陳汝佳，李 婷，余 波，張亞楠，蒲 齡，歐德淵，徐景峨*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025;2.貴州省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽(yáng) 550005)

鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)是具有莢膜，未產(chǎn)生芽孢，沒(méi)有鞭毛的革蘭氏陰性短小桿菌[1]。目前暫定為里氏桿菌屬，未定為哪一科，純培養(yǎng)菌落涂片可見(jiàn)菌體呈單個(gè)、成對(duì)或偶呈絲狀，菌體大小不一，0.2～0.4 μm×1～5 μm[2]。RA在全國(guó)各地廣泛分布，且在鴨、鵝中具有著高感染率，主要通過(guò)呼吸道和損傷皮膚等傳播，也可經(jīng)蛋垂直傳播[3]。該病一年四季皆可發(fā)生，其主要病變特征為纖維素性心包炎，纖維素性肝周炎和腦膜炎等多系統(tǒng)性綜合征[4]，在臨床上RA與鴨圓環(huán)病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨源呼腸孤病毒、新城疫病毒等發(fā)生混合感染，給水禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害[5]。

鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A(Outer Membrane Protein A，OmpA)具有較強(qiáng)的免疫原性和反應(yīng)原性，不同來(lái)源的OmpA基因同源性較高。OmpA蛋白是RA的主要外膜蛋白維持細(xì)菌完整，同時(shí)參于吸附定植于宿主細(xì)胞[6]。此外，有研究已證明[7]，OmpA蛋白是RA的主要免疫原性蛋白。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備了重組OmpA蛋白，并進(jìn)一步建立了檢測(cè)RA IgG抗體的間接ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 RA分離株(G06株)由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；RA陽(yáng)性及陰性血清、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、坦布蘇病毒、大腸桿菌陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存；pET32a原核表達(dá)載體購(gòu)自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；BamHI、XhoI、BL21購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA；IPTG、Urea購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Tris、Glycine、SDS、酶標(biāo)板、TMB顯色液、PBST購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；HisPurTMNi-NTA純化試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；HRP-羊抗鴨IgG購(gòu)自美國(guó)KPL公司。鴨傳染性漿膜炎二價(jià)滅活疫苗(1型RAf63株+2型RAf34株)購(gòu)自天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)RA毒株中OmpA基因序列和pET32a原核表達(dá)載體載體序列中的克隆位點(diǎn)，利用Primer5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。選用BamHI和XhoI作為酶切位點(diǎn)，引物由上海生工公司合成，上游引物：5′-GGATCCATGTTGATGACTGGACTTGGT-3′，下劃線為BamHⅠ酶識(shí)別位點(diǎn);下游引物: 5′-CTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTACTACT-3′，下劃線為XhoI酶識(shí)別位點(diǎn)；目的片段大小約為1149 bp。

1.3 pET32a-OmpA原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 提取RA總核酸，PCR擴(kuò)增OmpA基因，利用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切PCR產(chǎn)物同時(shí)雙酶切pET32a原核表達(dá)載體，將獲得的線性化目的基因與目標(biāo)載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落，抽提質(zhì)粒，雙酶鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pET32a-OmpA。

1.4 OmpA重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將pET32a-OmpA載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化平板上的單個(gè)菌體擴(kuò)大培養(yǎng)。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組菌37 ℃，4 h；取1 mL菌液，10000 g室溫離心2 min棄掉上清，用PBS重懸菌體，上樣。剩余菌液4000 g離心，10 min，棄上清，PBS重懸后超聲波破碎，分別取上清和沉淀，上樣。

1.4.1 OmpA重組蛋白可溶性分析 取陽(yáng)性菌培養(yǎng)18 h，按1∶100接種50 mL LB(Amp+)錐形瓶，37 ℃搖到OD600值約為0.6，加終濃度0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心5 min，沉淀用PBS洗三遍，加20 mL PBS重懸，超聲破碎后4 ℃離心，收集包涵體。

1.4.2 OmpA蛋白的純化 包涵體使用Tris緩沖液洗滌3次后，用含2 mol/L尿素的Tris緩沖液洗去雜蛋白，離心取沉淀用含8 mol/L尿素的TGE緩沖液于4 ℃過(guò)夜溶解，離心取上清置于透析袋中，分別用6、5、4、3、2 mol/L尿素的TGE復(fù)性溶液梯次復(fù)性，蔗糖濃縮。

1.4.3 OmpA蛋白再純化 將蛋白質(zhì)提取物與平衡緩沖液混合制備樣品使得總體積等于二倍樹(shù)脂體積；將HisPurNi-NTA旋轉(zhuǎn)柱700 g離心 2 min，去除存儲(chǔ)緩沖液；向平衡柱中加入二倍樹(shù)脂床體積的平衡緩沖液。使得緩沖液進(jìn)入樹(shù)脂層700 g離心2 min，收集緩沖液；將制備好的蛋白提取物加入柱中，使其吸附于樹(shù)脂床700 g離心2 min；用二倍樹(shù)脂床體積的洗滌緩沖液清洗樹(shù)脂，700 g離心2 min，收集離心液；重復(fù)以上步驟兩次。上樣12%SDS-PAGE。

1.5 OmpA重組蛋白的Western-blotting鑒定 將純化后的重組OmpA蛋白上樣經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至NC膜，5%脫脂粉封閉液封閉37 ℃1 h。用封閉液稀釋一抗(RA鴨陽(yáng)性血清)，膜在一抗稀釋液中 4 ℃過(guò)夜。次日將膜取出后用PBST洗膜4次，每次5 min，用封閉液稀釋二抗(HRP-羊抗鴨IgG)。膜在二抗中37 ℃反應(yīng) 1 h。反應(yīng)完畢后，把膜取出后置于干凈的盒子中洗膜4次，每次5 min。ECL顯影，曝光。

1.6 OmpA間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立 根據(jù)文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)好包被板，在板條上做上標(biāo)記。用包被液將OmpA蛋白抗原稀釋成需要的濃度，混勻后加入板中，每孔加入100 μL，4 ℃冰箱12 h。包被好后，棄除包被液，洗板3次，每孔加入200 μL 5%BSA封閉液，37 ℃恒溫孵育1 h。取出酶標(biāo)板，棄除封閉液，洗板1次。RA陽(yáng)性血清1∶100倍稀釋，每孔100 μL，37 ℃恒溫孵育1 h。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，洗板3次，向每孔中加入100 μL 稀釋好的酶標(biāo)二抗：HRP-羊抗鴨，1∶1000。37 ℃恒溫孵育1 h。取出酶標(biāo)板，棄去二抗，洗板5次，每孔先加入200 μL TMB 顯色液，室溫15 min。每孔加50 μL終止液，終止反應(yīng)。即刻在酶標(biāo)儀上讀OD450值。

1.6.1 OmpA間接ELISA檢測(cè)方法的優(yōu)化 以純化的OmpA蛋白為抗原，羊抗鴨-HRP為二抗，對(duì)下列條件進(jìn)行優(yōu)化，抗原包被濃度(1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400)、封閉條件(37 ℃ 15 min、37 ℃ 30 min、37 ℃60 min、37 ℃ 90 min、37 ℃ 120 min)、血清反應(yīng)條件(37 ℃ 15 min、37 ℃ 60 min、37 ℃90 min、37 ℃ 120 min)、酶標(biāo)反應(yīng)條件(37 ℃ 15 min、37 ℃ 60 min、36 ℃ 90 min、37 ℃120 min)、顯色時(shí)間(5 min、10 min、15 min、20 min)。

1.6.3 特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化后的條件對(duì)本試驗(yàn)室保存的多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)立RA陰陽(yáng)性血清對(duì)照，評(píng)估該方法的特異性。

1.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：使用同一批次純化的OmpA蛋白包被酶標(biāo)板，對(duì)6份臨床陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3孔。

批間重復(fù)性試驗(yàn)：使用3個(gè)批次純化的OmpA蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)同樣的6份陽(yáng)性血清樣品。計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)，以檢測(cè)其重復(fù)性。

1.6.5 敏感性試驗(yàn) 將5份RA抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200)，利用建立的 ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)、評(píng)價(jià)其敏感性。

1.6.6 臨床樣品的檢測(cè) 利用本研究建立的OmpA間接 ELISA方法對(duì)2020年-2021年在貴州地區(qū)采集的120份鴨、76份鵝血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算RA抗體陽(yáng)性率。

1.6.7 OmpA間接ELISA檢測(cè)方法的初步應(yīng)用 將40只1日齡健康雛鴨隨機(jī)分成2組，20只/組。分別設(shè)A組為滅活疫苗組(0.2 mL)、B組為生理鹽水陰性對(duì)照組(0.2 mL)。對(duì)飼養(yǎng)至7日齡健康雛鴨分別采用皮下注射進(jìn)行接種免疫(首免)，間隔1周(14日齡)后進(jìn)行二次免疫。在首免(7 d采血)和二次免疫(14 d采血)后21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d，各組隨機(jī)采集10只雛鴨外周血樣本，分離血清，測(cè)定OD450值。

將40只健康產(chǎn)蛋鴨隨機(jī)分成2組，20只/組。分別設(shè)A組為滅活疫苗組(0.40 mL)、B組為生理鹽水陰性對(duì)照組(0.40 mL)。對(duì)產(chǎn)蛋鴨分別采用皮下注射進(jìn)行接種免疫(首免)，隔上1周后對(duì)產(chǎn)蛋鴨進(jìn)行二次免疫。收集免疫產(chǎn)蛋鴨0、1、2、3、4、5、6、7 w下的種蛋，每組10枚蛋，采用間接ELISA方法檢測(cè)卵黃抗體，測(cè)定OD450值。

2 結(jié)果與分析

2.1 OmpA基因的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒鑒定 OmpA擴(kuò)增產(chǎn)物及雙酶切重組質(zhì)粒pET32a-OmpA的電泳結(jié)果均與預(yù)期片段一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖1)。

M: DL10000 Marker；1:酶切前質(zhì)粒；2: 酶切后質(zhì)粒

2.2 OmpA重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 原核表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-OmpA體外誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)12% SDS-PAGE 分析，結(jié)果顯示，在57 KD處有預(yù)期大小的目的條帶，目標(biāo)蛋白主要在沉淀中，上清中無(wú)明顯條帶(圖2.1)，表明 OmpA重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。進(jìn)一步利用 His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對(duì)OmpA重組蛋白進(jìn)行純化。將11 μg純化后的重組蛋白上樣12% SDS-PAGE，顯示，在57 KD處有明顯單一條帶(圖2.2)，表明OmpA蛋白純化效果較好。用BCA法測(cè)得的純化OmpA蛋白的濃度約為2.243 mg/mL。

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1：未誘導(dǎo) 2：誘導(dǎo)后 3：誘導(dǎo)破碎后上清 4：誘導(dǎo)破碎后沉淀 5：破碎后處理樣品 6：流出 7：洗脫

2.3 OmpA蛋白的Western-blot鑒定 用鴨疫里默氏桿菌抗體陽(yáng)性血清鑒定純化的OmpA蛋白。Western-blotting結(jié)果顯示，在57 KD處有一條清晰帶(圖3)，表明重組OmpA單邊具有良好的反應(yīng)原性。

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1：純化后OmpA蛋白

2.4 OmpA-ELISA檢測(cè)條件的優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)多次方陣檢測(cè)結(jié)果顯示，OmpA蛋白以2.243 mg/mL的濃度進(jìn)行包被，血清以11∶100稀釋，抗原包被條件為4 ℃過(guò)夜、封閉條件為37 ℃ 120 min、血清反應(yīng)時(shí)間為37 ℃ 60 min、酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶1000、酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間為37 ℃ 60 min、顯色時(shí)間為15 min。

圖4 臨界值的計(jì)算

2.6 特異性試驗(yàn) 利用建立的OmpA-ELISA方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)立RA陰陽(yáng)性血清對(duì)照，結(jié)果顯示，除RA陽(yáng)性血清有較好反應(yīng)外，對(duì)其他血清均無(wú)明顯反應(yīng)，說(shuō)明該ELISA方法對(duì)RA特異性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 選擇同批次包被ELISA板，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)2.77%～8.00%，批間變異系數(shù)為1.10%～7.80%，變異系數(shù)均小于10%，證明該ELISA方法可重復(fù)。

表1 特異性試驗(yàn)

表2 重復(fù)性試驗(yàn)

2.8 敏感性試驗(yàn) 運(yùn)用建立的OmpA-ELISA方法將RA陽(yáng)性血清稀釋7個(gè)梯度后，結(jié)果顯示當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋比例為1∶1600時(shí)，OD450值仍大于0.389(圖5)，仍可判斷為陽(yáng)性，表明該方法敏感性較高。

圖5 敏感性試驗(yàn)

2.9 臨床樣品的檢測(cè) 利用試驗(yàn)建立的OmpA-ELISA方法對(duì)貴州省120份鴨、76份鵝血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，120份鴨血清樣本中57份血清樣本為陽(yáng)性，63份血清樣本為陰性，陽(yáng)性率為47.5%。76份鵝血清樣本中17份血清樣本為陽(yáng)性，59份血清樣本為陰性，陽(yáng)性率為22.4%。

2.10 OmpA間接ELISA檢測(cè)方法的初步應(yīng)用 應(yīng)用本試驗(yàn)建立的OmpA-ELISA方法檢測(cè)經(jīng)滅活疫苗免疫后雛鴨RA抗體及免疫產(chǎn)蛋鴨后鴨蛋中卵黃抗體規(guī)律變化水平。如圖6、圖7所示。

圖6 雛鴨血清中RA特異性抗體檢測(cè)

圖7 鴨蛋卵黃中RA特異性抗體檢測(cè)

3 討論與結(jié)論

RA病是目前危害水禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)最主要的細(xì)菌源傳染病之一，RA傳播性和致病性強(qiáng)，患病鴨感染后死亡率高、生長(zhǎng)緩慢且治療難度增大，對(duì)水禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)打擊巨大[9]。使用抗生素是治療該病的主要措施，而濫用抗生素致使RA易產(chǎn)生多重耐藥，甚至造成藥物殘留，嚴(yán)重危害環(huán)境和人類健康[10]。出于對(duì)耐藥性和食品安全性等問(wèn)題的考慮，采用疫苗免疫預(yù)防該病仍是當(dāng)前最為安全、有效的途徑[11]。因此，在臨床上檢測(cè)鴨群中RA抗體是有必要的，通過(guò)抗體檢測(cè)可以判斷鴨場(chǎng)中RA抗體水平，從而制定有效的防控措施。間接ELISA方法是檢測(cè)RA抗體的重要手段，但由于目前商品化的試劑盒多以裂解菌體或脂多糖作為抗原，而血清中存在較多針對(duì)血清型相關(guān)的特異性抗體，血清型針對(duì)性較強(qiáng)，使檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性[12]。實(shí)驗(yàn)室前期使用江蘇某公司鴨疫里氏桿菌(RA Ab)ELISA試劑盒檢測(cè)滅活疫苗免疫鴨血清抗體，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。因此，建立一種臨床檢測(cè)不同血清型RA抗體的間接ELISA方法非常有必要。

外膜蛋白A(OmpA)是細(xì)菌外膜蛋白的主要組成成分，在維持細(xì)菌結(jié)構(gòu)的完整性、參與黏附侵襲宿主和逃逸宿主防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用[13]。近年來(lái)研究表明OmpA是RA各血清型共有的外膜蛋白，并且具有很高的保守性與很強(qiáng)的抗原性[14]。余波[15]等基于鴨疫里默氏桿菌OmpA基因構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-OmpA，通過(guò)免疫雛鴨后表明該質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)鴨機(jī)體產(chǎn)生RA特異性抗體，并且具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)效果。Yang等[16]將鴨IgY Fc基因與RA的OmpA基因融合真核表達(dá)，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母重組表達(dá)，免疫雛鴨后能夠顯著提高血清抗體滴度，具有良好的免疫效力、保護(hù)性及安全性。因此本研究構(gòu)建了pET32a-OmpA的原核表達(dá)質(zhì)粒，成功表達(dá)了OmpA重組蛋白，并以該蛋白為抗原初步建立ELISA方法，通過(guò)特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)表明本研究建立的間接ELISA方法特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好。應(yīng)用本方法檢測(cè)2020年9月到2021年9月貴州省120份鴨血清樣本5中7份血清樣本為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為47.5%。76份鵝血清樣本中17份血清樣本為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為22.4%。應(yīng)用該方法檢測(cè)滅活疫苗免疫后的鴨血清和卵黃抗體，結(jié)果符合滅活疫苗消長(zhǎng)規(guī)律。

現(xiàn)今各養(yǎng)殖場(chǎng)面對(duì)RA的感染，均出現(xiàn)在對(duì)抗生素耐藥的情況，感染后很難治療[17]，因此預(yù)防和早期檢測(cè)對(duì)于RA的廣泛爆發(fā)具有重要作用，試驗(yàn)研究結(jié)果表明，OmpA蛋白間接ELISA檢測(cè)RA抗體效果明顯，對(duì)無(wú)抗養(yǎng)殖技術(shù)的推廣普及提供了強(qiáng)有力支持。