藥典》中[10]，與水溶液顯酸性，含量測(cè)定方法為滴定法，范圍為85%～92%(g/g)。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的乳酸的含量測(cè)定方法有高效液相色譜法[11]、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[12]、離子色譜法[13]、氣相色譜法[14]等。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、離子色譜法和氣相色譜法測(cè)定乳酸均具有局限性，與高效液相色譜法相比操作復(fù)雜且成本較高。乳酸具有熱不穩(wěn)定性，在高溫下易分解[15]，用氣相色譜法測(cè)定時(shí)，需將極性強(qiáng)的乳酸衍生化為極性弱的酯化物[16]，處理過(guò)程較為復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)。本文擬建立HPLC法測(cè)定二氧化氯乳頭消毒劑中乳酸的含量，并對(duì)其色譜條件進(jìn)行耐用性試驗(yàn)，驗(yàn)證其可靠性，可作為該乳頭消毒劑中乳酸的含量測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Waters 2695，配2487紫外檢測(cè)器)，美國(guó)Waters公司；超純水一體化系統(tǒng)，美國(guó)Pall公司；電子天平(萬(wàn)分之一)，德國(guó)Sartorius公司；針式過(guò)濾器(有機(jī)系)(0.22 μm)，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；微孔過(guò)濾膜(有機(jī)系)(0.22 μm)，美國(guó)Waters公司；二氧化氯乳頭消毒劑(其中乳酸含量2.4%)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所國(guó)家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)；乳酸原料藥(含量85%)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸對(duì)照品(含量89.9%)，德國(guó)Ehrenstorfer GmbH公司；磷酸為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈為色譜級(jí)純，美國(guó)Fisher公司。

1.2 色譜條件 色譜柱：資生堂Capcell Pak C18MG(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液-乙腈=97.5∶2.5，V/V；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3 溶液配制 對(duì)照品溶液的配制：精密稱取乳酸對(duì)照品適量，加水溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取乳酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加水稀釋制成500 μg/mL的乳酸溶液，作為對(duì)照品工作液。

供試品溶液的配制：取充分混勻后的本品適量(約相當(dāng)于乳酸50 mg)，精密稱量，置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度線，振蕩提取1 min。精密移取1 mL提取液置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品工作液溶液。

1.4 方法參數(shù)考察和耐用性試驗(yàn) 參照2015版《中國(guó)獸藥典》附錄0512，對(duì)系統(tǒng)適應(yīng)性、線性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、溶液穩(wěn)定性及方法耐用性試驗(yàn)進(jìn)行了考察和研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 如圖1所示，對(duì)照品和供試品乳酸保留時(shí)間分別為4.313和4.318 min，對(duì)照品工作液中乳酸主成分峰與相鄰色譜峰完全分離，USP拖尾因子為1.05，USP理論塔板數(shù)為18739，連續(xù)進(jìn)樣6針后，主峰峰面積RSD為0.35%，小于2%，符合標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 色譜圖(500 μg/mL乳酸對(duì)照品(A)；500 μg/mL乳酸供試品(B)；空白輔料(C)；空白輔料-500 μg/mL乳酸對(duì)照品(D))

2.2 線性關(guān)系考察 精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用水稀釋成200、400、500、600、800、1000 μg/mL的系列濃度溶液，按1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，乳酸峰面積為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=536X+3280，決定系數(shù)R2=0.9999，顯示該方法的線性良好。乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 乳酸峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 靈敏度 采用逐步稀釋的方法，按信噪比S/N≥3，得出檢測(cè)限為5 μg/mL；按信噪比S/N≥10，得出定量限為13 μg/mL。

2.4 精密度

2.4.1 重復(fù)性 供試品工作液(500 μg/mL)按照1.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算主峰峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表示，RSD為0.11%，重復(fù)性良好。

2.4.2 方法精密度 配制6份供試品工作液(500 μg/mL)按照1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算主峰峰面積RSD。結(jié)果表明，RSD為0.23%，方法精密度良好。

2.4.3 中間精密度 同一人員，不同時(shí)間另配制6份供試品工作液(500 μg/mL)，按照1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算主峰峰面積RSD，以及與方法精密度平均結(jié)果的相對(duì)偏差(RD)。結(jié)果表明，中間精密度主峰峰面積RSD為0.14%，與方法精密度平均結(jié)果的相對(duì)偏差為0.17%，小于2.0 %，該方法重現(xiàn)性良好。

2.5 準(zhǔn)確度 空白輔料中分別加入乳酸對(duì)照品318.35、265.45、212.56 mg各三份，制成高、中、低三個(gè)濃度(120%、100%、80%)的樣品。分別取充分混勻后的上述樣品適量，按1.3項(xiàng)條件下配制為供試品工作液，按照1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，另取乳酸對(duì)照品工作液(500 μg/mL)進(jìn)樣檢測(cè)。記錄峰面積并計(jì)算回收率及RSD。結(jié)果如表1所示，平均回收率為98.50%，RSD為0.32%，準(zhǔn)確度良好。

表1 乳酸準(zhǔn)確度(回收率)試驗(yàn)結(jié)果

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 供試品工作液(500 μg/mL)室溫條件下放置24 h，分別于0、2、4、6、8、10、24 h按照1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算放置不同時(shí)間下乳酸的含量并與0 h初始值峰面積比較。結(jié)果表明，放置24 h后峰面積為初始值的100.02%，乳酸含量RSD為0.09%，表明該溶液在24 h以內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性。

2.7 耐用性

2.7.1 檢測(cè)波長(zhǎng)考察 取供試品工作液及對(duì)照品工作液(500 μg/mL)適量，考察在210～220 nm范圍內(nèi)不同檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)乳酸含量測(cè)定的影響。結(jié)果表明，主成分乳酸含量RSD為0.11%，表明在檢測(cè)波長(zhǎng)在210～220 nm之間樣品中主成分乳酸的含量能準(zhǔn)確測(cè)定。

2.7.2 檢測(cè)流速的考察 取供試品工作液及對(duì)照品工作液(500 μg/mL)適量，考察0.8～1.2 mL/min范圍內(nèi)不同檢測(cè)流速對(duì)乳酸含量測(cè)定的影響。結(jié)果表示，主成分乳酸含量RSD為0.07%，表明在檢測(cè)流速在0.8～1.2 mL/min之間樣品中主成分乳酸的含量能準(zhǔn)確測(cè)定。

2.7.3 檢測(cè)柱溫的考察 取供試品工作液及對(duì)照品工作液(500 μg/mL)適量，考察30～40 ℃范圍內(nèi)不同檢測(cè)柱溫對(duì)乳酸含量測(cè)定的影響。結(jié)果表示，主成分乳酸含量RSD為0.40%，表明在檢測(cè)柱溫30～40 ℃之間樣品中主成分乳酸的含量能準(zhǔn)確測(cè)定。

2.7.4 不同流動(dòng)相組成比例的考察 取供試品工作液及對(duì)照品工作液(500 μg/mL)適量，考察不同流動(dòng)相組成比例(表2)對(duì)乳酸含量測(cè)定的影響。結(jié)果表示，主成分乳酸含量RSD為0.34%，表明在此5組不同流動(dòng)相比例樣品中主成分乳酸的含量能準(zhǔn)確測(cè)定。

表2 五組不同流動(dòng)相比例

2.7.5 不同色譜柱的考察 取供試品工作液及對(duì)照品工作液(500 μg/mL)適量，考察相同類型不同品牌的色譜柱(表3)對(duì)乳酸含量測(cè)定的影響。結(jié)果顯示，主成分乳酸含量RSD為0.51%，表明使用相同類型不同品牌的色譜柱樣品中主成分乳酸的含量能準(zhǔn)確測(cè)定。

表3 三根不同色譜柱

2.8 樣品含量測(cè)定 取二氧化氯乳頭消毒劑五批(YL200507、YL200512、YL200515、YL211020、YL211021)，按1.3項(xiàng)條件下配制為供試品工作液，按照1.2項(xiàng)條件下色譜進(jìn)行檢測(cè)，五批樣品的含量分別為102.38%、103.95%、104.43%、100.94%、100.09%。

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品前處理的優(yōu)化 二氧化氯乳頭消毒劑為本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)，用于擠奶后消毒的消毒產(chǎn)品，分為A劑(主要成分為乳酸)和B劑(主要成分為亞氯酸鈉)兩部分，使用時(shí)兩部分混合，亞氯酸鈉和乳酸發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生的二氧化氯為消毒作用的主要成分。為達(dá)到持續(xù)消毒的效果，本產(chǎn)品中含有增稠劑、穩(wěn)定劑和著色劑等輔料，滴定法等方法既無(wú)法測(cè)定A劑中輔料是否對(duì)乳酸含量有影響也無(wú)法測(cè)定混合后產(chǎn)品中乳酸的余量。

對(duì)二氧化氯乳頭消毒劑樣品進(jìn)行前處理，主要目的是排除增稠劑、穩(wěn)定劑和著色劑等輔料對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。樣品用超純水稀釋提取后，工作液渾濁，不易過(guò)0.22 μm的濾膜，需多次過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)時(shí)，主峰與雜質(zhì)峰分離度較差，且雜質(zhì)峰過(guò)多。樣品用乙腈和乙醇提取時(shí)，主峰峰型分叉。樣品用甲醇提取時(shí)，提取液易過(guò)膜，主峰響應(yīng)高且與雜質(zhì)峰完全分離，故選用甲醇作為提取液。由于甲醇中有羥基，微量乳酸與之反應(yīng)，乳酸在水溶液中穩(wěn)定性好，樣品用甲醇提取后加水稀釋為供試品工作液，此溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 色譜條件的選擇 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15]及全波長(zhǎng)(210～400 nm)掃描結(jié)果，乳酸的響應(yīng)隨著波長(zhǎng)增大而減弱，在215 nm處有良好的吸收且峰型及分離度較好，故選用215 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)[17-20]，流動(dòng)相中水相相比有機(jī)相所占比例較大，大部分流動(dòng)相都是含鹽流動(dòng)相，此類流動(dòng)相易堵塞儀器，需要耗費(fèi)時(shí)間維護(hù)儀器，故選用不含緩沖鹽的流動(dòng)相。流動(dòng)相分別考察了乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水等，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相時(shí)，乳酸峰型及分離度最好。分別對(duì)表3中的三根色譜柱進(jìn)行考察，含量測(cè)定選用乳酸峰型及分離度最好的色譜柱，即Capcell Pak C18MG色譜柱。

本文建立了HPLC法測(cè)定二氧化氯乳頭消毒劑中乳酸的含量方法，該方法線性關(guān)系良好，精密度高，準(zhǔn)確度良好，溶液穩(wěn)定性和耐用性好，且操作簡(jiǎn)便、可靠性好，可以用作該乳頭消毒劑中乳酸的質(zhì)量控制。