戴 青，王 軒，趙 暉，韓寧寧，楊秀玉，張秀英

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

伊維菌素是阿維菌素的衍生物，由阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，對(duì)畜禽體內(nèi)外寄生蟲(chóng)特別是線蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物均有良好的驅(qū)殺作用，是獸醫(yī)臨床深受重視的高效抗寄生蟲(chóng)藥物[1-2]?！吨袊?guó)獸藥典》2020年版一部[3]收載了伊維菌素注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用高效液相色譜法測(cè)定伊維菌素的含量。采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定是獸藥質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)，在實(shí)驗(yàn)室日常工作中屬于高頻次檢驗(yàn)項(xiàng)目，該項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性關(guān)系到臨床用藥的有效性和安全性，因此實(shí)驗(yàn)室對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)能力的掌握十分重要[4]。實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)是按照預(yù)先規(guī)定的條件，由兩個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)相同或類(lèi)似的被測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)的組織、實(shí)施和評(píng)價(jià)，從而確定實(shí)驗(yàn)室能力，識(shí)別實(shí)驗(yàn)室存在的問(wèn)題與實(shí)驗(yàn)室間的差異，是判斷和監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室能力的有效手段之一。本研究對(duì)中國(guó)34家獸藥檢測(cè)機(jī)構(gòu)采用高效液相色譜法測(cè)定伊維菌素注射液含量的能力進(jìn)行測(cè)試(圖1)，其中省級(jí)獸藥檢測(cè)機(jī)構(gòu)29家，第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)3家，獸藥生產(chǎn)企業(yè)2家。研究能力比對(duì)樣品的均勻性與穩(wěn)定性、結(jié)果統(tǒng)計(jì)、能力評(píng)價(jià)等情況，并對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行討論。

圖1 參加實(shí)驗(yàn)室比例分布圖

1 材料與方法

1.1 材料 高效液相色譜儀(2695型，Waters公司)；紫外檢測(cè)器(2487型，Waters公司)；電子天平(XS205DU型，Mettler Toledo公司)；甲醇(色譜純，Merck公司)；乙腈(色譜純，Merck公司)；伊維菌素對(duì)照品(來(lái)源/批號(hào)/含量：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所/K0192007/92.0%)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 能力比對(duì)樣品為伊維菌素注射液，規(guī)格為5 mL∶50 mg，采用安瓿包裝，每支裝量為5 mL，保存條件為遮光，密閉，在陰涼干燥處保存。

1.2.2 樣品均勻性和穩(wěn)定性考察 根據(jù)CNAS-GL003《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》要求[5]，從能力比對(duì)樣品中隨機(jī)抽取10支進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，每支樣品在重復(fù)性條件下測(cè)定2次，采用單因子方差分析法計(jì)算統(tǒng)計(jì)量F值。為考察樣品對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中高溫的耐受性，隨機(jī)抽取4支樣品放置于40 ℃下，分別放置1 d、3 d、5 d、7 d后測(cè)定伊維菌素含量。為考察樣品對(duì)高濕環(huán)境的耐受性，隨機(jī)抽取4支樣品放置于相對(duì)濕度80%條件下，分別放置1 d、3 d、5 d、7 d后測(cè)定伊維菌素含量。每支樣品在重復(fù)性條件下測(cè)定3次，采用t檢驗(yàn)法分別將高溫、高濕條件測(cè)定結(jié)果的平均值與第0天均勻性檢驗(yàn)樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.3 評(píng)定方法及標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)CNAS-GL002《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》要求，采用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)法計(jì)算各參加實(shí)驗(yàn)室的Z值[6]。本項(xiàng)能力比對(duì)統(tǒng)計(jì)分析采用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)方法，以各實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)健平均值作為指定值(X)，以各實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差作為能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差(σ)。將各實(shí)驗(yàn)室報(bào)告的兩次測(cè)定結(jié)果計(jì)算平均值作為實(shí)驗(yàn)室測(cè)試結(jié)果(x)，根據(jù)以下公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)室Z比分?jǐn)?shù)。

Z=(x-X)/σ

以Z比分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，即：若同一實(shí)驗(yàn)室兩份樣品的Z比分?jǐn)?shù)均滿(mǎn)足|Z|≤2，檢測(cè)結(jié)果為滿(mǎn)意結(jié)果；若同一實(shí)驗(yàn)室兩份樣品的Z比分?jǐn)?shù)有1個(gè)或兩個(gè)滿(mǎn)足2<|Z|<3，檢測(cè)結(jié)果為有問(wèn)題；若同一實(shí)驗(yàn)室兩份樣品的Z比分?jǐn)?shù)有1個(gè)或兩個(gè)滿(mǎn)足|Z|≥3，檢測(cè)結(jié)果為不滿(mǎn)意結(jié)果或離群值。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品均勻性考察結(jié)果 樣品的均勻性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1-表2，采用單因子方差分析法計(jì)算統(tǒng)計(jì)量F值，F(xiàn)臨界值F0.05(9,10)=3.02，統(tǒng)計(jì)量F小于3.02，表明在0.05顯著性水平時(shí)，樣品是均勻的。

表1 能力比對(duì)樣品伊維菌素注射液含量均勻性考察結(jié)果

表2 均勻性考察方差分析結(jié)果

2.2 樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果 采用單一樣本t檢驗(yàn)的方法對(duì)高溫、高濕條件測(cè)定結(jié)果的平均值與第0天均勻性檢驗(yàn)樣品測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較(表3-表4)，查表得在顯著性水平α=0.05，自由度為30(n1+n2-2)時(shí)t0.03,30的臨界值為2.042，統(tǒng)計(jì)量t值小于2.042，表明樣品在40 ℃和相對(duì)濕度80%條件下分別放置7天與第0天含量測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，樣品是穩(wěn)定的。

表3 40 ℃條件下放置穩(wěn)定性考察結(jié)果

表4 相對(duì)濕度80%、25 ℃條件下放置穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.3 能力比對(duì)結(jié)果 參加本項(xiàng)能力比對(duì)的34家單位均在規(guī)定時(shí)間內(nèi)報(bào)送了檢測(cè)結(jié)果(表5，圖2-圖3)，對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)，無(wú)離群值。本項(xiàng)能力比對(duì)32家單位的結(jié)果為滿(mǎn)意，2家單位結(jié)果有問(wèn)題，滿(mǎn)意率94.1%。

表5 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)量匯總

圖2 參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果頻率分布圖

圖3 參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果Z比分?jǐn)?shù)圖

3 討論與結(jié)論

本項(xiàng)能力比對(duì)要求配制的溶液濃度為0.2 mg/mL，有3家實(shí)驗(yàn)室對(duì)照品稱(chēng)量?jī)H約10 mg，稱(chēng)樣量少可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果的不準(zhǔn)確性。定量測(cè)定時(shí)，對(duì)照品溶液和供試品溶液均應(yīng)分別配制兩份進(jìn)行測(cè)定[7]，有4家實(shí)驗(yàn)室對(duì)照品溶液僅配制一份，其測(cè)定結(jié)果的偏差直接影響供試品溶液的測(cè)定。建議日常檢測(cè)中采用雙樣雙針進(jìn)樣，以降低實(shí)驗(yàn)中儀器誤差。在溶液的配制過(guò)程中，玻璃儀器的精度不足、定容操作失誤、樣品是否完全溶解等因素均會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大影響，實(shí)驗(yàn)中所用的移液管與容量瓶均應(yīng)經(jīng)檢定合格后方可使用。本項(xiàng)能力比對(duì)規(guī)定供試品取樣方法為精密量取，應(yīng)選擇準(zhǔn)確度符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)精密度要求的移液管進(jìn)行取樣，在使用移液管時(shí)，需考慮潤(rùn)洗、流出時(shí)間、等待時(shí)間等因素的影響[8]。

本項(xiàng)能力比對(duì)涉及的主要儀器設(shè)備為高效液相色譜儀和分析天平，所有儀器設(shè)備在使用期間均應(yīng)按使用頻繁程度和儀器的穩(wěn)定性定期校準(zhǔn)，并對(duì)校準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，滿(mǎn)足檢驗(yàn)要求后方可使用，必要時(shí)還應(yīng)進(jìn)行期間核查。高效液相色譜法屬于儀器分析法，《中國(guó)獸藥典》中要求對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，一般要求用對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。能力比對(duì)樣品及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)規(guī)定的環(huán)境條件進(jìn)行儲(chǔ)存，需放至室溫后開(kāi)瓶并立即使用。在稱(chēng)量過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由冷藏條件取出后，未放至室溫或開(kāi)瓶后放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則可能引濕或失水，從而引入較大系統(tǒng)偏差。

伊維菌素注射液含量測(cè)定能力比對(duì)的主要目的是為了評(píng)價(jià)參加實(shí)驗(yàn)室采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定的水平，有助于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步提高檢測(cè)技術(shù)和加強(qiáng)質(zhì)量管理。本研究首次對(duì)中國(guó)34家獸藥檢測(cè)機(jī)構(gòu)伊維菌素注射液含量測(cè)定能力進(jìn)行了測(cè)試，通過(guò)穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)法計(jì)算各參加實(shí)驗(yàn)室的Z值，測(cè)試結(jié)果的滿(mǎn)意率為94.1%，表明承擔(dān)獸藥監(jiān)督抽檢和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)任務(wù)的單位具有較高的高效液相色譜法檢驗(yàn)檢測(cè)能力。各檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)進(jìn)一步完善質(zhì)量管理，不斷提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室管理水平，確保日常檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。