哈麗達(dá)·夏爾甫哈孜，馮娟，范曉棠，石繡江，陳蘭，克拉熱·阿合買提，阿麗亞·熱哈提

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化病二科，新疆 烏魯木齊 830054

肝癌根治術(shù)和肝移植是治療肝癌的有效方法，但肝癌惡性程度高，具有極強的血管侵襲能力，病人術(shù)后無瘤生存率低，復(fù)發(fā)率高，遠(yuǎn)期預(yù)后差[1-3]。文獻報道肝癌根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)率高達(dá)40%，5年復(fù)發(fā)率為50%～70%，肝移植術(shù)后肝癌的復(fù)發(fā)率為15%～30%，嚴(yán)重影響病人預(yù)后[4-6]。由于肝癌術(shù)后較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率，因此，正確有效的輔助治療對預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有非常重要的臨床意義。經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)是目前肝癌術(shù)后應(yīng)用最多的輔助治療，用于治療腫瘤的微轉(zhuǎn)移灶，滅活殘余腫瘤灶，降低復(fù)發(fā)率。理論上，癌前病變及殘癌細(xì)胞在進展為實體瘤的過程中，必先有腫瘤血管的生成。術(shù)后行TACE治療可在殘肝中保持較高的藥物濃度，起到阻斷腫瘤血供、殺滅可能存在的殘癌和抑制癌前病變的效果；同時，癌灶中的碘油還可提高對微小病變的檢出率，起到早期診斷、早期治療的雙重作用。基于上述優(yōu)點，輔助性TACE的應(yīng)用似有越來越廣泛的趨勢[7-8]。但對于肝癌根治術(shù)后行輔助性TACE治療是否能使病人獲益，國內(nèi)外文獻報道尚存爭議。如何根據(jù)不同情況制定與病人個體化相適宜的輔助性TACE治療方案，目前仍處于探索階段，本研究通過建立預(yù)測肝癌術(shù)后生存率的列線圖模型，用以評價肝癌術(shù)后輔助性TACE的療效，旨在為臨床肝癌術(shù)后生存情況的精準(zhǔn)評估和術(shù)后TACE治療的優(yōu)化使用提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

收集2013年12月至2015年12月在我院普通外科接受根治性手術(shù)切除的201例肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)病人的臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次確診肝癌并接受肝癌根治術(shù)；(2)年齡30～70歲，男女不限；(3)Child-Pugh分級為A級或B級。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并廣泛的肝內(nèi)肝外轉(zhuǎn)移以及淋巴結(jié)侵犯;(2)合并門靜脈或腔靜脈癌栓；(3)姑息性切除;(4)合并其他惡性腫瘤。

本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(批件號：K20131115423)，所有病人及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

二、研究方法

1.根治性肝癌切除術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)中完整切除腫瘤，切緣無癌殘留；術(shù)后3個月影像學(xué)檢查未見腫瘤殘存，術(shù)前甲胎蛋白陽性者術(shù)后 2個月內(nèi)降至正常。

2.輔助性TACE治療 所有病人經(jīng)術(shù)后綜合評估如存在腫瘤直徑較大，侵襲性較強，多發(fā)腫瘤或微血管侵犯(microvascular invasion，MVI)陽性則建議術(shù)后行輔助性TACE治療。具體操作: 采用 Seldinger 技術(shù)經(jīng)股動脈穿刺插管，引導(dǎo)導(dǎo)管至肝固有動脈，然后行數(shù)字減影血管造影(DSA)，導(dǎo)管插在肝固有動脈處灌注奧沙利鉑50 mg、表柔比星30 mg，然后用20 mg表柔比星乳化3～5 mL碘油后栓塞。

3.血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)檢測方法與結(jié)果判讀 采用免疫組織化學(xué)SP方法檢測HCC癌組織VEGF表達(dá)，兔抗人VEGF單克隆抗體(即用型)為福建邁新公司產(chǎn)品。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 次，每次5 min；3%過氧化氫室溫孵育15 min，以徹底消除標(biāo)本中內(nèi)源性過氧化氫酶的活性。PBS沖洗 3次，每次5 min。切片置枸櫞酸鹽緩沖液中加熱至95～98 ℃，持續(xù)10 min，然后自然冷卻約50 min，PBS沖洗3次，每次5 min。5%正常山羊血清封閉，室溫孵育20 min。滴加一抗(VEGF為即用型工作液)，PBS沖洗 3次，每次5 min。滴加1∶50稀釋的生物素標(biāo)記的二抗(1% BAS-PBS稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min；應(yīng)用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)對其顯色。PBS充分沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水，中性樹膠封固。PBS代替一抗作為陰性對照。被染成棕黃色或棕褐色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇團均認(rèn)為是新生的腫瘤血管。先在低倍視野內(nèi)找到腫瘤組織微血管密度最高的區(qū)域，然后在高倍視野內(nèi)計數(shù)微血管的數(shù)目，計算此區(qū)域的微血管數(shù)目。VEGF陽性者免疫組織化學(xué)染色細(xì)胞膜和胞質(zhì)著色，陽性細(xì)胞數(shù)≥30%者為陽性，<30%為陰性，見圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá) A.肝癌組織VEGF陽性表達(dá)(HE，×200);B 肝癌組織VEGF陰性表達(dá)(HE，×200)；C.癌旁組織VEGF陽性表達(dá)(HE，×200)；D.癌旁組織VEGF陰性表達(dá)(HE，×200)

4.MVI的診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[9]，由我院專業(yè)病理科醫(yī)師判定，陽性定義為顯微鏡下于內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的血管腔內(nèi)見到癌細(xì)胞巢團，多見于癌旁肝組織內(nèi)的門靜脈小分支或腫瘤包膜內(nèi)血管，見圖2。

圖2 肝癌病人微血管侵犯的病理學(xué)檢查 A.微血管侵犯陽性(HE，×100)，箭頭所示為血管腔內(nèi)的癌細(xì)胞巢團；B.微血管侵犯陰性(HE，×100)

5.術(shù)后隨訪 本研究納入的201例病人術(shù)后均規(guī)律隨訪，無1例失訪者，所有病人自手術(shù)后第1個月開始，每月隨訪1次，連續(xù)隨訪2次后改為每3個月隨訪1次。項目包括血常規(guī)、生化、凝血、腫瘤標(biāo)志物以及腹部彩超和CT或 MRI，隨訪截止時間為2020年12月或病人肝癌術(shù)后5年內(nèi)因腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移死亡，總生存期為肝癌術(shù)后至因肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移死亡的生存時間。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS(22.0版)軟件進行統(tǒng)計分析，對所有指標(biāo)先進行Kaplan-Meier單因素分析，然后將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)代入Cox模型進行多因素校正，采用向前逐步回歸，得到獨立預(yù)測因子，根據(jù)獨立預(yù)測因子結(jié)合術(shù)后1、3、5年的基準(zhǔn)死亡風(fēng)險，應(yīng)用R軟件，構(gòu)建列線圖模型，以Bootstrap法進行內(nèi)部驗證，計算區(qū)分度評價指標(biāo)C-index ，并通過Hosmer-Lemeshow(H-L)檢驗進行模型的內(nèi)部驗證并評價其校準(zhǔn)能力，應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線獲得列線圖總評分的最佳診斷截點，將所有病人分為高、低危組，Kaplan-Meier生存分析比較高危組和低危組不同TACE治療的各階段累積生存率，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、研究對象的一般資料

共201例在我院接受手術(shù)治療的HCC病人納入研究，201例HCC病人中男性130例(64.7%)，女性71例(35.3%)，年齡為(55±8)歲，肝癌術(shù)后1、3、5年總生存率分別為81.2%、57.5%、42.8%，中位生存時間為(38±9)個月，術(shù)后接受輔助性TACE治療的病人有131例(65.2%)，未行輔助性TACE治療者70例(34.8%)，接受輔助性TACE治療病人中多發(fā)腫瘤伴MVI有26例(19.8%)，多發(fā)腫瘤伴最大腫瘤直徑≥5 cm者42例(32.1%)，MVI伴最大腫瘤直徑≥5 cm者35例(26.7%)，多發(fā)腫瘤伴最大腫瘤直徑≥5 cm以及MVI者28例(21.4%)。

二、Kaplan-Meier單因素分析和Log-rank檢驗

結(jié)果顯示，7個指標(biāo)的各階段累積生存率在單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義，分別為乙型肝炎病毒DNA載量、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(NLR)、MVI、腫瘤最大直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤分化程度、VEGF(均P<0.05)，見表1。

表1 肝細(xì)胞癌病人圍術(shù)期臨床病理指標(biāo)的單因素分析

三、多因素Cox回歸分析

將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)代入多因素Cox模型進行分析，校正和控制混雜變量后，篩選出5個對肝癌術(shù)后生存情況有顯著性影響的獨立預(yù)測因子：MVI(β=1.310;HR=3.706)、腫瘤數(shù)目(β=0.671;HR=1.956)、VEGF(β=0.532;HR=1.702)、腫瘤最大直徑(β=0.792;HR=2.208)、腫瘤分化程度(β=0.421;HR=1.523)，均P<0.05，見表2。

表2 Cox多因素分析

四、獨立預(yù)測因素的賦分

根據(jù)列線圖原理對每個獨立預(yù)測指標(biāo)進行擬合系數(shù)轉(zhuǎn)化，以系數(shù)轉(zhuǎn)化值最大的指標(biāo)(MVI的系數(shù)轉(zhuǎn)化值:1.310)為參考基礎(chǔ)，設(shè)定得分范圍為(0，10)，其他指標(biāo)以MVI的系數(shù)轉(zhuǎn)化值為基礎(chǔ)，按照一定的公式轉(zhuǎn)換成比例得到其他指標(biāo)的最大得分，即相應(yīng)指標(biāo)的最大得分=10×(相應(yīng)指標(biāo)的系數(shù)轉(zhuǎn)化值/1.310)，見表3。

五、列線圖模型的建立

基于Cox多因素分析結(jié)果獲得的5個獨立預(yù)測因素，結(jié)合術(shù)后1、3、5年的基準(zhǔn)死亡風(fēng)險建立列線圖模型并通過R軟件構(gòu)建列線圖，圖3為結(jié)合了VEGF基因預(yù)測肝癌根治術(shù)后1、3、5年總生存率的列線圖，每個獨立預(yù)測指標(biāo)刻度線上的數(shù)值對應(yīng)分?jǐn)?shù)刻度線上的評分(見表3的賦值過程)，所有指標(biāo)的評分相加為列線圖總評分，每位病人的列線圖總評分對應(yīng)其肝癌根治術(shù)后1、3、5年總生存率的預(yù)測值。

表3 獨立預(yù)測因素的賦分

圖3 結(jié)合了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因預(yù)測肝細(xì)胞癌(HCC)術(shù)后1、3、5年總生存率的列線圖

六、列線圖模型的驗證

對列線圖預(yù)測模型采用Bootstrap法進行內(nèi)部驗證，自抽樣1 000次，其區(qū)分度評價指標(biāo)C-index為0.818[95%CI(0.775，0.927)]，提示該模型具有較好的區(qū)分度和診斷效能。將201例病人的列線圖總評分從低到高排成一個隊列，并按照列線圖總評分的五分位將隊列分為5組，計算出每組病人術(shù)后1、3、5年總生存率預(yù)測值的均值，并與每組病人術(shù)后1、3、5年實際總生存率相比較，術(shù)后1年生存率比較(預(yù)測：93.5%、78.2%、65.7%、48.2%、41.2%，實際：95.7%、74.1%、61.5%、49.2%、39.8%，χ2=1.124，P=0.263)；術(shù)后3年生存率比較(預(yù)測：79.2%、57.2%、41.3%、29.1%、25.2%，實際：81.2%、60.5%、38.1%、25.0%、23.1%，χ2=0.966，P=0.317)；術(shù)后5年生存率比較(預(yù)測：61.4%、46.4%、27.5%、21.1%、10.2%，實際：63.7%、44.5%、25.6%、19.1%、9.6%，χ2=0.846，P=0.386)，H-L檢驗提示列線圖模型的預(yù)測值與實際觀測值符合度良好，預(yù)測能力較準(zhǔn)確。

七、 Kaplan-Meier 生存分析

根據(jù)ROC曲線獲得列線圖總評分的最佳診斷截點為15.1分，最佳診斷截點用于預(yù)測肝癌術(shù)后5內(nèi)死亡的靈敏度和特異度分別為83.6%和76.9%，根據(jù)最佳診斷截點將所有病人分為低危組(總評分<15.1分)和高危組(總評分≥15.1分)，低危組65例(32.3%)，其中TACE治療12例(18.5%)，未行TACE治療53例(81.5%)；高危組136例(67.7%)，其中TACE治療≥2次57例(41.9%)，TACE治療1次62例(45.6%)，未行TACE治療17例(12.5%)。低危組:TACE組術(shù)后1、3、5年累積生存率(91.6%、83.3%、75.0%)與未行TACE組(92.4%、71.6%、56.6%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.168)。高危組:TACE治療≥2次、TACE治療1次和未行TACE治療3組進行兩兩比較，TACE治療≥2次組術(shù)后1、3、5年累積生存率(100.0%、63.2%、26.3% )顯著高于TACE治療1次組(90.3%、27.4%、20.9%，P=0.029)；而TACE治療1次組各階段累積生存率(90.3%、27.4%、20.9%)顯著高于未行TACE治療組(76.4%、11.8%、11.8%，P=0.043)，見圖4，圖5。

圖4 肝癌根治術(shù)后低危組病人不同經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)(TACE)治療次數(shù)各階段累積生存率比較的生存曲線分布圖

圖5 肝癌根治術(shù)后高危組病人不同經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)(TACE)治療次數(shù)各階段累積生存率的生存曲線分布圖

討 論

目前肝癌切除術(shù)和肝移植術(shù)仍是根治肝癌的主要方法，但由于肝癌細(xì)胞極易侵犯血管，無論是肝癌切除還是肝移植術(shù)都不能預(yù)防其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，MVI作為腫瘤細(xì)胞入侵血管的中間階段，是肝癌向肝內(nèi)及遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[10-13]，國內(nèi)外大量研究[14-17]證實MVI是影響肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和長期生存的獨立危險因素，肝癌合并MVI術(shù)后早期復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著高于無MVI的病人，無瘤生存期和總生存時間短，預(yù)后差。美國癌癥聯(lián)合委員會肝癌分期系統(tǒng)重點關(guān)注了影響肝癌術(shù)后預(yù)后的病理因素，其中包括有無MVI[18]，而本研究的多因素分析也顯示，MVI為影響肝癌術(shù)后生存的獨立危險因素，且伴有MVI的肝癌病人術(shù)后5年內(nèi)死亡的風(fēng)險為非MVI肝癌病人的2.94倍，再次證實了以上結(jié)論。

惡性腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管生成，近些年來 VEGF 在肝癌血管生成和進展中的作用被廣泛研究。VEGF 能通過旁分泌形式特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管通透性，以誘導(dǎo)腫瘤血管生成，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[19-20]。張繼紅等[21]的研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中 VEGF 的表達(dá)水平高于癌旁肝組織，并且在肝癌組織中 VEGF 的表達(dá)與微血管侵襲有關(guān)，而且隨著肝癌組織血管形成的逐步發(fā)展，VEGF 的表達(dá)程度也逐漸增加。Rastegar等[22]的研究結(jié)果表明，VEGF 是一種增加血管通透性并促進新血管生長的細(xì)胞因子，在肝癌組織中呈高表達(dá)，并與侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后等生物學(xué)行為關(guān)系密切，VEGF 高表達(dá)病人肝癌根治術(shù)后無瘤生存率與總生存率明顯低于VEGF 低表達(dá)者。本研究多因素分析結(jié)果顯示，VEGF高表達(dá)者HCC術(shù)后5年內(nèi)死亡的風(fēng)險是VEGF低表達(dá)者的1.51倍，與以上研究報道一致，其可能機制為高表達(dá)的VEGF可通過促進肝竇內(nèi)皮細(xì)胞增殖、收縮、遷移而促進肝竇毛細(xì)血管化，促進肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。

但根據(jù)臨床病理因素評估肝癌術(shù)后生存情況需要一個客觀、統(tǒng)一的評估標(biāo)準(zhǔn)，因此基于多因素研究結(jié)果得到的5個獨立預(yù)測因素結(jié)合肝癌術(shù)后1、3、5年基準(zhǔn)死亡風(fēng)險，我們成功建立了列線圖預(yù)測模型，通過列線圖模型可得到肝癌術(shù)后1、3、5年的生存概率，提高了臨床對肝癌術(shù)后病人生存狀態(tài)的準(zhǔn)確評估能力，此外，本研究中引入VEGF基因構(gòu)建了一個新的風(fēng)險預(yù)測模型，將肝癌的各個臨床病理特征(腫瘤分期、腫瘤負(fù)荷、侵襲潛能)以及生物學(xué)特性結(jié)合各自的量化權(quán)重均體現(xiàn)于模型中，相比之前研究用單一因素去預(yù)測將來某結(jié)局事件發(fā)生的風(fēng)險，本模型預(yù)測價值有了明顯提高，經(jīng)H-L外部驗證，該模型得出的預(yù)測值與實際觀察值符合度良好，預(yù)測能力較準(zhǔn)確，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

TACE通過超選擇性栓塞肝小動脈，提高局部肝組織化療藥物濃度，進入肝動脈的化療藥物通過緩釋作用抑制和清除微血管內(nèi)的癌細(xì)胞團，同時TACE可通過肝動脈與門靜脈之間的微小吻合支直接清除門靜脈微小分支內(nèi)微血管侵犯灶，血管栓塞也可以通過缺血缺氧導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，理論上，術(shù)后TACE通過以上途徑消滅殘余肝內(nèi)微小的轉(zhuǎn)移灶，減少腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，但其改善肝癌預(yù)后的療效仍然存在較大爭議。主要原因是目前國內(nèi)外尚無肝癌術(shù)后輔助性TACE治療的推薦指南以及尚未制定出適合不同病情的對應(yīng)術(shù)后TACE的治療方案。為解決以上問題，我們根據(jù)ROC曲線獲得列線圖總評分的最佳診斷截點，將所有病人分為低危組(總評分<15.1分)和高危組(總評分≥15.1分)。Kaplan-Meier生存分析提示對于總評分≥15.1分的高危病人，術(shù)后輔助性TACE治療明顯增加其術(shù)后生存時間，并且予以2次以上輔助性TACE治療將為這些病人帶來更明顯的生存獲益，而在總評分<15.1分的低危病人中，TACE組術(shù)后各年的累積生存率雖高于未行TACE組，但總體差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造成這種情況的原因可能是有少數(shù)低危病人伴有1種或2種侵襲性危險因素，手術(shù)不易達(dá)到根治，而術(shù)后TACE治療可幫助消滅術(shù)后殘癌灶或癌前病變組織，減少腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的概率，提高了這類病人的總生存率。因此，推薦這些伴有危險因素的低危病人在術(shù)后接受1次TACE治療，而多數(shù)不伴有危險因素的低危病人，術(shù)后TACE治療并不能明顯改善其術(shù)后生存時間，故推薦術(shù)后不予以TACE治療，定期復(fù)查隨訪即可。

綜上所述，結(jié)合VEGF基因的列線圖模型可較準(zhǔn)確地預(yù)測肝癌術(shù)后1、3、5年總生存率，并且根據(jù)列線圖總評分可制定出與病人個體化相適宜的TACE治療方案，為臨床肝癌術(shù)后生存情況的精準(zhǔn)評估和術(shù)后TACE治療的優(yōu)化使用提供依據(jù)，具有重要的臨床意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突