孫利平，宋亞玲，李春艷

作者單位：棗莊礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院兒科，山東 棗莊 277000

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種常見的肺部疾病，表現(xiàn)為肺容積減少、順應(yīng)性降低、通氣/血流量不平衡、急性和持續(xù)性肺部炎癥、彌漫性肺泡損傷，最終導(dǎo)致血氧不足和呼吸衰竭［1-2］。阿米卡星是一種常用的氨基糖苷類抗生素，其通過抑制蛋白質(zhì)合成，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁完整性，對革蘭陰性桿菌、青霉素耐藥金黃色葡萄球菌感染均具有較強(qiáng)的抗菌作用［3］。文獻(xiàn)資料顯示，阿米卡星和頭孢他啶的聯(lián)用可有效降低單獨(dú)用藥帶來的并發(fā)癥和不良反應(yīng)，對社區(qū)獲得性肺炎病人療效顯著［4-5］。此外，阿米卡星和頭孢地嗪聯(lián)用還可明顯抑制肺炎克雷伯氏菌感染引起的胸腺細(xì)胞凋亡［6］。然而，阿米卡星對急性肺損傷是否具有保護(hù)作用尚未可知。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞外膜重要組成部分，其通過激活機(jī)體免疫細(xì)胞刺激宿主細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。目前，LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞已被廣泛用于急性肺損傷機(jī)制研究［7-8］。本研究通過探討阿米卡星對LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)的影響，初步探索其可能分子機(jī)制，以期為阿米卡星在ALI中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料大鼠肺泡上皮細(xì)胞、Ham's F-12K培養(yǎng)液購于武漢普諾賽生命科技有限公司；脂多糖購于美國Sigma 公司；阿米卡星（?？道噬锟萍加邢薰?，CAS 號37517-28-5，純度≥98%）；miR-223 模擬物（mimics）及其對照（miR-NC）、miR-223 抑制物（anti-miR-223）及其對照（anti-miR-NC）由上海生工公司提供；膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、免疫沉淀裂解緩沖液、硝酸纖維素膜、二喹啉甲酸（Bicin?choninic acid，BCA）、Trizol 法試劑盒購于上海碧云天公司；兔源裂解的胱天蛋白酶3（cl-caspase3）抗體、胱天蛋白酶3 前體（pro-caspase3）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、山羊抗兔IgG 二抗購于上海艾博抗公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor ne?crosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于上海鈺博生物；PrimeScript RT 試劑盒、SYBR Green Master Mix購于大連Takara公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組實驗于2020 年1—7 月完成，大鼠肺泡上皮細(xì)胞采用Ham's F-12K 培養(yǎng)液（添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗）于含95%空氣、5%二氧化碳的37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期生長良好的細(xì)胞進(jìn)行實驗，實驗分組如下：對照組（不作處理）、模型組（15 mg/L 的LPS處理細(xì)胞24 h）、實驗組（加入15 mg/L 的LPS+不同濃度的阿米卡星處理細(xì)胞24 h，實驗1組、實驗2組、實驗3組阿米卡星濃度分別為5μg/L、10μg/L、15μg/L）、anti-miR-NC 組（轉(zhuǎn)染微小RNA 陰性對照后用15 mg/L 的LPS 處理細(xì)胞24 h）、anti-miR-223 組（轉(zhuǎn)染微小RNA-223 抑制劑后用15 mg/L 的LPS 處理細(xì)胞24 h）、實驗3+miR-NC組（轉(zhuǎn)染微小RNA 陰性對照后進(jìn)行15 mg/L的LPS和15μg/L的阿米卡星處理）、實驗3+miR-223 組（轉(zhuǎn)染微小RNA-223 激動劑后進(jìn)行15 mg/L的LPS和15μg/L的阿米卡星處理）。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡收集肺泡上皮細(xì)胞，采用PBS液洗滌細(xì)胞2次。用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整為密度為1×106個/毫升的單細(xì)胞懸液。取100μL細(xì)胞懸液，按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒步驟分別加入An?nexin V-FITC和PI，室溫避光孵育15 min，補(bǔ)加400μL的1×結(jié)合緩沖液，混勻后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.4 Western blotting 檢測cl-caspase3、pro-cas?pase3 表達(dá)采用含有蛋白酶抑制劑的預(yù)冷免疫沉淀裂解緩沖液分離總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取30μg 蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。5%脫脂乳4 ℃封閉膜過夜，然后分別與稀釋的一抗、二抗室溫孵育2 h。GAPDH 作為內(nèi)部對照，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，QuantityOne 軟件分析目的蛋白表達(dá)水平。

1.5 ELISA 試劑盒檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用DMEM 培養(yǎng)液配制標(biāo)準(zhǔn)品。參照ELISA試劑盒說明書檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的含量。

1.6 RT-qPCR 檢測miR-223 表達(dá)Trizol 法 提 取細(xì)胞總RNA，微量分光光度計測定RNA濃度。利用PrimeScript RT 試劑盒合成單鏈互補(bǔ)DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用SYBR Green Master Mix 試劑進(jìn)行qP?CR檢測，2-ΔΔCt法分析miR-223的表達(dá)水平。

miR-223：正向引物5′-AGCTGGTGTTGTGAAT?CAGGCCG-3′，反 向 引 物 5′-TGGTGTCGTG?GAGTCG-3′。U6：正向引物5′-CTCGCTTCGGCAG?CACATATACT-3′，反 向 引 物5′-ACGCTTCAC?GAATTTGCGTGTC-3′。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，每組設(shè)置3 個平行實驗，重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。采用t檢驗評估兩組間差異；采用單因素方差分析評估多組間差異，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿米卡星對LPS 作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響與對照組比較，模型組肺泡上皮細(xì)胞凋亡率、cl-caspase3 蛋白表達(dá)增加，pro-caspase3 蛋白表達(dá)降低；與模型組比較，實驗組肺泡上皮細(xì)胞凋亡率、clcaspase3 蛋白表達(dá)降低，pro-caspase3 蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。見圖1，表1。

圖1 阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡（A）及cl-caspase3、pro-caspase3蛋白（B）表達(dá)的影響

表1 阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響/±s

表1 阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響/±s

注：cl-caspase3 為兔源裂解的半胱天冬酶-3，pro-caspase3 為半胱天冬酶-3酶原。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。

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2.2 阿米卡星對LPS作用肺泡上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-6 表達(dá)的影響與對照組比較，模型組肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6 含量顯著升高；與模型組比較，實驗組肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNFα、IL-6含量顯著降低（P<0.05）。見表2。

表2 阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)的影響/（ng/L，±s）

表2 阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)的影響/（ng/L，±s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細(xì)胞介素6。①與對照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。

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2.3 阿米卡星對LPS 作用肺泡上皮細(xì)胞中miR-223 表達(dá)的影響與對照組1.00±0.06 比較，模型組肺泡上皮細(xì)胞中miR-223 表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與模型組5.35±0.14 比較，實驗組肺泡上皮細(xì)胞中miR-223 表達(dá)（實驗1 組4.26±0.14，實驗2 組3.54±0.12，實驗3 組1.89±0.10）顯著降低（P<0.05）。對照組、模型組、實驗組肺泡上皮細(xì)胞中miR-223表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2 078.82，P<0.001）。

2.4 抑制miR-223 對LPS 作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡及TNF-α、IL-6 表達(dá)的影響與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-223 組肺泡上皮細(xì)胞miR-223 和cl-cas?pase3 蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著降低，pro-caspase3蛋白表達(dá)顯著增加，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6含量顯著降低（P<0.05）。見圖2，表3。

圖2 抑制miR-223對脂多糖作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡（2A）及cl-caspase3、pro-caspase3蛋白（2B）表達(dá)的影響 圖3 miR-223可逆轉(zhuǎn)阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡（3A）及cl-caspase3、pro-caspase3蛋白（3B）表達(dá)的影響

表3 抑制miR-223對脂多糖作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡及TNF-α、IL-6表達(dá)的影響/±s

注：anti-miR-NC 為miR 陰性對照，anti-miR-223 為miR-223 抑制劑，miR-223 為微小RNA-223，cl-caspase3 為兔源裂解的半胱天冬酶-3，procaspase3為半胱天冬酶-3酶原，TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細(xì)胞介素6。

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2.5 miR-223 可逆轉(zhuǎn)阿米卡星對LPS 作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡及TNF-α、IL-6 表達(dá)的影響與實驗3+miR-NC 組比較，實驗3+miR-223 組肺泡上皮細(xì)胞miR-223 表達(dá)、cl-caspase3 蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高，pro-caspase3 蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6 含量顯著升高（P<0.05）。見圖3，表4。

表4 miR-223可逆轉(zhuǎn)阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡及TNF-α、IL-6表達(dá)的影響/±s

表4 miR-223可逆轉(zhuǎn)阿米卡星對脂多糖作用肺泡上皮細(xì)胞凋亡及TNF-α、IL-6表達(dá)的影響/±s

注：miR-223 為微小RNA-223，cl-caspase3 為兔源裂解的半胱天冬酶-3，pro-caspase3 為半胱天冬酶-3 酶原，TNF-α 為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細(xì)胞介素6。

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3 討論

既往研究顯示，霧化吸入阿米卡星脂質(zhì)體混懸液除用于治療禽結(jié)核菌引起的難治性非結(jié)核分枝桿菌肺病外，還可治療慢性銅綠假單胞菌引起的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎，提高病人細(xì)菌清除率、治愈率，降低促炎因子分泌［9-11］。本研究顯示LPS 誘導(dǎo)后肺泡上皮細(xì)胞凋亡率、cl-caspase3 蛋白表達(dá)顯著升高，pro-caspase3蛋白表達(dá)顯著降低，阿米卡星干預(yù)呈劑量依賴性地抑制cl-caspase3 蛋白表達(dá)，促進(jìn)pro-cas?pase3 蛋白表達(dá)，減輕LPS 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡。當(dāng)機(jī)體受到LPS 刺激時，會釋放一系列促炎細(xì)胞因子如TNF-α，而TNF-α 也可激活中性粒細(xì)胞促進(jìn)IL-6 等炎性因子的釋放，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)［12］。本研究顯示LPS 誘導(dǎo)后TNF-α、IL-6 分泌量顯著升高，而阿米卡星干預(yù)可顯著抑制TNF-α、IL-6分泌。此外，隨著阿米卡星濃度逐漸增加，其對TNF-α、IL-6 分泌抑制作用逐漸增強(qiáng)。以上研究說明阿米卡星能夠改善LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而起到肺泡上皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用。

miR-223 是一種造血細(xì)胞特異性微小RNA（mi?croRNA，miRNA），它參與調(diào)節(jié)自然免疫穩(wěn)態(tài)和結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)，與NF-κb 依賴性巨噬細(xì)胞分化、炎癥、感染和腫瘤進(jìn)展有關(guān)［13-14］。近年研究顯示，miR-223 在重癥肺炎病兒血漿中表達(dá)顯著增加，是重癥肺炎早期診斷、判斷炎癥嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)［15-16］。在內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織中miR-223也呈高表達(dá)［17］。此外，有研究指出miR-223 從中性粒細(xì)胞向肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移可能通過抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 表達(dá)而減輕ALI［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 誘導(dǎo)后肺泡上皮細(xì)胞miR-223 表達(dá)顯著增加，而阿米卡星干預(yù)顯著降低miR-223 的表達(dá)水平，于是推測阿米卡星對LPS 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與調(diào)控miR-223 表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，抑制miR-223 表達(dá)可抑制clcaspase3 蛋白表達(dá)，促進(jìn)pro-caspase3 蛋白表達(dá)，抑制TNF-α、IL-6 分泌，減輕LPS 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，與阿米卡星對肺泡上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用一致。深入研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-223 表達(dá)還可逆轉(zhuǎn)阿米卡星對LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥損傷的保護(hù)作用。以上研究提示下調(diào)miR-223 表達(dá)可能是阿米卡星發(fā)揮肺泡上皮細(xì)胞保護(hù)作用的重要機(jī)制。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)阿米卡星顯著降低了LPS 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與下調(diào)miR-223 表達(dá)有關(guān)。這為阿米卡星在ALI 中的應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。