田春陽，張萌，夏永欣，張向東

作者單位：南陽市中心醫(yī)院消化科二病區(qū)，河南 南陽 473000

結(jié)腸癌是臨床常見的一種消化道惡性腫瘤，其常發(fā)生于大腸底部與直腸內(nèi)，環(huán)境、遺傳因素及基因改變均可能影響結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展，目前臨床主要采用手術(shù)與化療等方式進行治療，但術(shù)后病人易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等情況，近年來，結(jié)腸癌發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重威脅人類生命安全，因而尋找有效的治療方法成為研究重點［1-2］。中藥具有毒副作用小等特點，近年來，中藥提取物在結(jié)腸癌等腫瘤治療過程中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于其作用機制仍未完全闡明［3-4］。茶葉具有抗癌等作用，其中茶黃素（TF）是其主要成分，并可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［5］。但TF對結(jié)腸癌的治療效果及其作用機制尚未闡明。環(huán)狀RNA-叉頭框蛋白3（circ-Foxo3）在食管癌細(xì)胞中表達水平降低，可抑制細(xì)胞增殖及促進細(xì)胞凋亡［6］。但circ-Foxo3 是否可介導(dǎo)TF 抗結(jié)腸癌的過程尚未可知。因此，2018年10月至2019年12月，本研究主要探討TF是否可調(diào)控circ-Foxo3影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡。

1 資料與方法

1.1 一般資料TF 購自成都格純生物醫(yī)藥有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8購自美國ATCC 細(xì)胞庫；Li?pofectamine2000 購自美國Invitrogen 公司；抑制物（si-NC）、抑制circ-Foxo3（si-circ-Foxo3）購自廣州銳博生物科技有限公司；空載體（pcDNA）、過表達circ-Foxo3（pcDNA-circ-Foxo3）購自武漢淼靈生物科技有限公司；MTT、膜聯(lián)蛋白V-FITC/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）法凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；兔抗人細(xì)胞核增殖抗原-67（Ki-67）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、活化胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）抗體購自美國Santa Cruz 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1實驗分組 HCT-8 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期HCT-8 細(xì)胞接種于96 孔板（5×103個/孔），分別加入不同濃度（15μmol/L、25μmol/L、50μmol/L）的TF 處理24 h［7］，分別記作TF-L 組、TF-M 組、TF-H 組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con 組。按照Lipo?fectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將pcDNA、pcD?NA-circ-Foxo3 轉(zhuǎn)染至HCT-8 細(xì)胞，分別記作pcDNA組、pcDNA-circ-Foxo3 組。分 別 將si-NC、si-circ-Foxo3 轉(zhuǎn)染至HCT-8 細(xì)胞，加入含有濃度為50μmol/L TF 的培養(yǎng)基處理24 h，分別記作TF-H+si-NC 組、TF-H+si-circ-Foxo3組。

1.2.2MTT 法檢測細(xì)胞增殖 收集各組HCT-8 細(xì)胞（1×105個/毫升）接種于96 孔板（每孔100μL），每孔加入MTT 溶液20 μL，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO（每孔150μL），室溫震蕩孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔在波長為490 nm 處的吸光度值。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 HCT-8細(xì)胞加入預(yù)冷PBS 洗滌后棄上清，加入500 μL 結(jié)合緩沖液，參照凋亡檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4qRT-PCR 檢測細(xì)胞中circ-Foxo3 的表達水平 采用Trizol 法提取HCT-8 細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補DNA（cDNA）。qRT-PCR 反應(yīng)與反應(yīng)體系均按照試劑盒說明書操作并檢測circ-Foxo3相對表達量。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法檢測Ki-67、PCNA、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3 蛋白表達 各組HCT-8 細(xì)胞加入400 μL RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，SDSPAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入一抗稀釋液（1∶1 000）與二抗稀釋液（1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，總體有差異進一步采用SNK-q檢驗進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TF 對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8 增殖的影響與Con組比較，TF-L 組、TF-M 組、TF-H 組細(xì)胞存活率及Ki-67、PCNA 蛋白水平降低（P<0.05），且TF-L 組、TF-M組、TF-H 組各指標(biāo)比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1，圖1。

表1 茶黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8增殖的影響/±s

表1 茶黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8增殖的影響/±s

注：Ki-67為細(xì)胞核增殖抗原-67，PCNA為增殖細(xì)胞核抗原。①與Con組比較，P<0.05。②與TF-L組比較，P<0.05。③與TF-M組比較，P<0.05。

?

圖1 Western blotting檢測Ki-67、PCNA蛋白表達

2.2 TF 對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8 凋亡及circ-Foxo3 表達量的影響與Con組比較，TF-L組、TF-M組、TF-H組凋亡率及Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白水平降低（P<0.05），且TF-L 組、TF-M 組、TF-H 組各指標(biāo)比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與Con 組比較，TF-L 組、TF-M 組、TF-H組circ-Foxo3 的表達水平升高（P<0.05），且TF-L 組、TF-M 組、TF-H 組間circ-Foxo3 的表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2，圖2。

圖2 茶黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8凋亡的影響：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；B為Western blotting檢測Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達

表2 茶黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8凋亡及circ-Foxo3表達量的影響/±s

表2 茶黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8凋亡及circ-Foxo3表達量的影響/±s

注：Bcl-2 為B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，Bax 為Bcl-2 相關(guān)X 蛋白，Cleaved Caspase-3 為剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3，circ-Foxo3為環(huán)狀RNA-叉頭框蛋白3。①與Con組比較，P<0.05。②與TF-L組比較，P<0.05。③與TF-M組比較，P<0.05。

?

2.3 circ-Foxo3 過表達對HCT-8 細(xì)胞增殖及凋亡的影響與pcDNA 組比較，pcDNA-circ-Foxo3 組細(xì)胞存活率及Ki-67、PCNA、Bcl-2 蛋白水平降低（P<0.05），凋亡率及Bax、Cleaved Caspase-3 蛋白水平升高（P<0.05），見表3，圖3。

圖3 circ-Foxo3過表達對HCT-8細(xì)胞增殖及凋亡的影響：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；B為Western blotting檢測Ki-67、PCNA、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達

表3 circ-Foxo3過表達對HCT-8細(xì)胞增殖及凋亡的影響/±s

表3 circ-Foxo3過表達對HCT-8細(xì)胞增殖及凋亡的影響/±s

注：pcDNA 為空載體，pcDNA-circ-Foxo3 為過表達circ-Foxo3，circ-Foxo3 為環(huán)狀RNA-叉頭框蛋白3，Ki-67 為細(xì)胞核增殖抗原-67，PCNA 為增殖細(xì)胞核抗原，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，Cleaved Caspase-3為剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3。

?

2.4 干擾circ-Foxo3表達可降低TF 對HCT-8細(xì)胞增殖的作用與TF-H+si-NC 組比較，TF-H+si-circ-Foxo3 組細(xì)胞存活率及Ki-67、PCNA 蛋白水平升高（P<0.05），見表4。

表4 干擾circ-Foxo3表達可降低茶黃素對HCT-8細(xì)胞增殖的作用/±s

表4 干擾circ-Foxo3表達可降低茶黃素對HCT-8細(xì)胞增殖的作用/±s

注：TF-H+si-NC 為高濃度茶黃素+抑制物si-NC，TF-H+si-circ-Foxo3為高濃度茶黃素+抑制物circ-Foxo3，circ-Foxo3為環(huán)狀RNA-叉頭框蛋白3，Ki-67為細(xì)胞核增殖抗原-67，PCNA為增殖細(xì)胞核抗原。

?

2.5 干擾circ-Foxo3表達可降低TF 對HCT-8細(xì)胞凋亡的作用與TF-H+si-NC 組比較，TF-H+si-circ-Foxo3組凋亡率及Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平降低（P<0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P<0.05），見表5。

表5 干擾circ-Foxo3表達可降低茶黃素對HCT-8細(xì)胞凋亡的作用/±s

表5 干擾circ-Foxo3表達可降低茶黃素對HCT-8細(xì)胞凋亡的作用/±s

注：TF-H+si-NC 為高濃度茶黃素+抑制物si-NC，TF-H+si-circ-Foxo3 為高濃度茶黃素+抑制物circ-Foxo3，Bcl-2 為B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，Bax 為Bcl-2 相關(guān)X 蛋白，Cleaved Caspase-3 為剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3。

?

3 討論

中藥提取物可通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移從而發(fā)揮抗癌作用，但關(guān)于其作用機制尚未完全闡明，circRNA 在結(jié)腸癌發(fā)生過程中表達異常并可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)過程從而發(fā)揮作用，同時circRNA 還可能作為結(jié)腸癌靶向治療的潛在靶點［8-11］。

TF 可抑制卵巢癌、卵巢癌干細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［12-14］。紅茶TF 與茶紅素還可抑制結(jié)腸癌、肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲［15］。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示不同劑量的TF處理后結(jié)腸癌細(xì)胞存活率降低，凋亡率明顯升高，且呈劑量依賴性，提示TF可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及促進細(xì)胞凋亡。研究表明Ki-67、PCNA在腫瘤中表達水平升高，并可參與細(xì)胞周期過程從而促進細(xì)胞增殖［16］。Bcl-2表達上調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡，Bax表達上調(diào)可促進線粒體釋放細(xì)胞色素C 而促進Caspase-3 磷酸化形成Cleaved Caspase-3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。本研究結(jié)果顯示不同劑量的TF 處理后結(jié)腸癌細(xì)胞中Ki-67、PCNA、Bcl-2 的表達水平降低，Bax、Cleaved Caspase-3 的表達水平升高，且呈劑量依賴性，進一步證實TF可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗癌作用。

circ-Foxo3 在急性髓細(xì)胞性白血病中表達水平降低，并可能作用判斷病人預(yù)后的輔助指標(biāo)［18］。circ-Foxo3在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達水平降低，并可能通過調(diào)控miR-23a/PTEN 分子軸從而抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的進展［19］。circ-Foxo3 在尿路上皮癌中表達下調(diào)，并可能通過與miR-191-5p 相互作用而誘導(dǎo)尿路上皮癌細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示不同劑量的TF處理后結(jié)腸癌細(xì)胞中circ-Foxo3的表達水平升高，且隨著藥物劑量的增加而顯著升高，提示TF可能通過上調(diào)circ-Foxo3 的表達從而發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。本研究進一步分析顯示circ-Foxo3 過表達后結(jié)腸癌細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，并可抑制Ki-67、PCNA、Bcl-2的表達及促進Bax、Cleaved Caspase-3 的表達，提示circ-Foxo3 過表達可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及促進細(xì)胞凋亡。為探究TF 是否可通過調(diào)控circ-Foxo3的表達從而影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡，本研究將si-circ-Foxo3 轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞，使用TF處理細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力明顯增強，凋亡率明顯降低，提示干擾circ-Foxo3 表達可降低TF 對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用。

綜上所述，TF 可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及促進細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與上調(diào)circ-Foxo3 的表達有關(guān)，circ-Foxo3可能作為結(jié)腸癌靶向治療的潛在靶點，還可進一步揭示TF抗結(jié)腸癌的分子機制。