李慶東 張彩云 綦翔宇 姜文國 田 梗 張桂龍

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺 264003;2 濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像探針研究所 山東 煙臺 264003

成像技術(shù)是臨床診斷疾病的重要手段。磁共振成像(magnetic resonance imaging， MRI)技術(shù)具有軟組織成像效果好、無電離輻射、空間分辨率高等特點，受到患者和臨床工作者的青睞，已經(jīng)成為臨床中最重要的影像學(xué)診斷工具之一[1]。目前，雖然臨床磁共振成像儀在實際診斷過程中對軟組織具有較高分辨率，但在正常組織和疾病組織之間的成像信號差異不明顯，難以精確定位出病灶組織[2]。注射造影劑是臨床中提高正常組織和疾病組織之間對比度的最常用方法。造影劑主要分為T1型造影劑和T2型造影劑兩類[3]。T1造影劑主要衰減氫質(zhì)子的自旋晶格(T1)弛豫時間，而T2造影劑則衰減氫質(zhì)子的自旋-自旋(T2)弛豫時間[4]。直觀上，T1造影劑主要使病灶組織的加權(quán)圖像變得更亮，亦稱為陽性造影劑，其以釓螯合物為典型代表，如馬根微顯(Gd-DTPA)、釓特酸葡胺(Gd-DOTA)等[5-6]。相對于T1造影劑，T2造影劑主要使病灶組織的加權(quán)圖像更暗，也稱陰性造影劑，以磁性氧化鐵納米顆粒為典型代表，如菲立磁[7-8]。然而，T1造影劑的信號容易受到脂肪組織和順磁性離子的影響，造成對疾病的誤診。T2造影劑的信號也會遭受出血、鈣化點等因素影響，產(chǎn)生局部偽影，導(dǎo)致診斷的不準(zhǔn)確[9-10]。為了彌補T1和T2單模態(tài)磁共振造影劑的缺陷，研究人員通過開發(fā)T1-T2雙模態(tài)磁共振造影劑，為疾病的臨床精準(zhǔn)診斷提供了有效途徑[11-13]。本研究使用一鍋高溫溶劑熱合成法制備了一種新型的FeGd納米復(fù)合物作為高性能的T1-T2雙模態(tài)磁共振造影劑，并在體外驗證了其造影性能以及生物安全性，為雙模態(tài)磁共振造影劑的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了重要信息。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 乙酰丙酮鐵【Fe(acac)3】、乙酰丙酮釓【Gd(acac)3】、乙二醇(EG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、三乙醇胺(TEA)購自上海阿拉丁公司。細(xì)胞技術(shù)試劑盒(MTT)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器 透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100F，日本JEOL公司)，動態(tài)光散射粒度分析儀(DLS，Nanotrac Wave Ⅱ，美國Microtrac公司)，電感耦合等離子體光學(xué)發(fā)射光譜儀(ICP-OES，AvioTM220 Max，美國PerkinElmer公司)，熱重分析儀，紅外光譜儀，7.0 T磁共振成像儀等。

1.3 實驗方法

1.3.1 FeGd納米材料的合成 取100 mL錐形瓶，分別加入Fe(acac)30.5 g和Gd(acac)30.15 g和EG 50 mL，在磁力攪拌下升溫至80 ℃，維持30 min，溶液呈亮橙色透明溶液后，加入1.5 g 的PVP，繼續(xù)磁力攪拌至PVP完全溶解后，加入5 mL的TEA，繼續(xù)攪拌10 min。隨后將上述反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)入100 mL反應(yīng)釜，烘箱加熱至200 ℃，反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，高速離心反應(yīng)液20 min(25 000 r/min)，收集固體產(chǎn)物，并用去離子水和乙醇洗滌三遍后重新分散在水中，得到FeGd納米材料。

1.3.2 FeGd納米材料膠體穩(wěn)定性的測定 將FeGd納米材料均勻分散在去離子水，RPMI-1640培養(yǎng)基和10%的胎牛血清溶液中，并在靜置不同時間(6、12、24、48 h)后，使用納米粒度儀測定FeGd納米材料在不同溶液中的水合粒徑變化。

1.3.3 FeGd的馳豫率測定 將FeGd納米材料均勻分散在去離子水中，配成母液，隨后利用1%的瓊脂糖高溫溶液稀釋母液至不同的Gd濃度梯度(0、0.025、0.05、0.1、0.2 mM)和Fe濃度梯度(0、0.023、0.045、0.09、0.18 mM)，并封裝于200 μL離心管中，冷卻至室溫，瓊脂糖溶液凝固后，利用7.0 T小動物磁共振成像儀測試。T1弛豫時間測定的序列參數(shù)為：TR 為6 000 ms，TE為5.6 ms，BW為25 kHz，層厚為0.8 mm，矩陣為128 × 128，平均1次。T2弛豫時間測定的序列參數(shù)為：TR=2 500 ms，回波次數(shù)為20，回波時間為10～20 ms。隨后將馳豫時間的倒數(shù)/Gd離子濃度(Fe離子濃度)的線性擬合，計算縱向T1弛豫率(r1)和橫向T2弛豫率(r2)。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞毒性測定 將C166細(xì)胞培養(yǎng)在含10 %胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。隨后，將C166細(xì)胞接種在96孔板中，并調(diào)節(jié)其細(xì)胞密度為2×105/孔，將不同濃度的FeGd納米材料分別加入培養(yǎng)基內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，除去培養(yǎng)基，并用 PBS洗滌3次。去除納米材料后，加入含有MTT的培養(yǎng)基(500 μg/mL)，孵育4 h后，加入DMSO溶解藍(lán)色結(jié)晶，利用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞活性。

1.3.5 溶血性實驗 取大鼠血液500 μL，1 000～1 500 r/min，離心15 min后棄去上清。加入1 mL PBS輕輕混勻紅細(xì)胞，1 000～1 500 r/min，離心5 min，重復(fù)3次，最后用1.2 mL PBS混勻紅細(xì)胞。隨后取6個1.5 mL的離心管，每管加入200 μL的紅細(xì)胞分散液，再分別加入1 mL的PBS、去離子水以及不同濃度的FeGd溶液(15、25、50、100 μg/mL)。以PBS為陰性對照，水為陽性對照。在反應(yīng)1、3、5 h后離心，拍照記錄，并測定上清溶液在570 nm處的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 FeGd納米材料的形貌觀察 本研究通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察發(fā)現(xiàn)，制備的FeGd納米材料具有均一的結(jié)構(gòu)，并且呈現(xiàn)明顯的球形結(jié)構(gòu)。本研究在高倍的TEM觀察發(fā)現(xiàn)，合成的FeGd納米材料球形結(jié)構(gòu)表面呈現(xiàn)大量的突起，這可能是由于超小磁性氧化鐵沉積導(dǎo)致的。此外，本研究測量納米顆粒的尺寸發(fā)現(xiàn)，其尺寸大約在220 nm，這個尺寸可以保證納米顆粒在體內(nèi)具有更長的代謝時間，延長其在體內(nèi)的血液循環(huán)時間，可以明顯促進(jìn)其在病灶組織的累積，改善對病灶組織的診斷(圖1)。

a. 低倍電子顯微鏡圖片；b. 高倍電子顯微鏡圖片。

2.2 FeGd納米材料的膠體穩(wěn)定性 FeGd納米材料的水合粒徑分析結(jié)果顯示，納米顆粒的水合粒徑主要分布在200～300 nm之間，平均粒徑在220 nm左右，這與TEM觀察的結(jié)果一致。這表明，F(xiàn)eGd納米材料具有良好的膠體性質(zhì)(圖2a)。本研究進(jìn)一步觀察FeGd納米材料在不同溶液中的膠體穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，隨著靜置時間的增加，F(xiàn)eGd納米顆粒的水合粒徑在三種溶液(去離子水、RPMI-1640培養(yǎng)基、10%的胎牛血清)中沒有明顯變化(圖2b)。這說明，F(xiàn)eGd納米顆粒在上述三種溶液中不會發(fā)生團(tuán)聚或降解等反應(yīng)，展現(xiàn)出良好的膠體穩(wěn)定性。良好的膠體穩(wěn)定性為FeGd納米顆粒在體內(nèi)的安全應(yīng)用提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。

a. FeGd納米材料的水合粒徑分布圖；b. FeGd納米材料在不同溶液中的粒徑變化圖；c. FeGd納米材料的紅外光譜圖；d. FeGd納米材料熱重分析圖。

2.3 FeGd納米材料的組分測定 傅里葉紅外光譜圖結(jié)果顯示，F(xiàn)eGd納米材料在580～650 cm-1展現(xiàn)了一個寬峰，這主要歸因于Fe-O和Gd-O鍵的伸縮振動。這說明，F(xiàn)eGd納米復(fù)合物主要有鐵氧化物和釓氧化物組成，在1 020 cm-1出現(xiàn)的峰主要為-C-O鍵的伸縮振動，在2 844 cm-1和2 908 cm-1處出現(xiàn)C-H伸縮振動峰，以及在1 650 cm-1處出現(xiàn)C=O的吸收峰(圖2c)。這些吸收峰的出現(xiàn)說明，F(xiàn)eGd納米材料中存在大量的PVP聚合物。因此，本研究認(rèn)為，這些聚合物大量的親水基團(tuán)賦予FeGd納米顆粒良好的膠體穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步確定FeGd納米材料中PVP聚合物的含量，本研究通過熱重分析測定發(fā)現(xiàn)，納米材料在室溫到200 ℃的升溫過程中有11.01%的重量損失，這主要歸因于吸附水和結(jié)合水的蒸發(fā)。隨后，溫度在200～600 ℃之間的重量損失達(dá)到17.66%，這主要歸因于FeGd納米顆粒中有機物的脫氫脫氧和燃燒過程造成的重量損失(圖2d)?；谝陨戏治?，本研究認(rèn)為，F(xiàn)eGd納米材料中PVP聚合物的重量比達(dá)到17.66%。

2.4 FeGd納米材料的表面電位 本研究通過分析zeta電位進(jìn)一步測定了納米顆粒的表面電位。在中性條件下，納米材料展現(xiàn)出較高的正電位，這主要是因為材料表面大量的羰基發(fā)生質(zhì)子化和氧化釓和氧化鐵表面氧的質(zhì)子化導(dǎo)致表面電位為正電荷。較高的表面電位會增加納米顆粒之間的靜電斥力，使納米顆粒在溶液中具有更穩(wěn)定的膠體性能。為了確認(rèn)質(zhì)子化過程，本研究通過降低溶液pH值，增加溶液質(zhì)子含量，進(jìn)一步測定了納米材料的表面電位。結(jié)果顯示，隨著溶液質(zhì)子含量的增加，F(xiàn)eGd納米顆粒表面電位逐漸增加，這進(jìn)一步驗證了上述結(jié)論(圖3)。

圖3 FeGd納米顆粒在不同pH值條件下的表面電位

2.5 FeGd 納米材料的T1和T2弛豫率測定 本研究利用7.0 T小動物磁共振成像儀測定FeGd納米顆粒的T1和T2弛豫率，結(jié)果顯示，F(xiàn)eGd納米顆粒的T1弛豫率為6.765 mM-1s-1，T2弛豫率為213.81 mM-1s-1。T1弛豫率和T2弛豫率均高于臨床中使用Gd-DTPA和菲立磁磁共振造影劑。這表明，F(xiàn)eGd納米顆粒具有良好的T1和T2雙模態(tài)磁共振造影性能。FeGd納米材料溶液樣品的T1加權(quán)圖像顯示，隨著溶液濃度的增加，樣品的T1磁共振加權(quán)圖像逐漸變亮，展現(xiàn)出超強的T1造影能力。樣品的T2磁共振加權(quán)圖像逐漸變暗，具有強烈的T2造影能力(圖4)?；谝陨戏治?，本研究認(rèn)為，F(xiàn)eGd納米材料具有良好的T1-T2雙模態(tài)磁共振造影性能。

a. FeGd納米材料的T1弛豫率和T1加權(quán)圖像；b. FeGd納米材料的T2弛豫率和T2加權(quán)圖像。

2.5 FeGd納米材料的生物安全性評價 生物安全性是評估新型納米造影劑能否應(yīng)用于臨床的重要考慮因素。本研究使用不同濃度的FeGd納米材料分別培養(yǎng)正常C166細(xì)胞24 h和48 h，測定相應(yīng)的細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，F(xiàn)eGd納米材料對正常細(xì)胞幾乎沒有損傷，即使增加培養(yǎng)濃度和培養(yǎng)時間，C166細(xì)胞仍然保持很好的活性(圖5a)。這表明，F(xiàn)eGd納米材料具有良好的細(xì)胞生物相容性。溶血實驗也被用來進(jìn)一步評價FeGd納米材料的血液生物相容性。結(jié)果顯示，盡管隨著FeGd納米材料濃度增加和處理時間增加，溶血率逐漸增加，但是溶血率均很低，即使在100 μg/mL的高濃度條件下處理血紅細(xì)胞24 h，紅細(xì)胞的溶血率僅有約6%，大多數(shù)的紅細(xì)胞仍然保持完整(圖5b)。這表明，F(xiàn)eGd納米材料幾乎不會對紅細(xì)胞造成損傷，具有良好的血液生物安全性。

a. 不同濃度FeGd培養(yǎng)正常細(xì)胞C166的細(xì)胞活性；b. 溶血實驗：不同F(xiàn)eGd納米材料處理血紅細(xì)胞。

3 討論

MRI技術(shù)已經(jīng)成為最廣泛使用的疾病診斷工具之一。相對于其它影像學(xué)診斷技術(shù)，MRI具有無電離輻射、無侵入性、軟組織高分辨率、可對組織進(jìn)行3D重構(gòu)成像等優(yōu)點[14-15]。磁共振臨床診斷常借助造影劑增強正常組織和疾病組織之間的對比度來獲取更精準(zhǔn)的診斷結(jié)果。臨床造影劑主要有小分子釓螯合物的T1型造影劑和超小氧化鐵納米晶的T2型造影劑。T1造影劑和T2造影劑在成像過程中均會受到體內(nèi)一些物質(zhì)的干擾，導(dǎo)致一些偽影的出現(xiàn)，干擾對疾病的精準(zhǔn)診斷造影。因此，迫切需要開發(fā)多模態(tài)的磁共振造影試劑。單一納米純相體系一般僅能夠?qū)崿F(xiàn)單模態(tài)的磁共振造影成像。為了實現(xiàn)多模態(tài)磁共振造影成像，研究人員常需要將多種化合物整合在一個納米體系中。如何合理、簡單、高效地構(gòu)建多模態(tài)磁共振納米復(fù)合體系尤為關(guān)鍵。目前，一些研究已經(jīng)報道了一些T1-T2雙模態(tài)的磁共振造影試劑，構(gòu)建模式主要有釓螯合物接枝磁性氧化鐵納米顆粒，釓氧化物包裹磁性氧化鐵，以及順磁性金屬離子摻雜磁性氧化鐵納米顆粒[1,16-18]。這些雙模態(tài)磁共振造影劑展現(xiàn)出良好的T1和T2弛豫率，并在活體雙模態(tài)成像中展現(xiàn)出良好的造影效果。然而，以上的雙模態(tài)磁共振造影劑構(gòu)建過程復(fù)雜，產(chǎn)率較低，花費較高，制約了規(guī)?；闹苽潆p模態(tài)磁共振造影劑。

本研究利用溶劑熱一鍋法制備出FeGd納米復(fù)合材料，其尺寸均一，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，溶液膠體性能極好，具有良好的活體應(yīng)用前景。同時，該制備方法解決了傳統(tǒng)雙模態(tài)磁共振造影劑制備繁瑣、產(chǎn)率較低等問題，具有更好的應(yīng)用潛力。磁共振成像結(jié)果顯示，F(xiàn)eGd納米材料具有優(yōu)異的T1和T2弛豫率，在體外具有強烈水質(zhì)子信號衰減能力，展現(xiàn)出明顯的T1和T2造影性能。在細(xì)胞水平上驗證的生物安全性結(jié)果展現(xiàn)出FeGd納米造影劑具有良好的細(xì)胞生物相容性和血液生物安全性。因此，本研究制備的FeGd納米復(fù)合材料作為T1-T2雙模態(tài)磁共振造影劑具有潛在的臨床應(yīng)用前景。