李一鳴 王冰清 胡暢 王月 鎖進(jìn)猛 彭志勇

膿毒癥是由感染引起宿主免疫反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的多器官功能障礙，進(jìn)而危及生命的臨床綜合征[1]。腎臟是膿毒癥最容易累及的器官，約有40%～70%膿毒癥患者發(fā)生急性腎損傷(AKI)[2-3]。盡管血清胱抑素C聯(lián)合急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分Ⅱ?qū)δ摱景YAKI有較好的預(yù)測價(jià)值[4]，但由于發(fā)病機(jī)制不明確，缺乏特異性治療方法，深入研究膿毒癥AKI的發(fā)病機(jī)制并不斷尋找新的治療靶點(diǎn)，有助于改善膿毒癥AKI預(yù)后。纖維網(wǎng)狀細(xì)胞(FRC)是間質(zhì)來源的成纖維細(xì)胞[5]，存在于淋巴器官和多種次級淋巴結(jié)器官中，包括脾臟、淋巴結(jié)、潘氏淋巴結(jié)、脂肪相關(guān)淋巴組織等[6]。FRC是間質(zhì)細(xì)胞中特異性較強(qiáng)的一類細(xì)胞，以CD45-PDPN+CD31-作為其分子標(biāo)記[7]。最近的研究提示FRC有重要的免疫調(diào)節(jié)特性，可調(diào)控T細(xì)胞的分化和功能[8]。有研究發(fā)現(xiàn)在盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)誘導(dǎo)膿毒癥小鼠模型中，感染早期和晚期應(yīng)用進(jìn)行腹腔注射FRC可降低血清促炎細(xì)胞因子水平及死亡率[9]。我們既往研究也證實(shí)腹腔注射FRC能有效降低膿毒癥小鼠死亡率及血液和腹腔灌洗液中的炎癥因子水平，進(jìn)而降低腹腔灌洗液中的細(xì)菌負(fù)荷[10]。然而FRC對于膿毒癥AKI的作用機(jī)制尚不清楚。在膿毒癥中，多種Toll樣受體(TLR)被激活，脂多糖(LPS)可激活TLR4，加重腎損傷。本研究通過將FRC和LPS刺激后的腎小管上皮細(xì)胞(TECs)共培養(yǎng)，觀察FRC是否通過促進(jìn)TECs線粒體自噬從而改善腎損傷，為研發(fā)基于FRC的細(xì)胞療法治療膿毒癥AKI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.材料：C57BL/6雄性小鼠購自北京維通利華公司，鼠齡10～12周。1640、DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購自BI公司(貨號04-400-1A)，F(xiàn)icoll分離液購于Sigma-Adrich公司，流式抗體(CD45、PDPN、CD31)購于Biolend公司，Transwell共培養(yǎng)小室購于BD公司，PARK、Pink1抗體購于CST公司(貨號2132、貨號46421)，HO-1抗體購自Proteintech公司(貨號27282-1-AP)，LPS購自Invivogen公司(貨號tlrl-eblps)。

2.方法

(1)小鼠原代TECs提取和培養(yǎng)：麻醉小鼠后取出雙側(cè)腎臟，去除髓質(zhì)，冰上剪碎皮質(zhì)，0.25%Ⅱ型膠原酶中37 ℃消化30 min，分別過70 μm和40 μm細(xì)胞篩，在細(xì)胞洗滌液沖洗數(shù)次，離心后用含10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸，置于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)已通過武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批，編號WP2020-08022。

(2)FRC的原代分離培養(yǎng)：方法(1)中小鼠消毒后逐層打開腹腔，剪下腸系膜脂肪，將剪碎的脂肪組織置于含有0.2 mg/ml Liberase TL和0.025 mg/ml DnaseⅠ的DMEM培養(yǎng)基中37 ℃消化30 min，用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，所提取的FRC用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)。

(3)流式細(xì)胞儀鑒定FRC和原代TECs：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測FRC表面CD45、PDPN、CD31表達(dá)情況。提取FRC后，加入流式抗體CD45、CD31和PDPN，CD45-CD31-PDPN+為FRC群；在原代TECs中加入Cdh16抗體，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測TECs Cdh16的表達(dá)情況。

(4)免疫熒光檢測原代TECs AQP1的表達(dá)：將原代TECs接種到細(xì)胞爬片，多聚甲醛固定細(xì)胞，通透處理后加入AQP1抗體，AQP1為原代TECs特異性標(biāo)志物，再加入帶有熒光素標(biāo)記的二抗，綠色熒光即為AQP1陽性，為原代TECs。

(5)油紅染色鑒定FRC的干細(xì)胞特性：在FRC中加入成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對FRC進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)，培養(yǎng)FRC 14天后，采用油紅染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況，鑒定其成脂分化能力。

(6)TECs分組及干預(yù)：將TECs分為NC組、LPS組與LPS-FRC組。原代TECs培養(yǎng)6～7天，在匯合度達(dá)80%時(shí)，NC組細(xì)胞使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，LPS組細(xì)胞中加入10 μl LPS處理，LPS終濃度為50 μg/ml，LPS-FRC組將FRC和LPS刺激后的原代TECs用Transwell小室進(jìn)行共培養(yǎng)，各組均干預(yù)18 h后收樣，進(jìn)行后續(xù)檢測。

(7)流式細(xì)胞術(shù)檢測TECs JC-1單體百分比：3組原代TECs處理18 h后，用0.25%的胰酶消化，加入JC-1試劑，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測JC-1單體與聚合物的比例，對照組細(xì)胞的JC-1聚集在線粒體中形成二聚體，發(fā)出紅色熒光，受刺激后的TECs線粒體去極化，JC-1以單體的形式存在，產(chǎn)生綠色熒光。JC-1單體是膜電位變化的表現(xiàn)，所以JC-1單體百分比變化可代表膜電位變化。

(8)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測炎癥因子mRNA表達(dá)水平：用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的原代TECs，Trizol法提取RNA，采用NanoDrop儀器測定RNA濃度，取出1 μg RNA，應(yīng)用TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入IL-1和IL-6引物及SYBR Green試劑進(jìn)行擴(kuò)增，用2^-ΔΔCt法計(jì)算IL-1和IL-6的mRNA表達(dá)水平。

(9)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測蛋白表達(dá)水平：提取NC組、LPS組與LPS-FRC組的蛋白，裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA定量蛋白濃度，配置SDS page膠，上樣后進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，加入TBST稀釋的一抗(PARK、Pink1、HO-1)，搖床過夜，TBST清洗3次后孵育二抗，用化學(xué)發(fā)光行顯影和定影，檢測自噬相關(guān)蛋白(Pink1、PARKIN)及氧化應(yīng)激蛋白(HO-1)表達(dá)水平。

(10)CCK-8試劑盒檢測TECs活力：3組原代TECs處理18 h后，加入CCK-8溶液，37 ℃下孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值(OD值)，采用OD值表示細(xì)胞活力。

結(jié) 果

1.小鼠原代TECs提取及鑒定情況：光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠原代TECs呈梭形、鵝卵石鋪地狀(圖1A)。流式細(xì)胞儀檢測小鼠TECs Cdh16表達(dá)情況，與空白對照(Blank)相比，原代TECs的陽性峰明顯(圖1B)。免疫熒光檢測原代TECs AQP1的表達(dá)情況，提示所提取的細(xì)胞均為原代TECs(圖1C)。

圖1 小鼠原代TECs提取及鑒定情況[A:光學(xué)顯微鏡下原代TECs形態(tài)(×100)；B：流式細(xì)胞儀鑒定原代TECs；C：原代TECs AQP1的表達(dá)情況(AQP1：綠色；DAPI：藍(lán)色；免疫熒光染色，×200)]

2.小鼠FRC提取及鑒定情況：光學(xué)顯微鏡下觀察FRC形態(tài)為新月狀貼壁細(xì)胞(圖2A)。流式細(xì)胞儀檢測FRC表面標(biāo)志物(CD45、PDPN、CD31)、PDPN+CD31-占CD45-細(xì)胞的98.8%(圖2B)。用成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)FRC成脂分化，紅色為FRC分化的脂肪細(xì)胞，提示FRC具有成脂分化的干細(xì)胞特性(圖2C)。

圖2 小鼠FRC提取及鑒定情況[A:光學(xué)顯微鏡下FRC形態(tài)(×100)；B：流式細(xì)胞儀鑒定FRC：CD45、PDPN、CD31抗體標(biāo)記FRC，選取CD45-細(xì)胞進(jìn)一步畫十字門分析FRC水平，橫坐標(biāo)為CD31，縱坐標(biāo)為PDPN；C：FRC干細(xì)胞特性鑒定：成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)FRC，紅色為FRC分化為的脂肪細(xì)胞(油紅染色，×100)]

3.3組細(xì)胞IL-6、IL-1的mRNA表達(dá)水平及OD值比較：LPS組IL-6、IL-1的mRNA表達(dá)水平均高于NC組及LPS-FRC組，LPS-FRC組IL-6、IL-1的mRNA表達(dá)水平均高于NC組(P<0.05)。LPS組OD值低于NC組，LPS-FRC組OD值高于LPS組(P<0.05)。見表1。

表1 3組細(xì)胞IL-6、IL-1的mRNA表達(dá)水平及OD值 比較

4.3組細(xì)胞JC-1單體百分比比較：LPS組JC-1單體百分比(78.17±5.78)高于NC組(55.87±4.90)和LPS-FRC組(63.13±5.66)(P<0.05)。

5.3組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白和氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)水平比較：Western Blot結(jié)果顯示，和NC組比較，LPS組Pink 1、PARKIN、HO-1蛋白表達(dá)水平均增高；和LPS組相比，F(xiàn)RC-LPS組細(xì)胞Pink 1和PARKIN蛋白表達(dá)水平增加，HO-1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 Western Blot檢測TECs內(nèi)線粒體自噬相關(guān)蛋白(Pink 1、PARKIN)和氧化應(yīng)激蛋白(HO-1)的表達(dá)

表3 3組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

討 論

我國膿毒癥發(fā)病率高，易導(dǎo)致多器官功能障礙，如腎臟、腦、肺等[11]。腎臟是膿毒癥最容易影響的器官，約有50%膿毒癥患者發(fā)生AKI。單獨(dú)阻斷某一個(gè)分子并不能減緩炎癥反應(yīng)的總體進(jìn)程，因細(xì)胞可對多個(gè)分子或炎癥通路作出動態(tài)反應(yīng)，越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)向細(xì)胞療法。近年來間質(zhì)細(xì)胞引起廣泛關(guān)注[12]，與免疫細(xì)胞相比，間質(zhì)細(xì)胞具備強(qiáng)大的自我更新能力和免疫調(diào)節(jié)能力，可顯著提高膿毒癥小鼠的生存率[13]。本研究將FRC和原代TECs共培養(yǎng)，結(jié)果表明共培養(yǎng)可有效抑制TECs分泌炎癥因子，促進(jìn)TECs發(fā)生線粒體自噬，改善腎損傷。

在本研究中，我們提取了小鼠腸系膜脂肪來源的FRC，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定了FRC，結(jié)果和既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。FRC占淋巴結(jié)非造血結(jié)構(gòu)細(xì)胞的20%～50%[15]，是淋巴結(jié)的支撐結(jié)構(gòu)，分泌細(xì)胞外基質(zhì)[16]，將可溶性抗原和信號分子快速運(yùn)輸至淋巴結(jié)實(shí)質(zhì)[17]，并將漿細(xì)胞產(chǎn)生的IgM運(yùn)送到循環(huán)系統(tǒng)。在穩(wěn)態(tài)下，F(xiàn)RC為免疫細(xì)胞提供支持性微環(huán)境，為適應(yīng)性免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)[18]；當(dāng)病原菌感染時(shí)，F(xiàn)RC通過與臨近的免疫細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)先天性免疫和適應(yīng)性免疫。

本研究將FRC和LPS預(yù)處理的TECs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)FRC可抑制TECs分泌炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1的mRNA表達(dá)水平，增強(qiáng)TECs活力；通過應(yīng)用JC-1試劑盒檢測TECs的線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)FRC可降低JC-1單體百分比，促進(jìn)線粒體自噬蛋白Pink 1和PARKIN表達(dá)水平增高，氧化應(yīng)激蛋白HO-1表達(dá)水平降低，進(jìn)而促進(jìn)原代TECs發(fā)生線粒體自噬，改善腎損傷。線粒體在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原和鈣穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[19]。細(xì)胞器特異性自噬有利于細(xì)胞維持正常的結(jié)構(gòu)和功能，受損的線粒體形成雙層膜包裹成泡狀結(jié)構(gòu)，包裹線粒體，進(jìn)而被溶酶體中的水解酶消化。受損的線粒體會產(chǎn)生更多的活性氧(ROS)，而過量的ROS會對線粒體造成進(jìn)一步的損害[20]，線粒體自噬通路在AKI的發(fā)生發(fā)展和修復(fù)中具有重要作用。PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在化療藥物順鉑導(dǎo)致的腎臟毒性過程中可被激活，并對腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用[21]。此外線粒體自噬的PINK1-Parkin通路可通過抑制線粒體ROS和NLRP3炎性小體激活預(yù)防造影劑誘導(dǎo)的AKI[22]。在腎臟缺血再灌注的模型中，以線粒體自噬的方式清除受損線粒體可緩解腎損傷[23]。

綜上，F(xiàn)RC可減少TECs分泌炎癥因子，促進(jìn)TECs線粒體自噬，緩解腎損傷，基于FRC的細(xì)胞療法為膿毒癥AKI的治療提供了新思路。