■魏 翊 劉永發(fā) 趙藝竹 江秋雨 咼于明 班志彬，2 張炳坤*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130033）

蛋雞產(chǎn)蛋中后期存在蛋殼厚度逐漸降低、蛋殼品質(zhì)下降的問題[1]。由于蛋殼質(zhì)量問題，雞蛋在收集和運輸?shù)倪^程中破損率達10%～15%，這會給生產(chǎn)企業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失。同時，蛋雞也面臨肝臟和腹部脂肪沉積增加、免疫系統(tǒng)衰退、對疾病抵抗力減弱等問題。甜菜堿屬于季胺型生物堿物質(zhì)，是膽堿的氧化形式，主要存在于麥麩、肉骨粉和甜菜根中，其中麩皮含量最高[2]。甜菜堿作為飼料添加劑主要參與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)[3-5]和能量代謝的調(diào)節(jié)，同時對改善免疫機能和抗氧化也有一定的作用[6-8]。目前，甜菜堿作為一種安全、無毒的營養(yǎng)性飼料添加劑[9-10]，被廣泛應(yīng)用于家禽[6-8]、豬[11]、奶牛[12]、鵝[13]和水產(chǎn)動物[14]的生產(chǎn)上。在育成期和產(chǎn)蛋期蛋雞飼糧中添加1 000 mg/kg甜菜堿可以提高礦物質(zhì)的利用率，改善蛋重和蛋殼厚度[15]。郝生燕等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在22周齡羅曼褐蛋雞飼糧中添加400 mg/kg甜菜堿可以提高入舍母雞產(chǎn)蛋率和蛋重，并改善熱應(yīng)激對蛋雞的損傷，但對哈夫單位、蛋殼強度和蛋殼厚度均無顯著影響。劉茜[17]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加1 000 mg/kg甜菜堿，能顯著降低飼喂7 d蛋雞的破蛋率，增強飼喂14 d蛋雞蛋殼強度且顯著降低蛋雞血漿粒細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞比率。目前，關(guān)于甜菜堿對家禽的研究主要集中在生產(chǎn)性能和脂代謝調(diào)節(jié)，而對蛋品質(zhì)和免疫機能的影響鮮有報道。因此，本試驗旨在研究飼糧中添加甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋品質(zhì)、器官指數(shù)、血常規(guī)指標(biāo)、血清免疫球蛋白和肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，研究甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞免疫機能的影響，為甜菜堿的綜合利用提供理論參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

甜菜堿，純度為98%，白色粉末，由陜西索奧生物科技有限責(zé)任公司提供。蛋品質(zhì)使用蛋品儀（NA?BEL，Co., Ltd., 日本）測定蛋重、蛋殼強度、蛋白高度、哈夫單位、蛋黃重量等；血常規(guī)指標(biāo)測定使用血常規(guī)生化儀（Sysmex K4500，Kobe，Ltd，日本）；血清免疫球蛋白測定使用ELISA酶標(biāo)儀。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗選取46 周齡、體重和產(chǎn)蛋率相近的海蘭褐蛋雞160只，隨機分為兩個處理，每個處理8個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞。預(yù)試期1周，正試期10周。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中添加1 000 mg/kg的甜菜堿，試驗組甜菜堿的添加水平參照前人研究試驗結(jié)果[17]。基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，營養(yǎng)水平參考NRC（1994）和海蘭褐蛋雞管理手冊（2008）配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。飼養(yǎng)試驗于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州試驗基地進行，試驗雞舍采用封閉式三層籠養(yǎng)，自然通風(fēng)和縱向負(fù)壓通風(fēng)相結(jié)合。試驗從蛋雞46周齡開始，至56周齡結(jié)束。試驗期間乳頭飲水器自由飲水和采食，每日飼喂2次，撿蛋1次。每天光照時間16 h，早上6：00補光，晚上22：00熄燈。雞場常規(guī)免疫。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 指標(biāo)采集與測定

1.3.1 蛋品質(zhì)

試驗結(jié)束時（第56周齡），從每個處理中取3個重復(fù)的所有雞蛋立即檢測蛋品質(zhì)。用數(shù)字游標(biāo)卡尺測量長徑、短徑和蛋殼厚度（去除殼膜后，在蛋的大、中、小部位各取樣3份，測量后取平均值），并計算蛋形指數(shù)。將雞蛋平躺在蛋品質(zhì)檢測儀（DET-6000 NABEL Co., Ltd., 日本）上，測定蛋重和蛋殼強度。測定完成后將蛋殼打破，將蛋白和蛋黃倒在托盤上，尖頭端朝里，用蛋品儀測定蛋白高度、哈夫單位和蛋黃顏色。分離蛋黃和蛋殼，使用精度為0.01 g的電子天平測定蛋黃重量和蛋殼重量并記錄。

蛋形指數(shù)=縱徑/橫徑

蛋殼指數(shù)（%）=（蛋殼重/蛋重）×100

1.3.2 器官指數(shù)

試驗期結(jié)束前1 天，對所有試驗雞斷料空8 h 以上，空腹稱重并記錄。試驗雞第56 周齡最后1 天，每個重復(fù)中隨機抽取試驗雞，頸部放血處死，分離肝臟、脾臟和腹部脂肪進行稱重并記錄。肝臟指數(shù)（‰）=（肝臟重/體重）×1 000脾臟指數(shù)（‰）=（脾臟重/體重）×1 000腹脂率（‰）=（腹脂重/體重）×1 000

1.3.3 血常規(guī)和血清生化指標(biāo)

試驗雞第56周齡末，每個重復(fù)隨機選取1只雞翅靜脈分別采血3 mL，于抗凝管和促凝管中。

血常規(guī)指標(biāo)采用血常規(guī)生化儀（Sysmex K4500，Kobe，Ltd，日本）測定白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、中性粒細(xì)胞比率和淋巴細(xì)胞比率等血常規(guī)指標(biāo)。

用于測定血生化指標(biāo)的血樣，需靜置15 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于1.5 mL Eppen?dorf管，-20 ℃保存待用。按照免疫球蛋白IgA 和IgM試劑盒（購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司）說明書檢測，用多功能酶標(biāo)儀（SepctraMax i3x Platform, Molecu?lar Devices, LLC）于450 nm 處讀取數(shù)據(jù)，計算血清中IgA和IgM含量。

1.3.4 肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)

試驗雞第56 周齡末，取肝臟用生理鹽水沖洗凈殘余物，濾紙吸干肝臟表面水分，用10%甲醛固定，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅（H.E.）染色，H.E.染色切片于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理，SPSS 26.0軟件進行獨立樣本t檢驗分析，數(shù)據(jù)以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P≤0.10表示有差異顯著性趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響（見表2）

表2 飼糧中添加甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表2可知，與對照組相比，飼糧中添加1 000 mg/kg甜菜堿能夠極顯著增加產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋殼厚度（P<0.01），對蛋重、蛋殼重、蛋殼指數(shù)、蛋殼強度、蛋白高度、哈夫單位、蛋黃顏色、蛋黃重和蛋形指數(shù)均無顯著影響（P>0.05）。

2.2 甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞器官指數(shù)的影響（見表3）

表3 飼糧中添加甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞器官指數(shù)的影響(‰)

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加1 000 mg/kg甜菜堿能夠極顯著降低產(chǎn)蛋中后期蛋雞腹脂率（P<0.01），對肝臟指數(shù)有降低的趨勢（P=0.063）。但對脾臟指數(shù)無顯著影響（P>0.05）。

2.3 甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞血常規(guī)指標(biāo)的影響（見表4）

表4 飼糧中添加甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞血常規(guī)指標(biāo)的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加1 000 mg/kg甜菜堿顯著提高大型血小板比率（P<0.05），對中性粒細(xì)胞比率有降低的趨勢（P=0.058），但對其他血常規(guī)指標(biāo)均無顯著影響（P>0.05）。

2.4 甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞血清生化指標(biāo)的影響（見表5）

表5 飼糧中添加甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞血清生化指標(biāo)的影響(ng/μL)

由表5可知，與對照組相比，飼糧中添加1 000 mg/kg甜菜堿能夠顯著增加血清中IgA 的含量（P<0.05），對血清中IgM的含量無顯著影響（P>0.05）。

2.5 甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞肝臟形態(tài)的影響（見圖1）

圖1 產(chǎn)蛋中后期肝臟形態(tài)學(xué)檢測

如圖1所示，對照組與試驗組均未見肝臟組織結(jié)構(gòu)存在明顯的病變，但對照組肝臟脂肪空泡的數(shù)量明顯多于試驗組。

3 討論

3.1 甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋品質(zhì)和腹脂沉積的影響

蛋殼具有抵抗外力并使雞蛋內(nèi)容物免受污染和侵害的功能，由于蛋殼質(zhì)量問題，在收集或運輸過程中會損失掉10%～15%的雞蛋[18]，產(chǎn)蛋高峰期后蛋殼品質(zhì)下降尤為嚴(yán)重[19]。許梓榮等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加600 mg/kg甜菜堿降低腹脂沉積，使50周齡和70周齡產(chǎn)蛋雞蛋殼厚度分別提高2.5%和10.81%。然而，也有研究報道，蛋雞飼糧中添加750 mg/kg 的甜菜堿對蛋殼厚度無顯著影響[21]。這可能與試驗所用蛋雞品種、年齡和甜菜堿的添加劑量有關(guān)[17，21-22]。據(jù)報道，產(chǎn)蛋后期蛋殼形成過程中鈣離子ATP 水解酶（Ca2+-ATPase）活性提高[23]，該酶活性受原生質(zhì)膜上磷脂組分的調(diào)控，因此產(chǎn)蛋中后期蛋殼質(zhì)量的好壞，可能與蛋殼腺中脂類成分的變化有關(guān)。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加甜菜堿極顯著降低腹脂率，極顯著增加蛋殼厚度，分析原因可能是甜菜堿的添加減緩了蛋雞腹部脂肪沉積[24]，增強肝臟調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的功能[25]，并減弱了腹部脂肪對蛋殼腺的擠壓，提高Ca2+-ATPase活性，從而改善蛋殼腺功能和蛋殼質(zhì)量。

3.2 甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞免疫機能的影響

研究表明，免疫器官的生長發(fā)育情況直接決定機體的免疫狀態(tài)，決定其對各種應(yīng)急因素的抵抗力[26]。有報道稱，甜菜堿能顯著提高幼齡動物的免疫機能，提高動物存活率[27]。器官指數(shù)通常用于評估飼用添加劑的免疫調(diào)節(jié)作用[28-29]。脾臟是重要的外周免疫器官，是反映機體免疫機能狀態(tài)的重要免疫指標(biāo)，在一定范圍內(nèi)，禽類脾臟指數(shù)越大，機體的免疫能力越強。研究表明，甜菜堿作為甲基供體，參與蛋白質(zhì)合成，在飼糧中添加甜菜堿能促進機體蛋白質(zhì)沉積，增加淋巴細(xì)胞的數(shù)量，進而增加免疫器官的重量[30]。本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加1 000 mg/kg 甜菜堿可提高8%的脾臟指數(shù)，提示產(chǎn)蛋中后期蛋雞飼糧中添加甜菜堿可增強機體免疫力，維持機體健康。

血常規(guī)檢測包括對白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板3大類成分的檢測，通過血液中各類細(xì)胞組分的變化來評估機體的健康水平[31]。白細(xì)胞類中包括粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞[32-33]，具有吞噬異物、抵御病原體入侵的功能。本試驗中，46 周齡蛋雞飼喂甜菜堿后，血液中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比率和淋巴細(xì)胞比率都有不同程度的降低，提示甜菜堿具有抑制機體炎癥反應(yīng)的作用，這與劉茜[17]的試驗結(jié)果一致。本研究結(jié)果還觀察到，飼糧中添加甜菜堿后血液中血小板和大型血小板比率不同程度上升，這與宋明彤等[11]的試驗結(jié)果不一致，可能與試驗動物、飼養(yǎng)管理和試驗周期等有關(guān)，但具體原因尚待進一步探討。

血清IgG、IgA和IgM是機體免疫器官組織產(chǎn)生的體液免疫分子[34]，一定程度上反映機體的免疫水平[35]。血清IgA 是健康正常血清中含量第二的免疫球蛋白，在抵抗微生物入侵和吞噬抗原方面起著重要作用[36]。研究表明，熱應(yīng)激肉仔雞注射甜菜堿，血清免疫球蛋白含量無顯著影響[37]。而本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加甜菜堿可顯著提高56 周齡蛋雞血清中IgA 的含量。目前，尚未見到關(guān)于甜菜堿對產(chǎn)蛋中后期蛋雞免疫機能的研究報道，具體機理尚不清晰，可能與甜菜堿干預(yù)脂質(zhì)代謝有關(guān)[4-5]，進而影響機體免疫反應(yīng)[38-39]。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，飼糧中添加1 000 mg/kg 甜菜堿能顯著提高46～56 周齡蛋雞蛋殼厚度和血清免疫球蛋白含量，降低腹脂率、血液中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比率，改善蛋雞免疫機能，從而保證產(chǎn)蛋中后期蛋雞蛋殼質(zhì)量。