蘇涌，張蕊，劉加濤，宋帥，葛朝亮，馮麗娟，許杜娟

作者單位：安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，a藥劑科，b中醫(yī)藥管理局中藥化學三級實驗室，安徽 合肥 230022

侵襲性真菌感染是腎移植術后常見的感染類型，腎移植術后5 年侵襲性真菌感染發(fā)生率高達35.3%，且其中近30%的真菌感染高危病人曾使用抗真菌藥物預防性治療［1-2］。真菌感染死亡率高達22.3%，侵襲性肺真菌病的死亡率甚至達到40%～100%，是導致腎移植病人死亡的主要原因之一［1-4］。如何提高腎移植病人抗真菌預防及治療效果是臨床急需解決的問題。

伏立康唑（VRCZ）是腎移植術后首選的抗真菌藥物之一，血藥濃度決定了其療效及毒副作用的產生［5-6］，最新的指南［7］建議VRCZ 血漿谷濃度下限應>0.5 mg/L，上限應<5.0 mg/L。VRCZ 的代謝為非線性藥代動力學，主要經細胞色素氧化酶P450 2C19（CYP2C19）在肝臟代謝生成無活性的伏立康唑氮氧化物（VRCZ N-oxide），隨后經腎臟排泄。腎移植病人需長期服用糖皮質激素類藥物潑尼松，其同類藥物地塞米松等可顯著加速伏立康唑的代謝，降低后者的血藥濃度［8-9］。潑尼松為前體藥物，在體內代謝為活性形式潑尼松龍發(fā)揮作用［10］。潑尼松龍是否同樣影響腎移植病人VRCZ的代謝？基于此假設，我們擬建立一種快速準確的高效液相色譜法（HPLC）同時檢測潑尼松龍、VRCZ 及其主要代謝產物VRCZ N-oxide 的濃度，用以評估潑尼松聯(lián)用對VRCZ代謝的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters2695 高效液相色譜儀（配備Wa?ters2489紫外檢測器，美國）；FA2104電子天平（上海天平儀器廠）；25BTS電子天平（德國塞多利斯公司）；5430R冷凍高速離心機（德國艾本德公司）；渦旋振蕩器（江蘇其林貝爾儀器公司）；氮吹儀（EYELA，日本）。

1.2 試藥VRCZ 對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號201402，純度99.7%）；潑尼松龍對照品（上海源葉生物，批號B25645，純度>98%）；VRCZ N-ox?ide 對照品（加拿大TRC，批號4-FB1-47-4，純度>99%）；乙酸乙酯（上海潤捷，分析純）；正己烷（無錫展望化工試劑，分析純）；甲醇、乙腈（Tedia，色譜純）；滅菌注射用水（四川科倫）。空白血漿來源于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院體檢中心。

2 方法

2.1 色譜條件安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6×250 mm，5μm），流動相為乙腈∶水（27∶73～60∶40），梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長為244 nm；柱溫為30 ℃；進樣量20μL。

2.2 溶液配制精密稱取潑尼松龍、VRCZ及VRCZ N-oxide對照品，甲醇稀釋，分別配制成濃度為10 mg/L、1 mg/mL 及1 mg/mL 的貯備液，置于-80 ℃超低溫冰箱內保存?zhèn)溆?，使用前甲醇稀釋至所需濃度?/p>

2.3 樣品處理取空白血漿360μL（EDTA抗凝），分別加入潑尼松龍對照溶液20μL、VRCZ 及VRCZ Noxide對照溶液各10μL，渦旋混勻30 s，加入萃取液乙酸乙酯800μL、正己烷200μL，渦旋2 min，5 000g離心5 min，取上層有機相。下層血漿再次加入萃取液，重復上述萃取步驟，合并兩次有機相于50 ℃氮氣下吹干，加100μL 流動相渦旋2 min 復溶，12 000g離心10 min，取上清液20μL進樣。

2.4 方法學驗證

2.4.1方法專屬性 6 個不同個體的空白血漿，按“2.3”項下處理（不加入對照液），考察方法專屬性。

2.4.2標準曲線 分別于空白血漿中加入不同濃度對照品工作液，使?jié)娔崴升埥K濃度為100μg/L、75μg/L、25μg/L、12.5μg/L、6.25μg/L、3.13μg/L，VRCZ終濃度為20 mg/L、15 mg/L、5 mg/L、2.5 mg/L、0.625 mg/L、0.16 mg/L，VRCZ N-oxide終濃度為10 mg/L、7.5 mg/L、2.5 mg/L、1.25 mg/L、0.625 mg/L、0.16 mg/L。檢測樣品，分別以對應樣品峰面積（X）對潑尼松龍濃度（C1）、VRCZ濃度（C2）及VRCZ N-oxide（C3）作線性方程。

2.4.3精密度、回收率及穩(wěn)定性考察 分別配制潑尼松龍濃度為75 μg/L、12.5 μg/L、6.25 μg/L、3.13μg/L（定量限），VRCZ 濃度為15 mg/L、2.5 mg/L、0.625 mg/L、0.16 mg/L（定量限），VRCZ N-oxide 濃度為7.5 mg/L、1.25 mg/L、0.625 mg/L、0.16 mg/L（定量限）的甲醇溶液及含藥血漿。甲醇溶液直接進樣，含藥血漿處理后進樣。以含藥血漿峰面積與甲醇溶液相應峰面積的比值表示絕對回收率，含藥血漿計算濃度與加入濃度的比值為相對回收率。含藥血漿處理后于同一天內平行測定5 次，計算得日內RSD；連續(xù)3 d 測定5 次，計算得日間RSD。進樣器內放置24 h或-80 ℃下反復凍融3次再進行處理，平行測定5次，考察穩(wěn)定性。

2.5 病人血藥濃度檢測收集2019 年9 月至2020年3 月在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院，接受VRCZ治療的腎移植病人24例，男14例、女10例，年齡范圍為23～64 歲，體質量范圍為38～85 kg。潑尼松劑量為每日1次10 mg口服，VRCZ 劑量為每12小時1 次，每次200 mg，靜脈滴注或口服。病人接受VRCZ 治療時間均大于5 d，血漿VRCZ 已達穩(wěn)態(tài)，測定病人血漿谷濃度。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

2.6 統(tǒng)計學方法計量資料用±s表示，單因素方差分析或χ2檢驗用于組間差異分析，Spearman相關性分析用于評估數據間的相關性，線性回歸用于評估數據間的線性關系，檢驗顯著性水平P<0.05。

3 結果

3.1 專屬性實驗上述色譜條件下潑尼松龍、VR?CZ 及VRCZ N-oxide 分離良好，無內源性物質干擾。VRCZ N-oxide 保留時間為10.05 min，潑尼松龍為11.76 min，VRCZ為17.43 min，見圖1。

注：1—伏立康唑氮氧化物；2—潑尼松龍；3—伏立康唑。

3.2 線性關系考察以各對照品峰面積（X）對血漿濃度（C）進行線性回歸，分別得到線性方程為：C1=0.007 1X-1.844 6（r=0.993 1）、C2=1E-05X-0.073 1（r=0.999 8）、C3=8E-06X-0.352 2（r=0.997 3）。結果表明，潑尼松龍、VRCZ及VRCZ N-oxide分別在100～3.13μg/L、20～0.16 mg/L和10～0.16 mg/L濃度范圍內線性良好。

3.3 精密度及回收率實驗潑尼松龍、VRCZ 及VRCZ N-oxide 日內和日間精密度RSD 在1.93%～6.74%，絕對回收率在65.48%～86.86%，表明該方法重復性較好，見表1。

表1 精密度及回收率實驗結果

3.4 穩(wěn)定性考察VRCZ 血漿按“2.3”項下處理后進樣器放置24 h 或-80 ℃下反復凍融3 次再進行處理，結果顯示潑尼松龍、VRCZ 及VRCZ N-oxide 穩(wěn)定性較好，見表2。

表2 穩(wěn)定性實驗結果/±s

表2 穩(wěn)定性實驗結果/±s

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3.5 病人血藥濃度測定24例腎移植病人血藥濃度檢測結果顯示病人血漿VRCZ濃度范圍在0.17～5.44 mg/L，個體差異較大。潑尼松龍、VRCZ N-oxide濃度范圍分別在7.75～72.75 μg/L 及0.66～3.06 mg/L，見表3。

表3 腎移植24例基本信息

3.6 病人血藥濃度影響因素分析探討VRCZ 及其代謝產物之間的關系，以VRCZ 及VRCZ N-oxide濃度做散點圖，未發(fā)現(xiàn)兩者存在明顯的關聯(lián)性。進一步以VRCZ、VRCZ/VRCZ N-oxide 濃度的比值（以下簡稱比值）做線性回歸，結果發(fā)現(xiàn)VRCZ 與該比值之間存在較強的線性關系，提示該比值可用于VRCZ代謝速度的評估。Spearman檢驗結果顯示潑尼松龍濃度與VRCZ 濃度、比值之間未見相關性，但與VR?CZ N-oxide 濃度之間存在相關性，P=0.023。根據潑尼松龍的百分位數間距，將其分為低濃度組（<27μg/L）、中濃度組（27～42 μg/L）、高濃度組（>42 μg/L），評估不同組間VRCZ 代謝的情況，結果顯示不同組間性別、年齡、體質量無差異，見表4。隨著潑尼松龍濃度升高，VRCZ 及其代謝產物濃度均有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，比值未見明顯變化，提示潑尼松龍不同濃度對VRCZ代謝無明顯影響。

表4 不同潑尼松龍濃度組間性別、年齡、體質量的比較

4 討論

VRCZ 在 肝 臟 主 要 經CYP2C19、CYP3A4 及CYP2C9代謝，CYP2C19是其最主要的代謝酶。VR?CZ 經CYP2C19代謝后，主要生成無抗菌活性的VR?CZ N-oxide，約占其代謝產物的72%［11］。根據代謝活力的不同，可將CYP2C19 分為快代謝型（UM）、正常代謝型（EM）、中間代謝型（IM）以及慢代謝型（PM）［12］。CPIC 指南提示EM 及IM 病人建議VRCZ的劑量為每12 小時1 次，每次為200 mg，而UM 及PM 則可以考慮更換其他抗真菌藥物［13］。我們前期臨床工作中發(fā)現(xiàn)腎移植病人VRCZ 血藥濃度偏低，約19%的病人濃度低于0.5 mg/L。同時腎移植病人群體藥動學研究發(fā)現(xiàn)，對于CYP2C19 為EM 型的腎移植病人，建議其VRCZ劑量為每12小時1次，每次為300 mg，高于正常推薦劑量［14］，與我們臨床觀察的結果相似，提示腎移植病人VRCZ代謝較快。

移植術后由于抗排斥反應的需要，病人需長期使用他克莫司+霉酚酸+潑尼松三聯(lián)免疫抑制方案。文獻報道指出CYP2C19 啟動子-1 750/-1 736 bp 區(qū)域含有糖皮質激素反應元件（GRE）。糖皮質激素受體（GR）與配體結合后，可與GRE 相互作用，調節(jié)靶基因的轉錄。在肝HepG2 細胞中，地塞米松可通過激活GR 上調CYP2C19 的表達［15］，其與VRCZ 聯(lián)用后，VRCZ 清除率上升41%［8-9］。我們推測腎移植病人VRCZ代謝加快可能與聯(lián)用潑尼松有關。

本研究中通過HPLC 法，以乙腈和水為流動相，梯度洗脫，基線穩(wěn)定，色譜峰分離良好，目標物質保留時間處無內源性干擾。預實驗中曾嘗試使用Kro?masil C18、Dimaonsil C18 及Hypersil ODS 色譜柱，結果顯示潑尼松龍保留時間處有明顯內源性物質干擾峰，調整流動相比例無法將兩者分離。腎移植病人潑尼松服用量較小，潑尼松龍濃度較低，需要大量樣本濃縮以滿足檢測需要。在預實驗過程中曾選擇固相萃取小柱進行樣本的濃縮和純化，但由于樣本量較大，血漿中物質成分復雜，導致目標物質回收率較低，部分樣本甚至出現(xiàn)無法保留的現(xiàn)象，目標物質回收不穩(wěn)定。改用萃取法后，可獲得較穩(wěn)定的回收率。

VRCZ 為非線性藥代動力學，其原型藥物濃度與其代謝產物間未見直接的相關性，但VRCZ 與VRCZ/VRCZ N-oxide 的比值具有較強的線性關系，與文獻報道一致［11，16］，提示該比值可用于VRCZ 代謝強度的評估。本次研究發(fā)現(xiàn)隨著潑尼松龍濃度升高，VRCZ 與VRCZ N-oxide 的比值未見明顯變化，提示潑尼松龍對VRCZ 的代謝并沒有顯著影響。但VRCZ 及其氮氧化濃度均有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學意義，同時相關性檢驗結果提示潑尼松龍濃度與伏立康唑氮氧化物濃度存在相關性，提示潑尼松龍與VRCZ 的代謝存在著相似的變化趨勢，這可能是病人肝臟整體代謝能力的個體差異，從而導致數據上的趨勢性，并不能證實潑尼松龍濃度對VRCZ 代謝存在影響。

VRCZ 的代謝受到病人年齡、肝功能以及CYP2C19 基因型等多種因素的影響［17-18］。本研究納入病人的老年病人較少，因此未觀察年齡對VRCZ代謝的影響，同時未納入病人肝功能等指標，是本課題的不足之處。

《伏立康唑個體化治療指南》已明確指出糖皮質激素與VRCZ 聯(lián)用時，應密切監(jiān)測療效及安全性，地塞米松、甲潑尼龍等對VRCZ 代謝的誘導作用已有明確報道，目前認為潑尼松龍對VRCZ 代謝的影響小于地塞米松，但具體作用尚不明確［8-9，19］。本研究中未發(fā)現(xiàn)腎移植病人潑尼松龍濃度對VRCZ 代謝的影響，與之前的報道相近。但潑尼松龍濃度與伏立康唑氮氧化物之間存在相關性，仍提示潑尼松龍濃度對VRCZ 的代謝具有一定指示性作用，在群體藥動學研究中將其納入到群體模型中，可能會提高群體模型的準確性。同時本研究的樣本數量較少，仍需要大樣本的病人數據，在明確病人CYP2C19 基因型的情況下，探討VRCZ與潑尼松之間相互作用。