郝鋼 李宜錚 武星 斯琴 張莉芳 顏皓 韓峰＊

1 內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院 （內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

2 內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢查中心 （內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

內(nèi)容提要：目的：探討目前市場(chǎng)上一次性使用注射器及注射器用活塞的細(xì)胞毒性是否符合GB15810-2001《一次性使用無(wú)菌注射器》、YY/T0243-2016《一次性使用注射器用活塞》的要求。方法：使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（DMEM）作為浸提介質(zhì)，供試品分為兩組，一組取注射器采用公稱容量法浸提；另一組取注射器活塞，按重量法浸提，浸提液分別與L929細(xì)胞接觸培養(yǎng)，采用四唑鹽比色法（MTT法）進(jìn)行吸光度檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率。結(jié)果：部分注射器用活塞細(xì)胞毒性較大。結(jié)論：需要加強(qiáng)對(duì)一次性使用無(wú)菌注射器的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。

一次性使用無(wú)菌注射器目前是各醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床上廣泛使用的醫(yī)療器械，它與患者身體和血液直接接觸，現(xiàn)歸屬于我國(guó)三類醫(yī)療器械產(chǎn)品。由于一次性使用無(wú)菌注射器與人民群眾身體健康和生命安危息息相關(guān)，是國(guó)家重點(diǎn)監(jiān)管的醫(yī)療器械產(chǎn)品之一[1]。醫(yī)療器械與人體間接接觸或植入體內(nèi)后會(huì)與人體發(fā)生非常復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程[2]。因此，一次性使用無(wú)菌注射器與其重要組成部分橡膠活塞的生物學(xué)相容性評(píng)價(jià)也受到越來(lái)越多的關(guān)注。生物相容性體外細(xì)胞毒性評(píng)測(cè)是一種在離體狀態(tài)下，模擬生物體生長(zhǎng)環(huán)境，用于檢測(cè)醫(yī)療器械、藥包材或其浸提液接觸人體組織后可能造成的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞代謝障礙、細(xì)胞變異、細(xì)胞溶解、細(xì)胞死亡等影響細(xì)胞狀態(tài)功能和生物學(xué)反應(yīng)的試驗(yàn)，是現(xiàn)有生物學(xué)評(píng)價(jià)體系中關(guān)鍵的檢測(cè)指標(biāo)之一。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)便、檢驗(yàn)快捷、重現(xiàn)性好、靈敏度高、減少動(dòng)物使用等優(yōu)點(diǎn)被作為評(píng)價(jià)各類醫(yī)用材料和藥品包裝材料毒性的重要指標(biāo)[3]。本院在完成國(guó)家抽驗(yàn)要求法標(biāo)檢驗(yàn)項(xiàng)目的同時(shí)，對(duì)22個(gè)廠家的24批注射器和活塞進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)研究。

1.資料與方法

1.1 一般資料

儀器設(shè)備：美國(guó)賽默飛Thermo Mulitiskan Go酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛Thermo Heracell 150i細(xì)胞三氣培養(yǎng)箱，日本尼康TS100倒置顯微鏡，日本TOMY SX-700滅菌器，德國(guó)Sigma2-6型離心機(jī)，美國(guó)賽默飛Thermo Herafreeze Basic超低溫冰箱，Sangma層流罩。

試劑及材料：DMEM培養(yǎng)基，生產(chǎn)廠家：賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司，批號(hào)：8120035；胎牛血清（FBS），生產(chǎn)廠家：賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司，批號(hào)：1999579；0.25%胰蛋白酶（細(xì)胞消化液），生產(chǎn)廠家：賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)：2120734；青鏈霉素，生產(chǎn)廠家：賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)：2145455；磷酸鹽緩沖液，生產(chǎn)廠家：福州飛凈生物科技有限公司，批號(hào)：190610；噻唑藍(lán)（MTT），生產(chǎn)廠家：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，批號(hào)：MKBR6576V；二甲基亞砜（DMSO），生產(chǎn)廠家：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160428；聚乙烯生產(chǎn)廠家：美國(guó)藥典委，批號(hào)：K0M357。

細(xì)胞株：L-929小鼠成纖維細(xì)胞，購(gòu)于上海子實(shí)生物科技有限公司。

供試品：試驗(yàn)選取22個(gè)廠家24批次的一次性使用注射器，均來(lái)自于國(guó)家監(jiān)督抽驗(yàn)。

1.2 方法

依據(jù)GB15810-2001《一次性使用無(wú)菌注射器》[4]、YY/T0243-2016《一次性使用注射器用活塞》[5]等的要求進(jìn)行檢測(cè)[6,7]。

1.2.1 試驗(yàn)液制備

一次性使用無(wú)菌注射器在無(wú)菌條件下，取同一批號(hào)注射器3支，抽取浸提介質(zhì)至公稱容量，置于37°C培養(yǎng)箱中孵育24h。注射器活塞在無(wú)菌條件下，按0.2g/mL加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24h。在無(wú)菌條件下，按0.2g/mL加入DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），置37°C培養(yǎng)箱孵育24h。取高密度聚乙烯對(duì)照品，按表面積3cm2/mL的比例加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24h，作為陰性對(duì)照液；另用DMEM完全培養(yǎng)基將苯酚配制成5g/L的溶液作為陽(yáng)性對(duì)照液。

1.2.2 細(xì)胞懸液的制備

將已傳代培養(yǎng)48h，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)旺盛的L-929細(xì)胞用胰酶消化液消化2min，用吸管把細(xì)胞從瓶壁上吹打下來(lái)，使貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞混勻后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL。

1.2.3 步驟方法

將上述1×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔100μL，晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞均勻地分布于培養(yǎng)板底部將細(xì)胞培養(yǎng)板置5% CO2濃度培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)24h后，倒去原培養(yǎng)液。再分別加入已制備的樣品浸提液、陰性對(duì)照液、陽(yáng)性對(duì)照液和空白對(duì)照液，加入劑量為100μL每孔，每組做6孔平行樣，再置細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)72h后拿出細(xì)胞培養(yǎng)板置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)后，每孔加5mg/mL的MTT溶液50μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上清液，加入150μL二甲基亞砜作用5min后，慢速震蕩15min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)（570nm和630nm）測(cè)定各孔吸光度值（OD值），按公式（1）計(jì)算相對(duì)增殖率（RGR）。

細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）

注：式中A-供試品組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組吸光度；A0-空白對(duì)照組吸光度。

根據(jù)細(xì)胞相對(duì)增殖率按表1分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定，陰性對(duì)照組的反應(yīng)不得≤1級(jí)，陽(yáng)性對(duì)照組至少達(dá)到3級(jí)反應(yīng)，如陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組反應(yīng)不成立時(shí)應(yīng)重新試驗(yàn)。在陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求的情況下，分析判定細(xì)胞毒性反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果，一般認(rèn)定可接受的供試品細(xì)胞毒性反應(yīng)為≤2級(jí)。

表1.細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)倒置顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)（如圖1所示），并按表2進(jìn)行細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞呈不規(guī)則形狀或梭形，細(xì)胞形態(tài)正常，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)溶解的細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的毒性影響為無(wú)（0級(jí)）；一次性使用無(wú)菌注射器供試品組細(xì)胞也呈梭形或三角形，細(xì)胞形態(tài)正常，貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好；少部分注射器用活塞供試品組細(xì)胞呈圓形或溶解，細(xì)胞層完全破壞，幾乎全部死亡；陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞呈圓形或溶解，細(xì)胞層完全破壞，幾乎全部死亡，對(duì)細(xì)胞的毒性影響為重度（4級(jí)）。

表2.細(xì)胞形態(tài)毒性反應(yīng)分級(jí)

圖1.細(xì)胞形態(tài)圖像

2.2 MTT定量檢測(cè)法

24批一次性使用注射器和注射器用活塞細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可見(jiàn)，在此浸提條件下，24批一次性使用注射器的體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果均符合要求；24批一次性使用注射器用活塞的體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中有87.5%的產(chǎn)品符合要求，而12.5%的產(chǎn)品細(xì)胞毒性較大，不符合我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)要求。由圖2可見(jiàn)，各廠家之間注射器用活塞細(xì)胞毒性存在差異，部分廠家注射器用活塞細(xì)胞毒性較大。

表3.細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果

圖2.細(xì)胞毒性測(cè)試數(shù)據(jù)分析

3.討論

四唑鹽比色法（MTT法）的原理是小鼠成纖維細(xì)胞線粒體酶中的琥珀酸脫氫酶可催化黃綠色的噻唑藍(lán)還原成藍(lán)紫色的物質(zhì)甲臜，用有機(jī)溶劑（如二甲基亞砜）將其溶解成溶液，再通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定其吸收值從而可以定量測(cè)定L929細(xì)胞的存活比例，是目前絕大多數(shù)醫(yī)療器械及材料體外細(xì)胞毒性常用的檢測(cè)方法。其結(jié)果更客觀，具有更好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，適用于對(duì)細(xì)胞毒性物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，現(xiàn)已基本替代了另一種檢測(cè)方法——顯微鏡觀察法[8,9]。而且，MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)所使用的L-929細(xì)胞株，如果代數(shù)差異在11代以內(nèi)基本不會(huì)引起檢測(cè)結(jié)果的差異[10]。此外，體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)更符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則，更加簡(jiǎn)便有效靈敏，并在減少動(dòng)物使用和損傷的前提下，還可以提供可靠的生物安全隱患參考數(shù)據(jù)。

醫(yī)用材料中的一些原料單體、聚合劑、催化劑和乳化劑等易溶出物質(zhì)是造成細(xì)胞毒性作用的主要原因。市場(chǎng)上使用的醫(yī)用注射器活塞仍存在一定程度的細(xì)胞毒性反應(yīng)，產(chǎn)生的原因主要是：①注射器活塞通常采用天然橡膠或合成橡膠，由于天然橡膠成本高，很多廠家在用合成橡膠，但合成橡膠產(chǎn)品質(zhì)量存在很大差異，還有廠家使用再生材料，由此可能產(chǎn)生細(xì)胞毒性；②注射器在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)使用硅油增強(qiáng)滑動(dòng)性，為降低成本，少數(shù)廠家可能存在使用工業(yè)級(jí)硅油代替醫(yī)用硅油，因此導(dǎo)致細(xì)胞毒性。目前，我國(guó)已有自主研發(fā)有較高生物安全性的藥物注射潤(rùn)滑用免溶劑硅油產(chǎn)品進(jìn)入了上市前評(píng)價(jià)階段[11]；③在清洗活塞后，存在洗液殘留導(dǎo)致細(xì)胞毒性[12]。

根據(jù)我國(guó)技術(shù)審評(píng)對(duì)醫(yī)療器械生物相容性的一般要求，目前，對(duì)于二類醫(yī)療器械而言，要求細(xì)胞毒性應(yīng)≤2級(jí)，而對(duì)于三類的醫(yī)療器械，一般要求細(xì)胞毒性應(yīng)≤1級(jí)。在GB/T14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法》[6]的結(jié)果判定中，細(xì)胞增殖率在80%～99%，即被認(rèn)定為細(xì)胞毒性1級(jí)，細(xì)胞增殖率在50%～79%，即被認(rèn)定為細(xì)胞毒性2級(jí)；GB/T16886.5-2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》[7]中細(xì)胞增殖率達(dá)到70%，即被認(rèn)定為無(wú)潛在細(xì)胞毒性。

我國(guó)醫(yī)療器械市場(chǎng)規(guī)模居世界前三位，一次性使用注射器的需求量和使用量十分巨大。據(jù)報(bào)道，我國(guó)醫(yī)療機(jī)構(gòu)每年消耗使用一次性注射器約為150億支，因其涉及到人體給藥，有直接接觸性、開(kāi)放性及創(chuàng)傷性，并且伴隨著如此巨大使用量的是隨之而來(lái)的安全隱患，所以十分需要重視和加強(qiáng)對(duì)于一次性使用注射器的質(zhì)量安全控制?，F(xiàn)階段，我國(guó)仍處于臨床醫(yī)療事故的多發(fā)期，醫(yī)療事故的發(fā)生可能存在有醫(yī)療器械的潛在危害性未被及時(shí)準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)，出于對(duì)廣大患者的生命安全保障的考慮，亟待研究出更多有效的檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)方法來(lái)考察和控制一次性無(wú)菌注射器的生物安全[13]。同時(shí)，建議我國(guó)監(jiān)管檢測(cè)部門繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)一次性使用無(wú)菌注射器及活塞的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，有效地完善我國(guó)對(duì)無(wú)源醫(yī)療器械及材料的生物相容性研究，增加針對(duì)性更強(qiáng)的生物相容性檢查項(xiàng)目，以較全面的評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量，督促?gòu)S家改進(jìn)生產(chǎn)工藝，保障人民的用械安全。