袁長(zhǎng)深，官巖兵，段 戡，容偉明，李 哲，梅其杰，張志敏，王 琳

0 引 言

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)作為一種慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病，是導(dǎo)致患者活動(dòng)受限、生活質(zhì)量低下甚至殘疾的主要原因之一。在全世界，其發(fā)病率已超過(guò)15%，并呈逐年上升趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)35%[1]。高血壓也是常見(jiàn)慢性疾病之一，作為心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，已被公認(rèn)致殘的第三大誘因。在全球范圍內(nèi)，約有31.1%成年人受其困擾[2]。隨著老齡化社會(huì)到來(lái)，OA和高血壓共同發(fā)病較為常見(jiàn)。在65歲以上OA患者中，超過(guò)50%合并有高血壓[3]；甚至認(rèn)為高血壓是造成OA關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)失調(diào)的重要誘因，使具有影像學(xué)改變的膝OA增加89%，癥狀性膝OA增加39%[4]。這可能源于高血壓增加骨內(nèi)壓力，引起缺氧，進(jìn)而誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨重塑，形成骨贅；或可能是誘導(dǎo)腎素-血管緊張素系統(tǒng)和內(nèi)皮素系統(tǒng)激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)軟骨降解有關(guān)[5-6]。目前OA與高血壓共同發(fā)病的機(jī)制不詳。因而，有效挖掘兩者共同的發(fā)病基因，對(duì)進(jìn)一步明確OA與高血壓之間的聯(lián)系、降低兩種疾病共存的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。生物信息學(xué)是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)現(xiàn)有生物醫(yī)藥數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、分析以及預(yù)測(cè)的一種新型學(xué)科，可在基因分子層面了解生物發(fā)展的作用規(guī)律。故而，本研究利用生物信息學(xué)方法，從生物分子學(xué)角度來(lái)探討OA與高血壓之間的潛在關(guān)系，為有效防治兩者共同發(fā)病提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 疾病相關(guān)基因的篩選GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)創(chuàng)建并維護(hù)，現(xiàn)已收錄世界各研究機(jī)構(gòu)提供的海量疾病基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，可供下載與分析。在該數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入檢索詞“osteoarthritis”，篩選出OA相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集GSE55235，再通過(guò)R語(yǔ)言“l(fā)imma”包對(duì)其差異分析后篩選出差異表達(dá)基因，即為OA相關(guān)疾病基因(篩選條件：P≤0.05和|logFC|≥1)。GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)作為非盈利組織構(gòu)建的一個(gè)整合型的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，可提供簡(jiǎn)明基因組、蛋白質(zhì)組及相關(guān)人類(lèi)基因等進(jìn)行研究。在數(shù)據(jù)庫(kù)中以“hypertension”為檢索詞，篩選出與高血壓相關(guān)的疾病基因(篩選條件：相關(guān)度≥5)。

1.2 篩選共同疾病基因使用R語(yǔ)言軟件“VennDiagram”包將OA相關(guān)基因和高血壓相關(guān)基因作交集，獲得OA與高血壓共同疾病基因，并作出韋恩圖。

1.3 基因本體論(GO)批注和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)富集途徑分析GO和KEGG富集途徑可用來(lái)分析并揭示基因所參與的細(xì)胞成分、分子功能、生物過(guò)程及信號(hào)通路，便于理解基因作用于疾病的潛在機(jī)制。Bioconductor作為生信分析中一款基于R語(yǔ)言的常用集合包，可對(duì)有關(guān)DNA微陣列或基因芯片的表達(dá)數(shù)據(jù)加與處理、分析以及注釋。利用Bioconductor中的“clusterProfiler”、“DOSE”和“pathview”三個(gè)包對(duì)共有疾病基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.4 共同疾病基因蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建為更好地了解OA與高血壓共同疾病基因表達(dá)蛋白之間的關(guān)系，使用String數(shù)據(jù)庫(kù)在滿(mǎn)足綜合得分≥0.4的條件下建立PPI。

1.5 關(guān)鍵基因的篩選利用Cytoscape(版本3.7.2)軟件“cytoHubba”插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，通過(guò)Betweenness、Colseness、Degeree、EPC及MMC五種不同計(jì)算方法篩選出Hub基因。

1.6 關(guān)鍵基因上游miRNA的預(yù)測(cè)miRNet(https://www.mirnet.ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)可用于miRNA與靶標(biāo)的相互預(yù)測(cè)和功能注釋?zhuān)⒛芡ㄟ^(guò)將用戶(hù)數(shù)據(jù)與現(xiàn)有知識(shí)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)視覺(jué)分析，從而可闡明microRNA(miRNA)功能及與靶標(biāo)關(guān)系的在線(xiàn)平臺(tái)。通過(guò)將Hub基因列表輸入到此數(shù)據(jù)庫(kù)中，預(yù)測(cè)上游miRNA，并做出Hub基因及上游miRNA的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。

2 結(jié) 果

2.1 共同疾病基因?qū)A基因芯片GSE55235進(jìn)行差異表達(dá)分析，得到934個(gè)OA相關(guān)DGEs(P≤0.05和|logFC|≥1)，見(jiàn)圖1；同時(shí)在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得1325個(gè)(關(guān)聯(lián)度≥5)高血壓相關(guān)的有效基因。利用R語(yǔ)言軟件“VennDiagram”包將獲得的OA差異表達(dá)基因與高血壓有效基因作交集，共獲得131個(gè)共同疾病基因，見(jiàn)圖2。

藍(lán)色為下調(diào)基因，紅色為上調(diào)基因，灰色為無(wú)差異性基因

紅色為OA基因，藍(lán)色為高血壓基因，棕色為交集基因

2.2 GO和KEGG富集分析通過(guò)Bioconductor對(duì)共同疾病基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，其基因主要富集于細(xì)胞因子活性、蛋白酶活性等生物功能和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17, IL-17)等信號(hào)通路中，見(jiàn)圖3。

a:GO富集分析;b:KEGG富集分析條形圖越長(zhǎng)或點(diǎn)面積越大代表富集的基因越多，顏色越深代表P值越小

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選采用String數(shù)據(jù)庫(kù)建立共同疾病基因的PPI互作網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含121個(gè)節(jié)點(diǎn)和841條邊，見(jiàn)圖4。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯⒗?種不同計(jì)算方法分別篩選出排名前20位的基因，進(jìn)行交集后得到11個(gè)Hub基因：IL-6、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、IL-1B、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、JUN原癌基因(Jun proto oncogene, JUN)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、內(nèi)皮素-1(endothelin -1，EDN-1)、IL-8、絲氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子-8(serine protease inhibitor peptidase inhibitor-8, SERPINE-1)，見(jiàn)表1，圖5。

不同的圓代表不同基因，圓與圓之間連線(xiàn)的密集程度代表基因之間的關(guān)聯(lián)程度

不同的顏色對(duì)應(yīng)不同的算法，重疊區(qū)域的數(shù)字大小表明多種算法交集后的基因個(gè)數(shù)

表1 Hub基因在不同算法中的排名情況

2.4 Hub基因上游miRNA預(yù)測(cè)通過(guò)miRNet數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)11個(gè)Hub基因的上游miRNA，共發(fā)現(xiàn) 563個(gè)有關(guān)的miRNA，并篩選出(篩選條件：節(jié)點(diǎn)度≥9)綜合排名前5的關(guān)鍵miRNA，見(jiàn)表2，圖6。

表2 綜合排名前5的miRNA信息

紅色節(jié)點(diǎn)為Hub基因，黃色節(jié)點(diǎn)為miRNA，五角星為排名前5的miRNA

3 討 論

OA與高血壓常合并發(fā)病，但兩者在分子層面的共同發(fā)病機(jī)制尚不明確。因而，本研究基于生物信息學(xué)挖掘OA與高血壓共同發(fā)病的關(guān)鍵基因，為從分子角度闡明兩者相互作用機(jī)理提供參考依據(jù)。將OA相關(guān)基因與高血壓相關(guān)基因交集后獲得131個(gè)基因，即為共同發(fā)病基因。通過(guò)GO及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，其基因主要富集于細(xì)胞因子活性、蛋白酶活性等生物功能和PI3K/AKT、TNF及IL-17等信號(hào)通路中。

促炎因子和抗炎因子作為細(xì)胞因子的重要組成部分，兩者的相互作用是OA與高血壓發(fā)病的重要因素。當(dāng)致炎作用強(qiáng)于抗炎作用時(shí)可加快OA進(jìn)展[7]，也可促進(jìn)血管壁增厚或血管收縮而引起高血壓[8]。MMPs是蛋白酶家族的關(guān)鍵成員，可作為加劇OA嚴(yán)重程度和血壓升高的重要誘因[9-10]。而在基因富集的信號(hào)通路中，PI3K/AKT信號(hào)通路參與MMP-13的表達(dá)而加速OA軟骨降解[11]，亦會(huì)影響血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMCs)增殖和血管緊張素分泌，從而誘發(fā)高血壓[12]。涉及TNF信號(hào)通路的TNF-α不僅可誘導(dǎo)多種MMPs及部分炎癥標(biāo)志物的產(chǎn)生導(dǎo)致OA軟骨退變[13]，而且其表達(dá)水平也能有效預(yù)估高血壓患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙所造成的風(fēng)險(xiǎn)大小[14]。在IL-17傳導(dǎo)通路中，阻斷其表達(dá)，既能有效緩解OA疼痛[15]，又能降低血管緊張素II誘導(dǎo)的血壓升高[16]。

進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯⒗?種不同計(jì)算方法分別篩選出排名前20位的基因，交集后獲得IL-6、IGF-1、VEGFA、MMP-9、IL-1B、EGFR、JUN、ICAM-1、EDN-1、CXCL-8、SERPINE-111個(gè)Hub基因。IL-6促進(jìn)關(guān)鍵蛋白酶的產(chǎn)生而引起OA軟骨退變[17]，與其受體結(jié)合后還可激活一系列反應(yīng)誘導(dǎo)高血壓[18]。CXCL-8引起的炎癥反應(yīng)在OA中會(huì)減少原代軟骨細(xì)胞增殖[19]，而在血管壁中卻會(huì)誘發(fā)血管收縮，進(jìn)而導(dǎo)致血壓上升[20]。VEGFA在OA關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨和滑膜中表達(dá)，參與軟骨退變、骨贅形成[21]；亦可誘導(dǎo)VSMCs增殖，而VSMCs異常增殖又是高血壓發(fā)生的關(guān)鍵[22]。MMP-9作為終末期OA炎癥生物學(xué)標(biāo)志之一，可反應(yīng)OA嚴(yán)重程度[23]，同時(shí)也是血管重塑與收縮的關(guān)鍵因素，在一定程度上可視為血壓急性升高的重要信號(hào)[24]。IL-1β與炎癥及疼痛密切相關(guān)，不僅參與OA關(guān)節(jié)軟骨破壞[25]，而且其介導(dǎo)的促炎狀態(tài)與血壓升高也密切相關(guān)[26]。而IGF-1、EGFR、JUN、ICAM-1、EDN-1、SERPINE-1尚未有在OA與高血壓共同發(fā)病的報(bào)道。

通過(guò)對(duì)Hub基因進(jìn)行上游miRNA預(yù)測(cè)，選取前5位miRNA(has-mir-34-5p、has-mir-155-5p、has-mir-16-5p、has-mir-1-3p及has-mir-124-3p)進(jìn)行分析。has-mir-155-5p過(guò)表達(dá)時(shí)，既可以延緩OA進(jìn)展，引起軟骨細(xì)胞增值及細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)分泌[27]，也可作為心血管疾病潛在新生標(biāo)志物，使血壓明顯升高[28]。當(dāng)has-mir-16-5p受到lncRNA SNHG12調(diào)控后，使其表達(dá)水平下降進(jìn)而誘發(fā)OA軟骨細(xì)胞凋亡、ECM降解[29]；此外has-mir-16-5p還可協(xié)同has-mir-19b-5p通過(guò)減少心室纖維化和心肌細(xì)胞凋亡降低高血性心臟病患者的血壓[30]。has-mir-124-3p不僅可調(diào)控IL-6/NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)中藥提取物發(fā)揮效應(yīng)以抑制OA炎癥，減輕軟骨破壞[31]，還是降低血管緊張素Ⅱ依賴(lài)性高血壓的重要影響因素[32]。雖然預(yù)測(cè)has-mir-34-5p、has-mir-1-3p是OA與高血壓共同發(fā)病的miRNA，但尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

綜上所述，本研究挖掘出OA與高血壓共同發(fā)病的關(guān)鍵基因，從生物功能、信號(hào)通路和下游miRNA等相關(guān)特征多維度揭示OA與高血壓合并發(fā)病潛在聯(lián)系，這或可為今后防治兩者合并發(fā)病提供一定的參考依據(jù)。但本研究也存有不少局限之處，例如OA基因芯片包含的樣本數(shù)量不夠大，篩選出來(lái)的差異基因可能存在偏差；此外只在理論層面進(jìn)行研究，缺少動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)，以期尋求更大樣本數(shù)量的基因芯片或多個(gè)芯片進(jìn)行合并擴(kuò)大樣本量，并補(bǔ)充相關(guān)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化此研究方案。