■馮 鑫 周金影 欒嘉明 楊東旭 楊 濛 張 敏 金英海 耿春銀*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué)，東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林 延吉 133000）

棉籽粕是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，但因含有游離棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子，在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用常被限制。游離棉酚是一種具有醛基和活性羥基的棉酚，長期食入可對(duì)動(dòng)物的血管、細(xì)胞神經(jīng)造成危害，使動(dòng)物的生理功能發(fā)生紊亂，影響動(dòng)物的生長發(fā)育[1]，因此棉籽粕的脫毒處理對(duì)其開發(fā)與應(yīng)用尤為重要。

目前，關(guān)于棉籽粕脫毒方法主要有化學(xué)脫毒法、物理脫毒法、生物脫毒法等。微生物固態(tài)發(fā)酵法屬生物脫毒法，是將微生物接種到特定的固態(tài)培養(yǎng)基中，利用微生物在生長代謝過程中會(huì)產(chǎn)生的生物酶，作用于游離棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子，降解游離棉酚或者將游離棉酚轉(zhuǎn)化為結(jié)合棉酚，進(jìn)而達(dá)到降低棉籽粕毒性的目的[2]。微生物固態(tài)發(fā)酵條件溫和，相較傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法對(duì)棉籽粕中營養(yǎng)物質(zhì)的破壞程度較低，具有成本低、效果好、較安全等優(yōu)勢(shì)，是最具前景的棉籽粕脫毒方法之一?？捎糜诮到庥坞x棉酚的微生物主要有假絲酵母、黑曲霉等真菌和枯草芽孢菌和乳酸菌等細(xì)菌[3-4]。由于不同微生物菌種產(chǎn)酶種類及能力不同，對(duì)游離棉酚的降解效果也存在差異，因此篩選優(yōu)良的微生物菌種是保證棉籽餅（粕）脫毒效果和營養(yǎng)價(jià)值的首要步驟，鑒于此目的，本試驗(yàn)選取了不同菌種對(duì)棉籽粕固態(tài)底物進(jìn)行發(fā)酵，以選取出最優(yōu)的發(fā)酵菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉籽粕由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供（見表1），使用前粉碎過40目篩。

表1 棉籽粕營養(yǎng)成分

乳酸菌和酵母菌1 號(hào)由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室保存；黑曲霉菌（菌種編號(hào)為CICC 41481）、紅曲霉菌（菌種編號(hào)為CICC 41606）、地衣芽孢桿菌（菌種編號(hào)為CICC 21112）、枯草芽孢桿菌10071（菌種編號(hào)為CICC 10071）、枯草芽孢桿菌10089（菌種編號(hào)為CICC 10089）均購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；拉曼酵母菌（菌種編號(hào)為CNCMI-1077），購自拉曼營養(yǎng)公司；福邦活性酵母菌，購自福邦酵母股份有限公司。

酵母菌和黑曲霉菌的培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，成分為馬鈴薯淀粉5 g、葡萄糖20 g、氯霉素0.1 g；乳酸菌的培養(yǎng)基為MRS 培養(yǎng)基，成分為蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1.0 mL、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂15 g、純化水1.0 L；紅曲霉菌的培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基，成分為5°Bé麥芽汁1.0 L、瓊脂15 g；枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基成分為蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、氯化鈉（NaCl）5 g、瓊脂20 g、純化水1.0 L；地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)基成分為蛋白胨5 g、牛肉浸提物3 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、純化水1.0 L。以上培養(yǎng)基使用前均在121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，取50 g 棉籽粕于棕色廣口瓶中，加入50 mL 的水（按100%的接水量），分別接入5 mL（按10%的接種量）酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、黑曲霉菌、紅曲霉菌，具體分組見表2，每組6 個(gè)平行，pH 自然，用無菌的玻璃棒攪拌均勻，保鮮膜封蓋廣口瓶，并在保鮮膜上扎口。在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置，好氧培養(yǎng)72 h[5-6]。通過對(duì)發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚含量、營養(yǎng)價(jià)值和酶活性指標(biāo)進(jìn)行分析，比較不同菌種的發(fā)酵效果，選出最優(yōu)的發(fā)酵菌種。

表2 微生物固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的分組情況

1.3 感官指標(biāo)的測(cè)定

樣本發(fā)酵72 h后，每組隨機(jī)抽取3個(gè)進(jìn)行感官評(píng)定。

1.4 游離棉酚和pH的測(cè)定

游離棉酚含量采用國標(biāo)間苯三酚法進(jìn)行測(cè)定[7]，pH使用實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)ST3100進(jìn)行測(cè)定。

1.5 活菌數(shù)的測(cè)定

活菌數(shù)使用計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.6 營養(yǎng)物質(zhì)含量的測(cè)定

粗蛋白含量的測(cè)定使用FOSS 8400 全自動(dòng)凱氏定氮儀；干物質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的含量按GB/T 6435—2014[8]、GB 6433—2006[9]、GB 6438—2007[10]、GB 20806—2006[11]、NY 1459—2007[12]的方法進(jìn)行測(cè)定；半纖維素含量由NDF含量減去ADF含量計(jì)算得出。

1.7 酶活性的測(cè)定

酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶以及纖維素酶活性使用試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測(cè)定；酸性木聚糖酶、中性木聚糖酶、堿性木聚糖酶活性使用試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司）測(cè)定；總淀粉酶含量由α-淀粉酶含量加上β-淀粉酶含量計(jì)算得出。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)的數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 軟件的GLM 模型進(jìn)行方差分析，并用LSD、Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種發(fā)酵對(duì)棉籽粕感官指標(biāo)的影響（見表3）

由表3可知，通過發(fā)酵后的棉籽粕顏色會(huì)較大程度地加深，其中對(duì)照組為黃褐色，伴有棉籽油的香氣。T1、T2、T3組發(fā)酵棉籽粕底物呈深褐色，酒香味濃郁。T4組發(fā)酵后的顏色為深褐色，且伴有濃濃的酸味。T5、T6、T7、T8組發(fā)酵后成深棕色，腐敗味兒濃厚。T9組發(fā)酵后的棉籽粕為深褐色中帶有白色，且伴有醇香味。

表3 不同菌種發(fā)酵棉籽粕底物的感官指標(biāo)變化

2.2 不同菌種發(fā)酵對(duì)棉籽粕游離棉酚含量、pH 及活菌數(shù)的影響（見表4）

表4 不同菌種發(fā)酵對(duì)棉籽粕游離棉酚含量、pH及活菌數(shù)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，T1～T9組的游離棉酚的含量均顯著降低（P<0.05），其中T1組對(duì)棉籽粕的降解效果優(yōu)于其他菌種，游離棉酚降解率高達(dá)75.39%。此外，T1～T9組發(fā)酵后的pH均顯著降低（P<0.05）。除T7 組外，經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵后各處理組相應(yīng)的活菌數(shù)量均較發(fā)酵前有所升高。

2.3 不同菌種發(fā)酵對(duì)棉籽粕底物營養(yǎng)價(jià)值的影響（見表5）

表5 不同菌種發(fā)酵對(duì)棉籽粕底物營養(yǎng)價(jià)值的影響（%）

由表5 可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)菌種發(fā)酵后干物質(zhì)、粗灰分、酸性洗滌纖維以及半纖維素含量均沒有顯著的變化（P>0.05），發(fā)酵棉籽粕的粗脂肪和粗蛋白含量顯著提高（P<0.05），中性洗滌纖維的含量顯著降低（P<0.05）。在粗蛋白方面，T1 組和T8 組的含量顯著高于除T9組外的其他組（P<0.05）。

2.4 不同菌種發(fā)酵對(duì)棉籽粕底物中酶活性的影響（見表6）

表6 不同菌種發(fā)酵對(duì)棉籽粕底物中酶活性的影響（U/g）

由表6可知，與對(duì)照組相比，T1～T9組的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和中性木聚糖酶的活性顯著升高（P<0.05），其他酶活性指標(biāo)沒有顯著性差異（P>0.05）。

3 討論

感官指標(biāo)是評(píng)價(jià)棉籽粕利用效果的最直接的指標(biāo)。在發(fā)酵的前期棉籽粕的黏度較小、物料分散，在發(fā)酵的后期，棉籽粕的黏度增大且呈塊狀。顏色方面，通過不同的菌種固態(tài)發(fā)酵后的棉籽粕底物顏色皆為棕色或褐色，差異不大。氣味方面，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后呈現(xiàn)腐敗氣味，可能與枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過程中發(fā)生脫羧作用或者脫氨作用產(chǎn)生有機(jī)氨、有機(jī)酸和氨氣有關(guān)?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉菌的腐敗氣味也可能與其特性有關(guān)，由于他們皆是好氧菌，在發(fā)酵后期氧氣的供應(yīng)量不足，導(dǎo)致發(fā)酵不充分，發(fā)生結(jié)塊，產(chǎn)生腐敗的味道[14]。紅曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)生醇香味，酵母菌1號(hào)菌、福邦酵母菌、拉曼酵母菌發(fā)酵后呈酒香味，與真菌在固態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生醇類物質(zhì)有關(guān)[15]。乳酸菌產(chǎn)生濃濃的酸味則可能是發(fā)酵過程中生成的有機(jī)酸和乳酸導(dǎo)致的[16]。從實(shí)際生產(chǎn)角度出發(fā)，酒香味和醇香味的適口性更好，可考慮使用酵母菌和紅曲霉菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕。

通過微生物發(fā)酵降解游離棉酚的關(guān)鍵是菌種的選擇，目前報(bào)道的用于棉籽粕脫毒的菌株主要集中于酵母菌和一些天然霉菌。本試驗(yàn)通過不同菌種對(duì)棉籽粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，各組游離棉酚的含量均顯著降低，這可能是由于菌種在發(fā)酵過程中分泌氨基酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)可以與游離棉酚結(jié)合，轉(zhuǎn)化為結(jié)合棉酚，降低游離棉酚的含量[17-19]。通過比較發(fā)現(xiàn)，效果最好的是T1組，對(duì)游離棉酚的降解率高達(dá)75.39%，福邦酵母菌和拉曼酵母菌對(duì)游離棉酚同樣具有很好的脫毒效果，這可能與酵母菌本身所具有的脫毒特性有關(guān)，酵母菌對(duì)真菌毒素、細(xì)菌內(nèi)毒素及其他有害物質(zhì)具有減毒或脫毒作用，酵母菌細(xì)胞壁中的β-葡聚糖及糖蛋白參與了生物脫毒過程[20]。通過對(duì)比可知，酵母菌1號(hào)對(duì)游離棉酚的降解作用最好，其次是拉曼酵母和福邦酵母。pH 既是發(fā)酵的條件也是發(fā)酵的影響因素，在實(shí)際生產(chǎn)中，其高低還是反映飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同菌種對(duì)棉籽粕發(fā)酵后pH 均顯著降低，主要由于菌種在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)。

棉籽粕作為高蛋白質(zhì)飼料，粗蛋白的含量是反映其營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。酵母菌1 號(hào)、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、地衣芽胞桿菌、福邦酵母菌和拉曼酵母菌均可以顯著提高發(fā)酵棉籽粕粗蛋白含量，其中酵母菌1 號(hào)和黑曲霉在提高粗蛋白方面優(yōu)于其他菌。粗蛋白含量的增加一方面是因?yàn)榫N在發(fā)酵過程中消耗了底物中的碳水化合物等物質(zhì)，降低了發(fā)酵產(chǎn)物的總質(zhì)量，使蛋白質(zhì)的比例增加[21-22]，另一方面在發(fā)酵過程中由于微生物生長而釋放出大量的酶或者多肽，使底物中非蛋白物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化形成菌體蛋白，進(jìn)而增加了蛋白質(zhì)的含量[23]。本試驗(yàn)中，不同菌種通過固態(tài)發(fā)酵棉籽粕后會(huì)使棉籽中的粗脂肪含量顯著提高，Sun 等[24]研究中發(fā)現(xiàn)，固態(tài)發(fā)酵棉籽粕后，粗脂肪含量顯著下降，與本試驗(yàn)結(jié)果不同，這可能與發(fā)酵所使用的微生物是否利用脂肪來支持菌體的生長有關(guān)[25]，有待進(jìn)一步探究。此外，本試驗(yàn)中，發(fā)酵后的棉籽粕中性洗滌纖維含量顯著降低，可能與微生物分泌的酶對(duì)纖維結(jié)構(gòu)造成破壞有關(guān)，這也是發(fā)酵后纖維物質(zhì)含量降低的重要原因之一[26]。

蛋白酶是指可以水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶，能提高蛋白質(zhì)的利用率。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，具有提高纖維素利用率的作用。木聚糖酶是半纖維素酶的一種，其含量的高低是反映半纖維素利用率的主要指標(biāo)。淀粉酶則是水解淀粉和糖原的酶類總稱。本試驗(yàn)通過對(duì)不同菌種發(fā)酵后的棉籽粕進(jìn)行酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，酵母菌、紅曲霉菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌和地衣芽孢桿菌均具有提高酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及中性木聚糖酶活性的作用，而對(duì)堿性木聚糖酶、酸性木聚糖酶、半纖維素酶和淀粉酶的活性沒有顯著影響。

4 結(jié)論

綜上，本試驗(yàn)所選用的9株菌種通過固體發(fā)酵均可使棉籽粕游離棉酚的含量降低，改善棉籽粕粗蛋白、粗纖維和中性洗滌纖維的含量，提高酸性蛋白酶、中性蛋白酶和中性木聚糖酶的活性。通過對(duì)發(fā)酵后棉籽粕氣味、營養(yǎng)價(jià)值和酶活性等綜合指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，3個(gè)酵母處理組的效果最好，酵母菌1號(hào)使棉籽粕中游離棉酚的含量降低75.39%，作用效果最顯著。因此，可以考慮選用酵母菌對(duì)棉籽粕進(jìn)行固體發(fā)酵，以達(dá)到脫毒和改善營養(yǎng)價(jià)值的效果。未來，也可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用混合菌種或混合底物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以最大程度地發(fā)揮微生物的脫毒作用。