李莉峰，劉曉輝

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學院 食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122099）

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌[1]，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學、科研方面有著廣泛應用。副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）是一類兼性厭氧菌[2-3]、不運動、無芽孢的桿菌或長桿菌，單個或成對出現(xiàn)，屬革蘭氏陽性菌，過氧化氫酶陰性；菌落呈乳白色，為圓形，直徑大多1.0 mm以上，表面光滑、隆起，邊緣整齊。副干酪乳桿菌是近年來國外研究較多的一種益生乳酸細菌，發(fā)酵葡萄糖主要產(chǎn)生L-乳酸[2-3]，廣泛用于傳統(tǒng)發(fā)酵乳、發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵豆制品、發(fā)酵魚制品等。副干酪乳桿菌在體外和體內(nèi)都具有較強的抗氧化能力，具有優(yōu)良的發(fā)酵特性和多種益生特性[4]，王英等[5]研究副干酪乳桿菌FM-LP-4 菌株在泡菜和酸奶發(fā)酵中的應用，結(jié)果表明，副干酪乳桿菌FM-LP-4發(fā)酵的蔬菜，其感官評分高于自然發(fā)酵蔬菜。與自然發(fā)酵蔬菜相比，縮短蔬菜的發(fā)酵時間，大大降低亞硝酸鹽含量，提高發(fā)酵蔬菜的抗氧化能力，因此，副干酪乳桿菌在發(fā)酵蔬菜中可以廣泛利用。副干酪乳桿菌具有良好的環(huán)境脅迫耐受能力，可以在pH 3.0和7.0%鹽度下仍能夠保持良好的生長能力[6]。這也充分說明副干酪乳桿菌可以是很好的蔬菜發(fā)酵菌株。

保藏菌種是使菌種不生長、不死亡處于休眠狀態(tài)，也保持不被污染，不降低、不喪失其優(yōu)良性[7]。菌種基本保藏方法有[8-11]：①低溫定期移植保藏法、②液體石蠟保藏法、③冷凍干燥保藏法和④液氮超低溫保藏法。其中第①種低溫定期移植保藏法中的斜面培養(yǎng)由于斜面培養(yǎng)基與空氣接觸面大不適合培養(yǎng)兼性厭氧菌；液體培養(yǎng)必須用試管架豎直擺放，保藏占用的空間較大；穿刺培養(yǎng)在菌種活化時不是很方便操作；再者由于乳酸菌產(chǎn)酸，保藏一段時間會被乳酸滅活，保藏時間短[12-13]，通常2～3個月就得傳代轉(zhuǎn)管，菌種傳代頻繁，菌種變異頻率較高，活力減弱[14]。第②種液體石蠟保藏操作復雜，不適合中小企業(yè)應用。第③和第④種保藏方法技術(shù)含量高，設備投入高，運行成本高，只適合專業(yè)保藏機構(gòu)使用，不適合生產(chǎn)企業(yè)使用?；谝陨显蚣毙柩芯恳环N適合企業(yè)使用的簡單方便的菌種保藏方法。

為了適應發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)企業(yè)菌種保藏，本研究采用白菜幫顆粒作為菌種保藏載體，探討白菜幫顆粒滅菌時間，在單因素試驗基礎上，通過響應面法優(yōu)化改良MRS培養(yǎng)基配方。旨在為發(fā)酵蔬菜廠家（如酸菜廠、泡菜廠）提供一種操作簡單實用、保藏時間長、菌種質(zhì)量穩(wěn)定可靠、保藏成本低的乳酸菌菌種保藏方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）：本實驗室保藏；白菜：購于超市。

1.1.2 化學試劑

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、檸檬酸二銨、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈉、瓊脂：國藥集團化學試劑有限公司。試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[15]、馬丁氏培養(yǎng)基[15]、改良MRS培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 儀器與設備

SX-500型全自動高溫高壓滅菌鍋：日本TDMYKOGYO公司；SHP-150恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏設備有限公司；Z-16PK高速離心機：美國Sigma公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州進化設備有限公司；JA2003電子分析天平：上海越平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基質(zhì)滅菌時間的選擇

由于本研究主要是給北方酸菜廠提供乳酸菌菌種保藏方法，又因白菜幫內(nèi)部含有大量微管束，內(nèi)表面積大，利于吸附微生物細胞，是一種理想菌種保藏包埋劑。故采用白菜幫作為菌種保藏載體。為了保有白菜幫的吸附能力，白菜幫顆粒滅菌時間不能太長，不能直接入MRS培養(yǎng)基中一起滅菌，所以首先確定載體白菜幫顆粒滅菌時間。將滅菌白菜幫顆粒和MRS培養(yǎng)基[14]混合再培養(yǎng)菌種，這就需要確定白菜幫顆粒的滅菌時間。

把白菜幫切成＜0.5 cm3小顆粒，洗凈，晾干表面水分，放入三角瓶中在121 ℃，滅菌3 min、5 min、7 min、9 min、12 min、15 min，將滅菌基質(zhì)顆粒在無菌條件下分別放入到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和液體馬丁氏培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液分別在37 ℃和28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h和72 h，采用平板計數(shù)法，看是否有雜菌生長，確定滅菌時間。

1.3.2 分析檢測

雜菌計數(shù)：平板計數(shù)法[15]；乳酸菌數(shù)的測定[16]：按國標GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》執(zhí)行。

1.3.3 改良MRS培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗

以MRS液體培養(yǎng)基為基礎，適量加入白菜幫顆粒。乳酸菌菌數(shù)為評價指標，采用單因素試驗確定蛋白胨（4 g/L、6g/L、8g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L），牛肉膏（4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L），葡萄糖（8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L、24 g/L、28 g/L），白菜幫顆粒（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L）4個因素的添加量。

1.3.4 改良MRS培養(yǎng)基配方優(yōu)化響應面優(yōu)化試驗[17-18]

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以蛋白胨（A）、葡萄糖（B）、牛肉膏（C）和白菜幫顆粒（D）添加量為影響因素，以乳酸菌菌數(shù)（Y）為響應值，通過Design-Expert 8.0.6軟件設計4因素3水平Box-Behnken響應面試驗。響應面試驗因素與水平見表1。

1.3.5 菌種保藏

上述培養(yǎng)好的菌種5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，把離心管的蓋子換成滅過菌的紗布塞，放入干燥箱42 ℃干燥2 h，然后無菌條件下轉(zhuǎn)入無菌EP管，每個管里放入2粒培養(yǎng)好的白菜幫顆粒，置于冰箱中于4 ℃或-18 ℃保藏，每年檢測乳酸菌菌數(shù)，并做雜菌檢測，累計檢測5年。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)滅菌時間選擇

基質(zhì)滅菌時間對細菌和霉菌生長的影響，結(jié)果見表2。

表2 基質(zhì)滅菌時間對細菌和霉菌生長的影響Table 2 Effects of sterilization time of substrate on the growth of bacteria and mold

從表2可以看出，在121 ℃條件下滅菌9 min時，平皿中細菌和霉菌都不生長，此時白菜幫顆粒也能保持良好狀態(tài)，所以選擇9 min作為白菜幫顆?；|(zhì)滅菌時間。

2.2 改良MRS培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗

改良MRS培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗結(jié)果見圖1。

圖1 改良MRS培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗結(jié)果Fig.1 Results of single factor experiments for modified MRS medium formula optimization

由圖1A可知，當?shù)鞍纂颂砑恿繛?～8 g/L時，乳酸菌數(shù)隨之增加；當?shù)鞍纂颂砑恿繛? g/L時，乳酸菌數(shù)最高達1.17×1010CFU/mL；當?shù)鞍纂颂砑恿繛?～14 g/L時，乳酸菌數(shù)隨之下降。因此，最適蛋白胨添加量為8 g/L。由圖1B可知，當牛肉膏添加量為4～8 g/L時，乳酸菌數(shù)隨之增加；當牛肉膏添加量為8g/L時，乳酸菌菌數(shù)最高達1.15×1010CFU/mL；當牛肉膏添加量為8～14 g/L時，乳酸菌數(shù)隨之下降。因此，最適牛肉膏添加量為8 g/L。由圖1C可知，當葡萄糖添加量為8～12 g/L時，乳酸菌數(shù)隨之增加；當葡萄糖添加量為12 g/L時，乳酸菌數(shù)最高達1.10×1010CFU/mL；當葡萄糖添加量為12～28 g/L時，乳酸菌數(shù)隨之下降。因此，最適葡萄糖添加量為12 g/L。由圖1D可知，當白菜幫顆粒添加量為10～25 g/L時，乳酸菌數(shù)隨之增加；當白菜幫顆粒添加量為25 g/L時，乳酸菌數(shù)最高達1.15×1010CFU/mL；當白菜幫顆粒添加量為25～35 g/L時，乳酸菌數(shù)隨之下降。因此，最適白菜幫顆粒添加量為25 g/L。這個結(jié)果與李小艷等[23-24]的結(jié)果基本一致。

2.3 改良MRS培養(yǎng)基配方優(yōu)化響應面試驗

2.3.1 響應面法優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎上，以蛋白胨（A）、葡萄糖（B）、牛肉膏（C）和白菜幫顆粒（D）添加量為影響因素，以乳酸菌菌數(shù)（Y）為響應值，運用Box-Benhnken 設計29 組試驗。Box-Benhnken 試驗設計及結(jié)果見表3。

表3 改良MRS培養(yǎng)基配方優(yōu)化Box-Benhnken試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Benhnken experiments for modified MRS medium formula optimization

續(xù)表

用Design-Expert 8.0.6軟件對表3的結(jié)果進行多元回歸擬合，得到的回歸方程為：Y=+117.65+2.70A+2.37B+1.60C+1.58D+2.10AB-0.20AC+1.17AD+0.35BC+0.49BD-0.66CD-4.94A2-3.07B2-3.99C2-3.68D2

2.3.2 響應面試驗結(jié)果回歸模型方差分析

響應面試驗結(jié)果回歸模型方差分析見表4。由表4可知，該回歸模型P＜0.000 1，表明試驗所采取的二次模型極顯著，失擬項的P=0.502 2＞0.05，模型失擬項不顯著，表明該模型在統(tǒng)計學上是有意義的[19-20]。該模型的決定系數(shù)R2=0.956 9，校正決定系數(shù)R2adj=0.913 8，說明試驗的實際值和預測值擬合度比較好[21-22]。從P值結(jié)果可知，一次項A、B、C、D，二次項A2、B2、C2、D2，交互項AB對乳酸菌數(shù)的影響均達到極顯著水平（P＜0.01）。從F值結(jié)果可知，影響乳酸菌數(shù)的順序為蛋白胨添加量＞葡萄糖添加量＞牛肉膏添加量＞白菜幫顆粒添加量。

表4 Box-Benhnken試驗結(jié)果的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model for Box-Benhnken experiments

2.3.3 響應面交互作用分析

采用Design-Expert8.0.6軟件繪制各因素兩兩之間交互作用響應面及等高線見圖2。

圖2 各因素交互作用對乳酸菌數(shù)影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the number of lactic acid bacteria

響應面曲面傾斜程度表示各因素對響應值的影響程度，二者成正比關系[23-24]；從等高線的形狀中可觀察交互效應強弱程度，橢圓則為交互作用顯著，圓形為交互作用不顯著[25]。由圖2可知，AB等高線基本接近橢圓形，故葡萄糖蛋白胨兩因素之間交互作用對乳酸菌數(shù)影響顯著，其他各因素兩兩之間對乳酸菌數(shù)影響不顯著。這結(jié)果與表4中結(jié)果回歸方程模型分析的結(jié)果一致，這充分說明此回歸方程模型可信。

2.3.4 驗證試驗

響應面試驗結(jié)果最佳改良MRS培養(yǎng)基配方為：蛋白胨8.85 g/L，葡萄糖14.27 g/L，牛肉膏8.38 g/L，白菜幫顆粒26.52g/L。在此條件下，乳酸菌數(shù)理論值為119.28×108CFU/mL。為了方便實際操作，將改良MRS培養(yǎng)基配方調(diào)整為：蛋白胨9 g/L，葡萄糖14 g/L，牛肉膏8 g/L，白菜幫顆粒25 g/L，按此優(yōu)化條件進行3次平行驗證試驗，測得乳酸菌數(shù)實際值為119.87×108CFU/mL，與預測值的相對誤差為0.49%，說明方程擬合較好，響應面優(yōu)化得到的培養(yǎng)基配方參數(shù)準確，具有實用價值。

2.4 菌種保藏結(jié)果

由圖3可知，4 ℃冷藏條件下3年內(nèi)乳酸菌菌數(shù)為50×108CFU/mL以上，在-18 ℃冷凍條件下乳酸菌菌數(shù)5年內(nèi)還能達到50×108CFU/mL，-18 ℃冷凍條件保藏菌種優(yōu)越于4 ℃冷藏保存。兩種溫度保藏的乳酸菌菌種均沒有檢出雜菌。這兩種溫度下保藏乳酸菌菌種都適用于蔬菜發(fā)酵企業(yè)生產(chǎn)應用。

圖3 不同保藏時間對乳酸菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of different preservation time on lactic acid bacteria

3 結(jié)論

生產(chǎn)菌種保藏對發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)有重要的意義，本試驗通過對副干酪乳桿菌培養(yǎng)載體的滅菌時間的確定和改良MRS培養(yǎng)基配方的響應面優(yōu)化，得出培養(yǎng)基質(zhì)白菜幫顆粒滅菌時間為9 min，最佳培養(yǎng)基配方為白菜幫顆粒25g/L、蛋白胨9 g/L、牛肉膏8 g/L、葡萄糖14 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、酵母膏5 g/L、乙酸鈉2 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L、蒸餾水1 L。在上述培養(yǎng)基條件下副干酪乳桿菌的菌數(shù)為1.19×1010CFU/mL。

此方法保藏副干酪乳桿菌于冰箱中，1～4 ℃冷藏可保藏3～4年，-16～-20 ℃冷凍可保藏4～5年。此方法簡單易于操作又可以長期保持乳酸菌，適合發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)企業(yè)乳酸菌菌種保藏。