符小鵬，曹林佳，王穎馨，章薇，王秋靜，肖曼

(1.海南醫(yī)學(xué)院2013級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，海南 ?？?571101；2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，海南 ?？?571101)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性炎癥性疾病，其特點是關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、軟骨吸收、骨質(zhì)破壞和骨質(zhì)纖維化。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在各年齡中均可發(fā)病。臨床尚未找到一種理想的藥物能完全治愈此類疾病。目前普遍認(rèn)為RA的炎癥水平與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-1β、IL-6等表達(dá)相關(guān)，TNF-α、IL-1在機體的變態(tài)反應(yīng)及自身免疫性疾病發(fā)病中的作用成為時下研究類風(fēng)濕相關(guān)熱點。雞矢藤(Peaderia scandens)，別名牛皮凍，為茜草科雞矢藤屬植物，在海南有大量的生長與分布，雞矢藤有消食祛風(fēng)濕、活血消腫等功效。雞矢藤應(yīng)用涉及鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等多方面，對疼痛、癌癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多個病癥具有防治作用。本實驗采用Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)制備小鼠CIA模型，觀察雞矢藤對RA的防治作用，并進(jìn)一步研究雞矢藤對模型小鼠血清中的TNF-α和IL-1β的影響，以深入探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

選取60只5～6周齡的昆明種小鼠(由海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，隨機均分為空白組(灌喂水)、模型組(灌喂水)、低濃度組(模型小鼠灌胃2 g/kg/day PSE)、中濃度組(模型小鼠灌胃10 g/kg/day PSE)、高濃度組(模型小鼠灌胃50 g/kg/day PSE)、酮洛芬組(模型小鼠灌胃5 mg/kg/day 酮洛芬)共6組，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。小鼠均在溫度、燈光自動控制的動物室飼養(yǎng)(溫度22℃、濕度60%)，自由飲食。

1.2 主要試劑及儀器

Ⅱ型膠原蛋白、弗氏完全佐劑來自美國sigma公司。游標(biāo)卡尺來自桂林廣陸數(shù)字測控有限公司；超速低溫離心機來自美國Eppendorf公司產(chǎn)品；小鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒來自伊萊瑞特生物科技有限公司；孵育箱來自德國Eppendorf公司產(chǎn)品；酶聯(lián)免疫檢測儀來自德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 藥物處理

雞矢藤從北京同仁堂(集團(tuán))有限責(zé)任公司購買，并由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院劉嬙副教授鑒定，樣本留存編號(174)。雞矢藤水煎液：取雞矢藤全草，用水煎煮3次，過濾后，凍干保存。

1.4 ClA模型的建立

實驗前，將牛Ⅱ型膠原蛋白溶解在0.1 mol/L的乙酸中，在低溫(4℃)通過混勻使蛋白充分溶解，所得的混合液質(zhì)量濃度為2 g/L，放置在4℃冰箱中過夜，之后配置完成2 g/L的弗氏完全佐劑；將兩種混合液等體積進(jìn)行混合、震蕩、乳化，制作成含有Ⅱ型膠原的乳劑，此時每1 mL的乳劑中含有1 mgⅡ型膠原蛋白與1 mg卡介苗。用該乳劑對每只小鼠的尾部根處多點進(jìn)行皮內(nèi)注射，劑量為0.1 mL，此時記為第0 d，在第20 d時再次用0.1 mL該乳劑進(jìn)行腹腔注射用于，加強免疫。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 小鼠關(guān)節(jié)腫脹度測定及關(guān)節(jié)評分

各組分別于0、4、8、12、16、20、24、28 d測定踝關(guān)節(jié)腫脹度，以小鼠后足造模前與造模后足墊厚度作為關(guān)節(jié)腫脹度。觀察小鼠后足爪，并按如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。小鼠爪子關(guān)節(jié)正常，沒有紅腫記為0分；小鼠足踝或足趾輕微紅腫記為1分；小鼠足踝或足趾中度紅腫記為2分；小鼠整個足爪嚴(yán)重紅腫記為3分；小鼠足爪關(guān)節(jié)變形導(dǎo)致小鼠行動不便記為4分。小鼠關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)評分用于評估各組小鼠發(fā)病情況并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5.2 小鼠關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)觀察

取小鼠完整踝關(guān)節(jié)組織去皮后置于10%中性福爾馬林中固定，8%EDTA溶液脫鈣，常規(guī)梯度脫水、浸蠟、包埋、切片，蘇木素—伊紅(HE)染色。光鏡下觀察炎性細(xì)胞的浸潤和小血管的增生、軟組織的水腫及組織纖維化等情況。

1.5.3 小鼠血清TNF-α、IL-1β檢測

采用ELISA方法按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，先加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，設(shè)陰性對照，37℃反應(yīng)30 min溫育，后洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)，洗板5次，加入顯色液，37℃顯色15 min，加入終止液，酶標(biāo)儀檢測吸光度(OD值)，重復(fù)3次，取平均值。

1.5.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般狀態(tài)觀察

空白組以及中濃度PSE組和高濃度PSE組的小鼠精神飽滿，飲食規(guī)律，符合喂養(yǎng)量要求；體毛潤滑光澤，活動正常，行動迅速；排尿及排便正常且無其他異常表現(xiàn)。低濃度PSE組以及模型組的小鼠的精神尚可，飲食規(guī)律但低于喂養(yǎng)量的要求；體毛欠光澤；少動且行動稍緩；排尿及排便量正常且無其他異常表現(xiàn)。模型組精神欠佳；體毛無光澤且稀疏；少動且行動遲緩。

2.2 雞矢藤水煎液對膠原誘導(dǎo)性小鼠RA關(guān)節(jié)腫脹度的影響

CIA建模后，小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度顯著增加，在建立模型后26 d達(dá)到高峰，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。經(jīng)各濃度PSE及酮洛芬處理后，小鼠關(guān)節(jié)腫脹度在給藥后關(guān)節(jié)腫脹度均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)，見表1。各組小鼠關(guān)節(jié)組織對比結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠關(guān)節(jié)腫脹情況比較

表1 雞矢藤水煎液對膠原誘導(dǎo)性小鼠RA關(guān)節(jié)腫脹度的影響(± s，N=10)

模型組小鼠的平均關(guān)節(jié)指數(shù)臨床評分達(dá)3分。相對模型組，各組小鼠關(guān)節(jié)紅腫情況明顯緩解，其中以高濃度組和酮洛芬組的關(guān)節(jié)評分曲線快速下調(diào)，見圖2。

圖2 雞矢藤水煎液對膠原誘導(dǎo)性小鼠RA關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)評分的動態(tài)變化

2.3 雞矢藤水煎液對各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)的影響

空白組小鼠關(guān)節(jié)組織未見明顯炎性細(xì)胞浸潤、軟組織的水腫及內(nèi)部血管的擴增；模型組小鼠的關(guān)節(jié)組織可見軟組織的水腫及內(nèi)部血管的擴增，所占視野大于60%，血管周圍滿布炎癥細(xì)胞(以中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞為主)，存在重度組織纖維化；PSE低濃度組關(guān)節(jié)組織關(guān)節(jié)軟組織局部中度炎癥細(xì)胞浸潤，小血管增生，血管周圍存在多數(shù)的炎癥細(xì)胞，可見軟組織水腫；PSE中濃度組關(guān)節(jié)可見局部輕度炎癥細(xì)胞浸潤，所占視野小于30%，有輕微小血管增生，無組織纖維化；PSE高濃度組僅見少數(shù)小血管增生，無明顯炎性細(xì)胞浸潤、水腫；酮洛芬組小鼠關(guān)節(jié)可見少許炎癥細(xì)胞浸潤，但無明顯的組織水腫及小血管增生，見圖3。

圖3 各組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度對比

2.4 雞矢藤水煎液對膠原誘導(dǎo)性小鼠RA血清中TNF-α和lL-1β水平的影響

在RA模型小鼠中，血漿中TNF-α含量顯著升高；經(jīng)中濃度及高濃度PSE及酮洛芬處理后TNF-α含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義((＜0.05)。相似的，在RA模型小鼠中，血漿中IL-1β含量顯著升高；經(jīng)各濃度組PSE及酮洛芬處理后，IL-1β含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義((＜0.05)，見圖4。

圖4 雞矢藤水煎液對膠原誘導(dǎo)性小鼠RA血漿中炎癥因子的影響。血漿中TNF-α，和lL-1β水平。

3 討 論

RA是一種以對稱性多關(guān)節(jié)炎病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，病變前期主要是關(guān)節(jié)滑膜的炎癥性病變表現(xiàn)，末期則會發(fā)生滑膜細(xì)胞的增生，以及骨和軟骨的進(jìn)行性破壞。RA關(guān)鍵的病理表現(xiàn)是關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥，早期表現(xiàn)是關(guān)節(jié)滑膜的水腫充血，隨著病情進(jìn)展可出現(xiàn)血管翳、軟骨和軟骨下骨破壞并出現(xiàn)病變的關(guān)節(jié)部分。許多種類的免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)共同參與RA的一系列發(fā)病過程，對RA的異常免疫反應(yīng)有著非常重要的作用，其中Ⅱ型膠原蛋白能誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎癥的產(chǎn)生，對實驗參考具有臨床意義。

研究發(fā)現(xiàn)，免疫因子TNF-α和IL-1β在RA的病情發(fā)生發(fā)展過程中有著十分關(guān)鍵的作用。TNF-α是在RA免疫反應(yīng)過程中有著重要地位的炎癥介質(zhì)，其在引起組織損傷和介導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)起著重要的作用。RA病變關(guān)節(jié)滑膜中的滑膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，是TNF-α的主要來源。一般來說，TNF-α和IL-1β兩種細(xì)胞因子能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素的活性，強化中性粒細(xì)胞的集聚，內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子和活化的中性粒細(xì)胞發(fā)生黏附，不斷向關(guān)節(jié)滑膜蔓延，分泌出炎癥介質(zhì)，引發(fā)RA關(guān)節(jié)部位的炎癥反應(yīng)。Chen CJ等認(rèn)為TNF-α和IL-1β是炎癥的啟動因素，能夠與關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中的IL-1β受體相互產(chǎn)生反應(yīng)，使接頭蛋白MYD88發(fā)生激活，通過使NF-kB啟動，引發(fā)繼發(fā)性的炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，增加關(guān)節(jié)受損。上述機制反映抑制RA患者血清中TNF-α和IL-1β兩種炎性介質(zhì)的水平，使免疫通路的失調(diào)，從而破壞自身組織和抗原的免疫，是阻斷RA炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子損傷關(guān)節(jié)的途徑。此為治療RA炎癥反應(yīng)進(jìn)行性發(fā)生發(fā)展導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織破壞的有效方式之一。

本實驗結(jié)果提示：CIA建模21 d后，模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組、酮洛芬組與空白組進(jìn)行比較，其小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度顯著增高。說明Ⅱ型膠原蛋白能夠引發(fā)小鼠的關(guān)節(jié)炎，且免疫反應(yīng)方面與人類RA十分類似，這與文獻(xiàn)報道的相同，特別是Th細(xì)胞及其分泌的致炎細(xì)胞因子在RA的發(fā)病過程中起著非常關(guān)鍵的作用。因此本實驗采用CIA小鼠為模型來探究雞矢藤水煎液對RA的部分作用機理。通過給藥處理28 d后發(fā)現(xiàn)雞矢藤與酮洛芬均能降低CIA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度及TNF-α和IL-1β的水平，及能夠改善關(guān)節(jié)組織中炎性細(xì)胞的浸潤、血管新生及軟組織的水腫情況，且高濃度組較為明顯。該結(jié)果提示雞矢藤水煎液對CIA小鼠具有一定的抑制效果，能夠降低小鼠血中TNF-α、IL-1β的水平。

綜上所述，雞矢藤對小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用，能夠降低CIA小鼠血清中TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平，從抑制炎性細(xì)胞蔓延、緩解關(guān)節(jié)滑膜的損傷，起到減輕關(guān)節(jié)炎癥的作用，因此雞矢藤水煎液對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有治療效果。本實驗旨在針對雞矢藤水煎液對小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的影響，研究其抗風(fēng)濕機制，為雞矢藤的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)，為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供新的治療藥物。