郭艷玲，王艷麗，馬文鵬,3，陳 鴿，曾夢(mèng)妮，劉成程

1.渭南市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西渭南 714000；2.渭南市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西渭南 714000；3.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)教研室，陜西西安 710061

外耳道真菌感染是一種表現(xiàn)為耳癢、耳溢液、耳痛等癥狀的耳部疾病[1]。常見致病真菌有曲霉菌、念珠菌、毛霉菌、青霉屬，主要以曲霉菌感染為主，其中黑曲霉感染較為常見[2-3]。近年來，隨著糖皮質(zhì)激素以及抗菌藥物的不規(guī)范應(yīng)用，真菌感染日趨增多，實(shí)驗(yàn)室診斷變得尤為重要。目前實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)黑曲霉已經(jīng)應(yīng)用到質(zhì)譜和DNA序列分析等技術(shù)，然而，形態(tài)學(xué)鑒別還是真菌檢測(cè)的主要檢驗(yàn)方法[4-5]。本文將從實(shí)驗(yàn)室黑曲霉生長(zhǎng)特性等方面進(jìn)行闡述，以期為實(shí)驗(yàn)室檢查提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料來源 黑曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC16404(簡(jiǎn)稱“S”)來源于北京生物保藏中心。黑曲霉臨床菌株(簡(jiǎn)稱“C”)，分離自渭南市第二醫(yī)院兩例耳道真菌病患者的外耳道分泌物，均通過質(zhì)譜儀鑒定為黑曲霉，分別標(biāo)示為C1、C2，見圖1。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)來源于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；血瓊脂培養(yǎng)基(BAP)、沙保羅瓊脂培養(yǎng)基(SDA)和普通巧克力瓊脂培養(yǎng)基(CA)來源于鄭州安圖生物工程股份有限公司。

注：箭頭代表鏡下菌株菌絲；a～c分別為C1菌株在鏡下、BAP、SDA的形態(tài)；d～f分別為C2菌株在鏡下、BAP、SDA的形態(tài)。

1.2儀器與試劑 微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；微生物培養(yǎng)箱購自天津市泰斯特儀器有限公司；顯微鏡購自奧林巴斯(中國(guó))有限公司；革蘭染色液、乳酸酚棉蘭染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1顯微鏡下形態(tài)觀察 本研究采用插片培養(yǎng)觀察法，將孢子接種到培養(yǎng)基的中間，然后用小鑷子夾起一塊無菌蓋玻片，以45°的角度斜插入培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)72 h后，用小鑷子將蓋玻片取出后轉(zhuǎn)移到滴有無菌生理鹽水的載玻片上，在顯微鏡下觀察孢子及菌絲的形態(tài)。另外，對(duì)培養(yǎng)72 h的菌落用透明膠帶從菌落頂部粘取一定量的菌絲，粘在預(yù)先滴加乳酸酚棉蘭染色液的載玻片上，然后在顯微鏡下觀察頂囊孢子和菌絲的形態(tài)特征。

1.3.2菌落形態(tài)觀察 參照文獻(xiàn)[6]中孢子懸液的制備方法，從復(fù)蘇、分離好的3株黑曲霉中取適量孢子加入無菌生理鹽水中充分振蕩混勻，分別通過4層無菌紗布過濾后，用牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制備成1×103個(gè)/毫升的3種孢子懸液。將已制備好的孢子懸液用振蕩器充分混勻，分別取1 μL孢子懸液接種在SDA、PDA、BAP和CA上，將接種好的培養(yǎng)基分別置入25 ℃和35 ℃的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h，觀察3株菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

1.3.3生長(zhǎng)曲線檢測(cè)及菌落生長(zhǎng)特征 在培養(yǎng)后的12、24、36、48、60、72、84和96 h觀察記錄兩組溫度下不同培養(yǎng)基上的菌落直徑、菌絲密度、菌落顏色出現(xiàn)變化時(shí)間、菌落黑色顯色區(qū)范圍和顯色區(qū)密度。

2 結(jié) 果

2.1顯微鏡下形態(tài)特征 在35 ℃條件下采用插片法培養(yǎng)72 h后，濕片顯微鏡(×40)下可見菌絲體、分生孢子頭和分生孢子，分生孢子頭為黑褐色，菌絲透明有隔膜，見圖2a、2b；乳酸酚棉蘭染色顯微鏡下可見頂囊球形或近球形，雙層小梗布滿頂囊，?；史派錉?，形似菊花，分生孢子呈球形表面粗糙有小刺，菌絲透明有隔膜，見圖2c、2d。

注：a、b為濕片顯微鏡(×40)下黑曲霉分生孢子頭、產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)形態(tài)；c、d為乳酸酚棉蘭染色后顯微鏡(×40)下黑曲霉分生孢子頭、菌絲體形態(tài)。

2.2菌落形態(tài)特征 黑曲霉在35 ℃培養(yǎng)72 h后，可見黑色厚絨毛放射輪狀菌落生長(zhǎng)。而且PDA比SDA上菌絲致密，孢子密度大，但是在SDA上生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑和產(chǎn)孢子直徑最大，見圖3。3株菌在PDA和SDA的背面形態(tài)有明顯不同，在SDA的背面產(chǎn)生大量褶皺，無色或呈黃褐色，72 h后褶皺更加明顯，但PDA的背面產(chǎn)生少量褶皺，見圖4。

注：a、b、c分別為S、C1、C2在35 ℃培養(yǎng)72 h后不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

注：a、b、c分別為S、C1、C2在35 ℃培養(yǎng)72 h后SDA和PDA背面的菌落特點(diǎn)。

2.3生長(zhǎng)曲線檢測(cè) 3株黑曲霉在25 ℃和35 ℃培養(yǎng)12 h，4種培養(yǎng)基上均無肉眼可見的菌落生長(zhǎng)。25 ℃培養(yǎng)到36 h才出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)；35 ℃培養(yǎng)24 h，在4種培養(yǎng)基上均出現(xiàn)肉眼可見的菌落生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)差異逐漸明顯。對(duì)兩種溫度的菌落生長(zhǎng)曲線對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在35 ℃培養(yǎng)條件下，菌落直徑更大，生長(zhǎng)速度更快，見圖5。

注：注：a、c、e為菌株S、C1和C2在25 ℃培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線；b、d、f為菌株S、C1和C2在35 ℃培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線。

2.4菌落生長(zhǎng)特征 35 ℃培養(yǎng)96 h后觀察發(fā)現(xiàn)，3株黑曲霉在4種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)有明顯不同的結(jié)果。該3株菌在SDA上的菌落直徑最大，平均生長(zhǎng)速度最快，其次為PDA、BAP和CA；在菌絲密度和孢子顯色密度方面，PDA最為濃密，其次為SDA、BAP和CA；在PDA和SDA上生長(zhǎng)36 h出現(xiàn)顏色變化，時(shí)間早于BAP和CA；在SDA上黑色顯色區(qū)范圍最大，其次為PDA、BAP和CA，見表1。

表1 黑曲霉在35 ℃培養(yǎng)96 h后的菌落生長(zhǎng)特征

3 討 論

本次研究選用的培養(yǎng)基為臨床實(shí)驗(yàn)室常用的4種培養(yǎng)基。PDA常用于真菌及曲霉菌的鑒定，SDA多用于常規(guī)真菌的培養(yǎng)，BAP和CA為一般細(xì)菌生長(zhǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。不同的培養(yǎng)基成分不同，PDA是由20.0 g葡萄糖、6.0 g馬鈴薯浸粉和20.0 g瓊脂組成，其為黑曲霉的生長(zhǎng)提供碳源；SDA是由20.0 g葡萄糖、20.0 g瓊脂、蛋白胨(主要以多肽、氨基酸為主，并輔以生物素、微量元素等)和氯霉素組成，含有真菌生長(zhǎng)的碳源和氮源。在本研究中，黑曲霉在PDA上的菌落生長(zhǎng)范圍、平均生長(zhǎng)速度以及孢子黑色顯色區(qū)范圍均不及SDA，但菌絲密度和孢子密度大于SDA；BAP和CA因不含真菌生長(zhǎng)的糖類，其成分單一，所以黑曲霉在這兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢。

黑曲霉在4種培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)條件要求不高。SDA中的葡萄糖為黑曲霉生長(zhǎng)提供所需的碳源，蛋白胨為黑曲霉生長(zhǎng)提供氮源，其中，葡萄糖是黑曲霉生長(zhǎng)的最好碳源，徐和平等[7]研究顯示，增加葡萄糖的含量可以加快黑曲霉的生長(zhǎng)速度，但在葡萄糖含量相同的情況下，SDA與PDA相比，PDA中的馬鈴薯浸粉僅僅為黑曲霉提供了可溶性淀粉，然而，SDA還含有蛋白胨，其為黑曲霉提供豐富的氮源[8]。氮源是菌體合成氨基酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的主要成分，也是合成各種含氮代謝產(chǎn)物的重要原料。唐詩潮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，加入固定量的氮源如蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等，可顯著加快黑曲霉的生長(zhǎng)速度，酵母膏為黑曲霉生長(zhǎng)最適氮源，其次為蛋白胨，這與本研究結(jié)果相符，在富含蛋白胨的SDA上黑曲霉生長(zhǎng)速度比PDA快。正如劉夢(mèng)涵等[10]研究結(jié)果顯示，菌體生長(zhǎng)階段氮源需求大，產(chǎn)孢子階段氮源的需求量遠(yuǎn)大于碳源的需求量，由此可見黑曲霉在SDA上菌體生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)孢子范圍最大。

溫度是影響微生物生長(zhǎng)的重要因素之一，在臨床微生物標(biāo)本的培養(yǎng)過程中提供一個(gè)穩(wěn)定且合適的溫度環(huán)境是必不可少的。黑曲霉生長(zhǎng)的最適溫度范圍為24～37 ℃。有研究顯示，黑曲霉在30、35、40和45 ℃等溫度環(huán)境下培養(yǎng)，在35 ℃培養(yǎng)溫度下黑曲霉的生物量和催化活力最大[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，3株菌在相同的培養(yǎng)基上，在35 ℃的培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)迅速，其菌落顏色變化的時(shí)間早于25 ℃培養(yǎng)環(huán)境。菌落顏色的變化代表著黑曲霉的成熟度，菌落顏色變化早說明成熟早，相反，則成熟晚。黑曲霉在35 ℃培養(yǎng)環(huán)境下成熟早于25 ℃培養(yǎng)環(huán)境[12]。由此可見，35 ℃培養(yǎng)環(huán)境可促使黑曲霉的快速生長(zhǎng)，縮短培養(yǎng)時(shí)間，為臨床診斷黑曲霉感染提供最迅速的診療依據(jù)。

綜上所述，對(duì)于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室分離致病性黑曲霉，選擇碳源和氮源豐富的SDA以及35 ℃培養(yǎng)環(huán)境，縮短培養(yǎng)時(shí)間，可為臨床診療節(jié)省時(shí)間。