張瑩輝，朱 真，杜吉革，薛 麒，陳小云，馮 宇，印春生

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus,RV)引起的侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)的人畜共患傳染病，發(fā)病后致死率幾乎為100%[1]。RV入侵宿主后能夠在宿主體內(nèi)大量復(fù)制，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)而使其發(fā)病，狂犬病常見的臨床癥狀包括神經(jīng)興奮、意識障礙等，最終全身麻痹死亡[2]。我國是受狂犬病危害較為嚴(yán)重的國家，其發(fā)病率僅次于印度，年均有2000～3000人因狂犬病死亡。該病在我國法定上報的傳染病中位列前三[3]。

RV屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)，是一種具有包膜的單鏈負(fù)股RNA病毒。它具有5種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、包膜糖蛋白(G)和依賴RNA的RNA聚合酶(L)。其中G蛋白位于病毒的囊膜外，是目前發(fā)現(xiàn)唯一可以刺激機體產(chǎn)生中和抗體的蛋白抗原[4-5]。通過基因重組表達(dá)的G蛋白可用于制備狂犬病亞單位疫苗，這在許多國家都已經(jīng)有所應(yīng)用。除此之外，G蛋白作為抗原還可以用于RV血清抗體的檢測。

本研究擬采用pET-32a作為表達(dá)載體，使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對G蛋白進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，并對表達(dá)出的G蛋白進(jìn)行純化、鑒定，建立以G蛋白為抗原的間接ELISA方法，以期為RV血清抗體測定和單克隆抗體篩選提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 RV CVS-11株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；pET-32a原核表達(dá)載體、Vero細(xì)胞均為本試驗室保存；pMD-18T平末端載體、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞、DH5α感受態(tài)細(xì)胞和Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑 Premix ExTaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司；XhoI和EcoR I DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自美國NEB公司；病毒RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司；抗His標(biāo)簽單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購自美國Sigma公司；HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗犬IgG購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；IPTG、氨芐、卡那霉素購自天根生物有限公司。

1.3 目的基因的克隆

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中所提供RV的G蛋白基因序列(NCBI號：NC_001542.1)，使用Primer5軟件設(shè)計上下游引物各一條，其中上游引物G-F/EcoR I序列為CGGAATTCATGGTT￣CCTCAGGTTCTTT，下游引物G-R/XhoI序列為CCCTCGAGTCACAGTCTGGTCTCGCC，其中斜體部分為保護(hù)堿基，下劃線部分為酶切位點，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

1.3.2 總RNA提取及目的基因片段擴增 使用OMEGA病毒RNA提取試劑盒對RV細(xì)胞液進(jìn)行總RNA提取，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒利用下游引物G-R/XhoI獲得cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增目的片段：cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL、Premix ExTaq酶25 μL、雙蒸水22 μL，混勻后94 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，32個循環(huán)，72 ℃ 10 min，擴增后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定目的條帶并進(jìn)行膠回收。

1.3.3 目的基因測序鑒定 將膠回收后的目的片段連接到pMD-18T平末端載體上，得到pMD-18T-G并將其轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定連接成功的陽性克隆菌進(jìn)行測序并擴增(測序由中美泰和生物技術(shù)公司完成)。

1.4 G蛋白的表達(dá)及純化

1.4.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 將測序成功的目的基因用XhoI和EcoR I DNA限制性內(nèi)切酶酶切后，使用T4DNA連接酶與同樣進(jìn)行雙酶切的pET-32a載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，轉(zhuǎn)化后使用含有氨芐西林的選擇性LB瓊脂培養(yǎng)基37 ℃過夜進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行擴大培養(yǎng)并進(jìn)行菌液PCR鑒定，對鑒定成功的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，送至中美泰和生物技術(shù)公司測序。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定成功后將該質(zhì)粒命名為pET-32a-RVG。將表達(dá)菌擴大培養(yǎng)后凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 G蛋白的表達(dá) 將活化后的表達(dá)菌接種到10 mL含有Amp抗性的LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min 搖菌過夜，第2天以1%的比例接種于50 mL含有Amp抗性LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min，4 h后每隔30 min 取100 μL 菌液進(jìn)行OD600nm測定，直到OD600nm值達(dá)到0.5～0.6，停止搖菌。取出1 mL菌液作為未誘導(dǎo)對照，再加入終濃度為1.0 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，在合適的誘導(dǎo)溫度下繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌液，將未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后菌液均離心后棄去上清培養(yǎng)基，加入無菌PBS重懸沉淀，進(jìn)行超聲波裂解，直至溶液清亮，10000 r/min離心5 min，分別收集裂解后的沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.4.3 G蛋白的純化及鑒定 將鑒定正確的包涵體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，對所需的條帶進(jìn)行切膠回收，具體操作是將電泳后的蛋白膠浸泡在0.25 mmol/L的KCl溶液中約5 min，同時將蛋白Marker泳道和相鄰蛋白樣品泳道切下染色，觀察膠塊中的蛋白條帶，并與Marker對照，將所需目的蛋白條帶切下，用PBS清洗2次，將膠塊在潔凈密封袋中碾碎，加入一定量的PBS溶液，置于4 ℃冰箱中過夜，12000 r/min離心10 min，得到純化后的G蛋白。對純化后的蛋白使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行濃度定量測定，并使用SDS-PAGE電泳和Western Blot進(jìn)行鑒定。

1.5 間接ELISA檢測方法的建立

1.5.1 抗血清的制備 使用狂犬病國際標(biāo)準(zhǔn)疫苗以每次每只200 ng的量免疫10只Balb/c小鼠，共免疫3次。初次免疫使用弗氏完全佐劑對疫苗進(jìn)行乳化，以后每隔2周加強免疫一次，加強免疫時使用弗氏不完全佐劑對疫苗進(jìn)行乳化。從首次免疫后第一周開始，每兩周收集一次小鼠血液，共收集5次，分離并混合血清，此血清作為陽性標(biāo)準(zhǔn)血清。同時取空白的Balb/c小鼠血清作為陰性標(biāo)準(zhǔn)血清。

1.5.2 間接ELISA方法建立 將純化后的G蛋白作為抗原以不同的濃度包被于固相載體上，封閉后使用1.5.1中得到的陽性標(biāo)準(zhǔn)血清和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清作為一抗與包被抗原結(jié)合，洗板去除未結(jié)合物，再加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)抗體，最后通過加入能與酶反應(yīng)的底物顯色，通過讀取OD450nm值進(jìn)行定量判斷。

1.5.2.1 抗原最佳包被量及一抗最佳稀釋比例的確定 使用交叉實驗的方法：將純化后的G蛋白抗原按照1 μg、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng、7.8125 ng每孔的量包被到酶標(biāo)板中，每孔100 μL；將陽性血清、陰性血清分別進(jìn)行1∶50、1∶100、1∶200、1∶400倍稀釋，每孔100 μL。操作步驟按照常規(guī)間接ELISA方法進(jìn)行。

1.5.2.2 酶標(biāo)二抗稀釋度優(yōu)化 將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體用PBS進(jìn)行1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000倍稀釋。按照常規(guī)ELISA方法進(jìn)行，根據(jù)試驗結(jié)果確定酶標(biāo)抗體的最佳使用濃度。

1.5.2.3 底物顯色時間優(yōu)化 使用TMB底物在室溫下避光顯色5、10、15和20 min。按照常規(guī)ELISA方法進(jìn)行，根據(jù)試驗結(jié)果確定顯色時間。

1.5.2.4 封閉條件優(yōu)化 分別使用1%脫脂乳、5%脫脂乳、1%BSA、5%BSA進(jìn)行包被抗原的封閉，同時設(shè)置4 ℃ 封閉過夜、37 ℃ 封閉2 h的封閉條件，按照常規(guī)ELISA方法進(jìn)行，根據(jù)結(jié)果確定試驗最佳封閉條件。

1.5.3 間接ELISA方法陰陽性臨界值、敏感性和特異性鑒定以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

1.5.3.1 陰陽性臨界值的確定 使用此方法檢測30份空白小鼠血清，計算血清OD450nm值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差，并根據(jù)公式(陰陽性臨界值=平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)方差)計算陰陽臨界值。

1.5.3.2 敏感性試驗 按照1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000倍倍比稀釋狂犬病病毒陽性血清，依次加入到包被好G蛋白抗原的ELISA板中，根據(jù)陰陽性臨界值確定能夠檢測為陽性結(jié)果的稀釋度，來確定方法的敏感性。

1.5.3.3 特異性試驗 按照建立的間接ELISA方法，將狂犬病陰性血清和3份未免疫狂犬病疫苗小鼠的細(xì)小病毒陽性血清、3份犬瘟熱病毒陽性血清進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，根據(jù)待檢血清和陰陽血清OD450nm值確定試驗的特異性。

1.5.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 使用FAVN法和犬的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對ELISA方法中小鼠標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的效價進(jìn)行測定，然后對小鼠標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行梯度稀釋，測定其對應(yīng)的OD450nm值，以O(shè)D450nm值為x軸、稀釋度對應(yīng)的陽性血清效價為y軸，繪制出表示兩者線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.4 方法與熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)法對比 使用已經(jīng)建立的ELISA方法和FAVN方法分別對10份小鼠狂犬病陽性血清進(jìn)行檢測，分別計算出10份血清效價，比較兩種方法的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 G蛋白基因的擴增 以CVS-11株RV的cDNA為模版，用上下游引物進(jìn)行擴增，擴增出G蛋白全長基因片段，大小為1575 bp(圖1)，符合預(yù)期大小。

1: PCR product of G gene；M: DL2000 DNA Marker

2.2 G蛋白基因的克隆及鑒定 重組質(zhì)粒pMD18-T-G經(jīng)XhoI和EcoR I雙酶切鑒定，得到1575 bp和2962 bp大小的兩個片段(圖2)，證明G蛋白基因已經(jīng)正確克隆到T載體上。

M: DL5000 DNA Marker；1: PCR product of G gene; 2: Double enzyme digestion product of pMD18-T-G

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-G的構(gòu)建及鑒定 用XhoI和EcoR I對目的片段進(jìn)行雙酶切后連接于酶切后的pET-32a載體上，對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得到1575 bp和5900 bp大小的兩個片段(圖3)，鑒定正確后送測序，測序結(jié)果正確。pET-32a-G構(gòu)建成功。

M: DL5000 DNA Marker; 1: PCR product of G gene；2: Double enzyme digestion product of pET-32a-G

2.4 重組表達(dá)蛋白SDS-PAGE鑒定及其可溶性分析 重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，在62 kD附近出現(xiàn)目的條帶(圖4)，且多存在于包涵體沉淀中，表明蛋白以包涵體形式存在。

M: Protein Marker；1: Supernatant of pET-32a-G；2: Inclusion bodies of pET-32a-G

2.5 重組表達(dá)蛋白的純化及其鑒定 對切膠純化后的G蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western Blot鑒定，結(jié)果顯示純化后的蛋白無雜蛋白，純度較高(圖5、圖6)。

M: Protein Marker; 1: Purified protein; 2:Inclusion bodies

M: Protein Marker; 1-3: purified protein

2.6 間接ELISA最佳工作條件的確定 根據(jù)正交實驗結(jié)果，當(dāng)G蛋白抗原包被量為7.8125 ng/孔、血清稀釋度為1∶100時，陽性血清接近1.0，此時陽、陰性血清OD450nm比值(P/N)最大。因此選擇1∶100為最佳的陰陽性血清稀釋度，7.8125 ng/孔為最佳的抗原包被量。使用4種封閉液分別封閉抗原，間接ELISA方法測定封閉效果，使用5%BSA作為封閉液時，陽性血清OD450nm值在1附近，且陽性、陰性血清OD450nm比值最高，故5%BSA為最佳封閉液。將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體進(jìn)行1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000倍稀釋，按照間接ELISA方法測定陰陽性血清的OD450nm以及P/N值，酶標(biāo)二抗的最佳稀釋濃度為1∶8000。使用TMB底物顯色液在避光條件下進(jìn)行ELISA試驗，分別在不同的時間終止顯色，測定陰陽性血清OD450nm值，確定底物顯色時間為室溫下避光15 min。對已知的30份狂犬病病毒抗體陰性血清進(jìn)行檢測，計算OD450nm平均值為0.1648，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0313,因此陰陽性臨界值為0.2587。

2.7 ELISA方法敏感性試驗 使用本試驗建立的ELISA方法對不同稀釋倍數(shù)的陽性血清樣品進(jìn)行敏感性檢測。如表1所示，當(dāng)血清在1∶16000倍稀釋時，其OD450nm大于陰陽性臨界值，且P/N值大于2。

表1 間接ELISA檢測方法敏感性分析

2.8 ELISA方法特異性試驗 用間接ELISA方法檢測犬細(xì)小病毒小鼠陽性血清和犬瘟熱病毒小鼠陽性血清，同時設(shè)置狂犬病病毒陽性血清、陰性血清和空白對照，試驗結(jié)果如表2所示，犬細(xì)小、犬瘟熱病毒以及空白小鼠血清OD450nm平均值均在陰陽性臨界值之下，說明ELISA方法特異性較好。

表2 間接ELISA方法的特異性分析

2.9 ELISA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 使用ELISA方法以及已知效價的小鼠狂犬病陽性血清進(jìn)行試驗，如表3所示，以ELISA方法檢測的血清中和抗體OD450nm值作為x軸，以已知的中和抗體滴度作為y軸，建立計算抗體滴度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(圖7)，得出多項式方程y=0.839x2-1.1798x+0.51，其相關(guān)系數(shù)為0.98，接近1，表明兩者的相關(guān)性較好。

表3 不同中和抗體滴度對應(yīng)的OD450nm值

圖7 不同中和抗體滴度對應(yīng)的OD450nm值標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.10 ELISA與FAVN試驗結(jié)果比較 本試驗中狂犬病病毒感染Vero細(xì)胞熒光照片如圖8。當(dāng)孔內(nèi)出現(xiàn)類似如圖所示的細(xì)胞內(nèi)熒光顯影時，即可將該孔判定為陽性，未出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)熒光顯影，可判定為陰性，如圖9。

圖8 CVS-11感染Vero細(xì)胞熒光圖

圖9 未被病毒感染Vero細(xì)胞熒光圖

使用ELISA和FAVN方法檢測10份陽性血清樣品，分別計算其抗體含量，如表4所示，將兩者的結(jié)果變化趨勢以折線圖表示(圖10)，計算兩條折線的相關(guān)系數(shù)為0.986。兩種方法檢測10份血清的陽性率均為100%，表明本試驗建立的ELISA方法與OIE推薦的FAVN法檢測小鼠血清抗體效價具有較非常高的符合率。

表4 FAVN法和ELISA檢測10份血清樣品的抗體含量

圖10 ELISA和FAVN法檢測10份血清樣品中和抗體含量結(jié)果比較

3 討 論

狂犬病嚴(yán)重危害著人類和動物的健康，我國是受其影響最嚴(yán)重的國家之一。目前針對人類的狂犬病，預(yù)防性接種和暴露后的接種是防治狂犬病的主要措施。狂犬病疫苗的使用效果需要通過免疫后的抗體效價監(jiān)測來實現(xiàn)，目前WHO推薦的抗體監(jiān)測方法為FAVN法，這種方法在試驗過程中需要使用CVS-24毒株，存在一定的危險性[6]。而ELISA方法具有靈敏度高、快速、操作便捷、成本低的優(yōu)點，除使用全病毒粒子之外，使用具有特異性抗體識別位點的G蛋白進(jìn)行抗體的檢測也具有一定的可行性[7]。RV中G蛋白的基因全長為1575 bp，由524個氨基酸組成，G蛋白與病毒的致病力有密切的關(guān)系，并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，刺激機體產(chǎn)生對抗病毒的中和抗體。G蛋白是一種跨膜蛋白，具有三聚體結(jié)構(gòu)，位于狂犬病病毒包膜和感染細(xì)胞的質(zhì)膜中，包含胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，疏水性跨膜區(qū)域和胞外區(qū)域，三種單體的結(jié)合形成了三聚體[8]。研究表明G蛋白具有3個中和抗體結(jié)合位點，其中III號位點最為重要，是位于330～357位氨基酸序列，G蛋白變性后，III號位點隨即消失，但除此之外，G蛋白還含有一些線性表位，這些表位不依賴于高級空間結(jié)構(gòu)也能夠存在，在變性的蛋白中能夠存在，從而能夠被抗體特異性識別。

本研究以原核系統(tǒng)表達(dá)的G蛋白作為包被原，使用免疫了狂犬病標(biāo)準(zhǔn)疫苗的小鼠血清作為陽性血清，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體作為二抗，摸索各個試驗環(huán)節(jié)的最佳條件，最終建立了間接ELISA方法，可以用于檢測小鼠血清樣品中狂犬病病毒中和抗體的水平，也可以用于狂犬病病毒G蛋白單克隆抗體制備過程中，抗狂犬病病毒G蛋白抗體陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選。本方法的特異性好，與常見的能夠感染犬只的犬細(xì)小病毒和犬瘟熱病毒均無交叉反應(yīng)；本方法的敏感性高，在血清稀釋度為1∶16000時仍然能夠檢測出陽性，這也說明雖然試驗使用的包被抗原以包涵體形式存在，但其主要的抗原抗體結(jié)合位點并未受到空間構(gòu)象的影響。

FAVN法具有很好的靈敏度和準(zhǔn)確性，其結(jié)果在判定時較熒光灶試驗受主觀因素影響小，且試驗周期較短，是廣泛使用的抗體效價檢測方法，也是國際公認(rèn)的檢測狂犬病病毒中和抗體的金方法之一[9-10]。使用熒光抗體病毒中和試驗與本試驗建立的ELISA方法同時檢測10份小鼠血清，結(jié)果表明兩種檢測方法得出的結(jié)果相關(guān)性較好，陽性符合率為100%。進(jìn)一步說明本試驗建立的ELISA檢測方法結(jié)果可靠。ELISA方法具有簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點，且對試驗條件的要求低，相比于FAVN法，具有不用活毒、試驗周期短、可檢測樣本量大等優(yōu)點。因此ELISA方法更適用于疫苗效力檢驗中免疫小鼠血清中和抗體的測定。

本試驗中使用G蛋白作為包被原建立的ELISA方法可用于檢測小鼠血清抗體含量，也可用于狂犬病病毒G蛋白單克隆抗體制備過程中的陽性雜交瘤細(xì)胞篩選，當(dāng)把本ELISA方法中辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體換作抗犬的抗體之后，經(jīng)過優(yōu)化試驗條件，也可用于犬血清中狂犬病病毒中和抗體的檢測，對疫苗免疫后的犬體內(nèi)抗體含量變化情況進(jìn)行監(jiān)測，來評價疫苗的免疫效果[11]。