張 將，孫玉霞，管雪強，余曉斌*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.新疆冰雪果業(yè)有限責(zé)任公司，新疆 哈密 839399；3.山東省葡萄研究院 山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250199）

哈密瓜（Cucumis meloL.）在國內(nèi)外被廣泛種植，總產(chǎn)量高達2 700萬t[1]，其中新疆地區(qū)年產(chǎn)85萬t[2]。由于哈密瓜成熟期相對集中[3-4]、含酸量低[5]、內(nèi)生微生物豐富[6]等原因，哈密瓜浪費嚴重，商品率僅有70%[7]。為減少浪費，提高附加值，將過剩的水果加工成相應(yīng)的蒸餾酒，是被廣泛采用的深加工方式[8-9]。因此，將哈密瓜加工成蒸餾酒具有可行性和重要意義。

水果蒸餾酒的揮發(fā)性物質(zhì)是影響其品質(zhì)的重要因素[8]，受到水果品種[10]、原料產(chǎn)地[11]、生產(chǎn)工藝[7]等因素的影響?；诖?，為保持風(fēng)味的獨特性，著名的白蘭地干邑（Cognac）對其原料的品種和產(chǎn)地以及蒸餾方式等生產(chǎn)因素做出限制性規(guī)定[8，11]。國內(nèi)外對哈密瓜的研究多集中在熱處理異味[3，7]、非熱滅菌[12]、保鮮[1，6]、哈密瓜風(fēng)味形成[13-15]等方向。目前對哈密瓜蒸餾酒的研究有一些報道，LUIS F H等[16]的研究結(jié)果表明，清汁發(fā)酵和壺式蒸餾酒有更好的感官評價，原苗苗等[17-18]的研究表明，揮發(fā)性物質(zhì)隨蒸餾過程在酒頭或酒尾集中，不同商用酵母的蒸餾酒揮發(fā)性物質(zhì)不同。但基于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)因素影響哈密瓜蒸餾酒揮發(fā)性物質(zhì)的研究鮮見報道。

因哈密瓜品種與種植區(qū)域以及加工輔料等生產(chǎn)因素的差異，對哈密瓜蒸餾酒產(chǎn)品一致性的保持提出挑戰(zhàn)。本研究擬利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometer，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)分析不同生產(chǎn)因素（原料品種、原料產(chǎn)地、酵母、氮源）對哈密瓜蒸餾酒揮發(fā)性物質(zhì)的影響，并對結(jié)果進行主成分分析（principal component analysis，PCA）?；诠I(yè)生產(chǎn)規(guī)模生產(chǎn)因素進行研究，更能反映工業(yè)生產(chǎn)的真實情況，以期為保持哈密瓜蒸餾酒產(chǎn)品的一致性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

西州蜜哈密瓜：產(chǎn)地為哈密大南湖、伊吾淖毛湖；銀蒂哈密瓜：產(chǎn)地為瓜州南岔鎮(zhèn)；金花蜜哈密瓜：產(chǎn)地為伊吾淖毛湖；哈密瓜原料均為成熟的、無霉爛的商品級哈密瓜。酵母（Saccharomyces cerevisiae）K1、KD：法國拉曼集團。

1.1.2 試劑

乙酸乙酯、辛酸乙酯等51種標準品（純度均＞98%）、4-甲基-2-戊醇（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；正構(gòu)烷烴混合物（C5～C25）：安普（中國）有限公司；無水乙醇、氯化鈉（均為分析純）：國藥集團（上海）有限公司；有機氮源Fermaid O：法國拉曼集團。

1.2 儀器與設(shè)備

DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm）：美國Supelco公司；7890A-5977B氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀、DB-WAX色譜柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）：美國安捷倫公司；PAL RSI 85自動進樣器：瑞士CTC公司；20 t-套型前處理設(shè)備：新鄉(xiāng)豐潤公司；30 t不銹鋼發(fā)酵罐：泰安鯤鵬公司；2.5 t雙釜蒸餾設(shè)備：煙臺誠達蒸餾設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 哈密瓜蒸餾酒的生產(chǎn)工藝流程及操作要點

哈密瓜挑選→清洗→破碎→去籽→壓汁→接種→發(fā)酵→蒸餾→成品蒸餾酒

操作要點：

原料前處理：挑選無霉爛，表面沒有明顯破損的哈密瓜作為原料。挑選后的哈密瓜置入前處理設(shè)備進行清洗、破碎、去籽、壓汁。

接種與發(fā)酵：將獲得的哈密瓜汁注入發(fā)酵罐，接種酵母（0.2 g/L），室溫（17～25 ℃）下發(fā)酵，當發(fā)酵液沒有明顯氣泡產(chǎn)生且比重降低至0.995后，發(fā)酵結(jié)束。

蒸餾：將發(fā)酵結(jié)束的哈密瓜原料酒置入蒸餾釜中進行蒸餾。蒸餾方式參照之前研究，采用雙釜串聯(lián)法[19]，截取酒精度＞55%vol的酒心，即得哈密瓜蒸餾酒成品。

1.3.2 不同哈密瓜蒸餾酒樣的制備

參照哈密瓜蒸餾酒的生產(chǎn)工藝，采用不同原料品種、原料產(chǎn)區(qū)、酵母及氮源添加制備哈密瓜蒸餾酒樣品（表1），每種處理3個重復(fù)。

表1 不同生產(chǎn)因素哈密瓜蒸餾酒樣品Table 1 Hami melon spirits samples with different production factors

1.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)的測定

樣品前處理：將4 990 μL酒精度稀釋至12%vol的樣品和2.5 g NaCl置入15 mL的萃取瓶中，加入10 μL內(nèi)標4-甲基2-戊醇（質(zhì)量濃度為0.819g/L）。37℃預(yù)加熱15min，然后將固相微萃取針插入萃取瓶中萃取30 min，解吸時間10 min。

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；初始溫度45 ℃，然后以3 ℃/min的速度升至220 ℃，維持3 min；載氣為高純氦氣（He），恒定流速1 mL/min；進樣器溫度250 ℃，不分流進樣。

質(zhì)譜條件：檢測器溫度220 ℃；電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)譜采集類型為全掃描模式，掃描范圍40～420 m/z。

定性分析：通過與美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）11標準譜庫（https：//www.nist.gov/）進行比較初步判定，再結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）對蒸餾酒的揮發(fā)性化合物進行定性。

定量分析：有標準品的揮發(fā)性物質(zhì)采用外標法定量；沒有標準品的揮發(fā)性物質(zhì)，用內(nèi)標進行半定量分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示。用方差分析（analysis of variance，ANOVA）對揮發(fā)性物質(zhì)進行差異性分析，并采用Dunnett多重比較進行差異判斷。當P＜0.05時，被判定為差異顯著。使用主成分分析（PCA）來確定不同樣品之間的關(guān)系，包括全部樣品及檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)。ANOVA和PCA均使用SPSS 19.0進行分析，用Origin Pro 9.5制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈密瓜蒸餾酒揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS分析

不同生產(chǎn)因素哈密瓜蒸餾酒樣的揮發(fā)性化合物含量見表2。由表2可知，不同生產(chǎn)因素哈密瓜蒸餾酒樣共檢測出揮發(fā)性物質(zhì)76種，其中酯類23種，占30.26%；醇類12種，占15.79%，萜烯類8種，占10.52%，醛酮類5種，占6.58%，酸類4種，占5.26%，呋喃類4種，占5.26%，含硫化合物3種，占3.95%，其他2種，占2.63%。其中12種化合物在各蒸餾酒中均有檢出，包括異丁醇、異戊醇、1-壬醇、順-3-壬烯-1-醇、2,6-二甲基-4-庚酮、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、二甲基二硫。

表2 不同生產(chǎn)因素哈密瓜蒸餾酒樣品揮發(fā)性化合物含量檢測結(jié)果Table 2 Determination results of volatile compounds contents in Hami melon spirits samples with different production factors

續(xù)表

在哈密瓜蒸餾酒中檢測到10種風(fēng)味物質(zhì)，分別是1-壬烯-3-醇、順-6-壬烯-1-醇、（3E,6Z）-壬二烯-1-醇、順-3-壬烯-1-醇、1-壬醇、壬醛、2-壬烯醛、乙酸壬酯、壬酸乙酯、乙酸壬-3-烯酯。這些物質(zhì)均是具有9個碳原子的醇和其衍生物，有研究結(jié)果表明，這10種物質(zhì)為哈密瓜中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)[13-14]，與哈密瓜脂肪酸代謝相關(guān)[1，13，15]，通常被描述為青瓜味、黃瓜味、甜瓜味或生青味[13，20]。這些物質(zhì)可能也是哈密瓜蒸餾酒的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，需要進一步研究。

2.2 不同哈密瓜蒸餾酒揮發(fā)性物質(zhì)比較

不同哈密瓜蒸餾酒樣中各類揮發(fā)性物質(zhì)總量比較結(jié)果見圖1。

2.2.1 醇類

由圖1a可知，在不同哈密瓜蒸餾酒樣品中，與樣品B相比，樣品A的醇類物質(zhì)含量下降，但是差異不顯著（P＜0.05），因此，有機氮源的添加不會顯著影響醇類物質(zhì)含量。高級醇通常由酒精發(fā)酵的次級代謝產(chǎn)物或氨基酸埃里希反應(yīng)生成。在酒中的含量較少時，高級醇可以增強風(fēng)味的復(fù)雜性，而含量較多時，影響風(fēng)味的優(yōu)雅與細膩[8，21]。由于其在蒸餾過程中的回收率高達90%[8]，酒中高級醇含量應(yīng)予以特別關(guān)注。由表1可知，不同的生產(chǎn)因素使得樣品中高級醇的種類和含量差異較大。其中共有的物質(zhì)僅有異丁醇、異戊醇、1-壬醇、順-3-壬烯-1-醇，且這4種物質(zhì)也是哈密瓜蒸餾酒中含量最高的高級醇。異丁醇與異戊醇，通常對蒸餾酒風(fēng)味有負面影響[8]。

圖1 不同生產(chǎn)因素哈密瓜蒸餾酒樣中各類揮發(fā)性物質(zhì)總含量的比較Fig. 1 Comparison of total contents of various types compounds in Hami melon spirits samples with different production factors

氮源的添加可能影響了氨基酸埃里希反應(yīng)，使得高級醇總含量下降29.8%，然而并未顯著影響異丁醇與異戊醇的含量。推測異丁醇、異戊醇的主要生成途徑不是埃里希反應(yīng)。另外，酵母KD的使用使得異丁醇和異戊醇含量分別提高5倍和7倍。在相同酵母條件下，西州蜜（A、B、C）蒸餾酒中兩種雜醇的含量也普遍高于銀蒂（D）和金花蜜（E）。特別的是，哈密瓜關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)1-壬醇、順-3-壬烯-1-醇的含量[13]，受到品種的影響，其在銀蒂（D）蒸餾酒中含量普遍高于西州蜜（A、B、C）和金花蜜（E、F）蒸餾酒。由圖1可知，產(chǎn)區(qū)差異并未影響A、C蒸餾酒中總高級醇含量，而酵母差異影響顯著，F(xiàn)蒸餾酒中的總高級醇含量顯著高于E蒸餾酒（P＜0.05）。

2.2.2 醛酮類

由1b可知，樣品A與樣品B相比，醛酮類物質(zhì)含量有差異，但不顯著（P＞0.05），而樣品A醛酮類物質(zhì)含量（11.34 mg/L）顯著高于樣品C（1.15 mg/L），可見氮源和產(chǎn)地可以影響醛酮類物質(zhì)含量。樣品C與樣品E相比以及樣品E與樣品F相比醛酮類物質(zhì)含量沒有顯著差異（P＞0.05），因此品種和酵母對醛酮總量的影響不顯著。

由表1可知，不同哈密瓜蒸餾酒醛酮類的含量和種類差異較大，僅有2,6-二甲基-4-庚酮為全部蒸餾酒共有。2,6-二甲基-4-庚酮通常被描述為有薄荷和新鮮青葉氣味[22]，含量不受到品種和酵母的影響，而不同產(chǎn)區(qū)的西州蜜蒸餾酒（A、C）中2,6-二甲基-4-庚酮差異顯著（P＜0.05）。另外，壬醛、2-壬烯醛被描述為紙殼或青草味[21]，壬醛在西州蜜（B）蒸餾酒中含量最高（4.38 mg/L），2-壬烯醛也僅在樣品B中被檢出，表明不添加氮源有助于兩種醛的生成。具有牛奶和蘑菇氣味的3-辛酮，受哈密瓜品種和產(chǎn)區(qū)的影響，僅在哈密大南湖的西州蜜蒸餾酒（A、B）中檢測到。

2.2.3 酸類

由圖1c可知，金花蜜蒸餾酒（F）產(chǎn)酸量（2.32 mg/L）相較于金花蜜蒸餾酒（E）（3.32 mg/L）顯著降低（P＜0.05），酵母對酒中的揮發(fā)酸總量產(chǎn)生了顯著影響，這與前人研究相一致[23]。因此，酵母KD導(dǎo)致其含量較低。揮發(fā)性酸類物質(zhì)通常具有刺激性的異味，與酵母代謝以及細菌的活動有關(guān)。樣品C與樣品E的揮發(fā)酸總量差異顯著（P＜0.05），樣品A與樣品C的揮發(fā)酸總量差異顯著（P＜0.05），因此，品種和產(chǎn)區(qū)對揮發(fā)酸總量也產(chǎn)生了一定的影響，可能由于不同產(chǎn)區(qū)或品種的哈密瓜本身的細菌含量差異導(dǎo)致的[6]。

2.2.4 酯類

由圖1d可知，大南湖西州蜜蒸餾酒（A、B）酯類總量顯著高于淖毛湖西州蜜蒸餾酒（C）（P＜0.05）。除大南湖西州蜜以外，其他產(chǎn)區(qū)和品種的哈密瓜蒸餾酒（C、D、E、F）酯類總量差異不顯著（P＞0.05）。由表1可知，酯類是哈密瓜蒸餾酒中含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)，乙酸乙酯、己酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸異戊酯6種常見風(fēng)味物質(zhì)在全部酒樣中均被檢出。樣品A的酯類物質(zhì)總量（678.09 mg/L）顯著高于樣品C（102.19 mg/L）（P＜0.05），受產(chǎn)區(qū)的影響，而品種、酵母和氮源對酯類總量沒有影響。

其中含量較高的乙酸乙酯是清香型白酒的主要風(fēng)味物質(zhì)[24]，然而在水果蒸餾酒中或葡萄酒中有溶劑的氣味，呈現(xiàn)負面影響[8]。樣品A的乙酸乙酯含量（78.54 mg/L）低于樣品B（142.04 mg/L），氮源的添加顯著降低了乙酸乙酯含量（P＜0.05）。此外，氮源的添加顯著增加了壬酸乙酯的含量（P＜0.05），且增加具有果香的乙酸壬酯含量，或?qū)φ麴s酒風(fēng)味有積極影響[23]。另外，乙酸壬-3-烯酯只在哈密大南湖蒸餾酒（A、B）有檢出。

2.2.5 萜烯類

萜烯類物質(zhì)通常以前體物質(zhì)存在，糖苷鍵經(jīng)酸水解或酶水解成為游離狀態(tài)而呈現(xiàn)風(fēng)味活性。萜烯類物質(zhì)的閾值較低，在水果和酒精飲料中起到重要作用[8，10]。由圖1e可知，金花蜜蒸餾酒（E、F）萜烯類物質(zhì)含量高于其他樣品。比較蒸餾酒A和蒸餾酒C，以及蒸餾酒A和蒸餾酒B可知，哈密大南湖產(chǎn)區(qū)以及氮源的添加均有助于萜烯類物質(zhì)的產(chǎn)生。

其他各生產(chǎn)因素對萜烯含量也有影響，由表1可知，具有甜橙香和檸檬氣味的檸檬醛[25]，僅在哈密大南湖的西州蜜蒸餾酒（A、B）中有檢出。松油醇只在西州蜜蒸餾酒（A、B、C）中被檢出。大馬酮、橙花叔醇、紫羅蘭酮、芳樟醇等常見萜烯類物質(zhì)在不同樣品中含量不同，但是未表現(xiàn)受生產(chǎn)因素影響的規(guī)律。

2.2.6 苯環(huán)類

檢測出的苯環(huán)類物質(zhì)以甲基苯和萘類物質(zhì)為主，也有少量酚類物質(zhì)，通常呈現(xiàn)煙熏味、中藥味[24]。苯環(huán)類物質(zhì)的種類及含量都受到了生產(chǎn)因素的影響。由圖1f可知，樣品F較樣品E降低了苯環(huán)類物質(zhì)的總含量，樣品A較樣品C提高了苯環(huán)類物質(zhì)總含量，氮源的添加可以提高苯環(huán)類物質(zhì)的總含量。

由表1可知，苯乙醇僅在樣品A和C中檢出，呈現(xiàn)玫瑰香和甜香，通常對酒的風(fēng)味有積極的影響[25]。1-（2,3,6三甲基苯）-1,3丁二烯存在于葡萄和葡萄葉中，具有強烈的生青味，被確定為葡萄酒重要的異味物質(zhì)[26]，在哈密瓜及相關(guān)加工產(chǎn)品中首次檢出。除了哈密大南湖產(chǎn)地蒸餾酒（A、B）沒有檢出外，其余酒樣均有檢出，值得特別關(guān)注。4-甲基愈創(chuàng)木酚也叫焦油酚，具有煙熏味和丁香味[24]，在淖毛湖西州蜜、銀蒂和金花蜜蒸餾酒（C、D、E、F）中均有檢出，但是大南湖西州蜜蒸餾酒（A、B）中沒有檢出。而α-杜松子油醇和β-杜松子油醇的含量受到品種的影響，僅在銀蒂蒸餾酒（D）中檢出。

2.2.7 含硫化合物

不同哈密瓜蒸餾酒中共檢測出3種含硫化合物，均呈現(xiàn)爛白菜氣味，是加熱后的哈密瓜汁異味的重要來源[3，27]。其中二甲基硫，由蛋氨酸親核取代反應(yīng)生成，而二甲基二硫、二甲基三硫的生成由蛋氨酸產(chǎn)生的甲硫醇經(jīng)氧化和降解生成，有研究表明，其在果皮較厚的瓜中含量較高[3，27]。由圖1g可知，樣品A、B的總硫含量高于其他樣品（P＜0.05），其原因可能是，西州蜜的果皮比銀蒂與金花蜜更厚，這與前人研究結(jié)果相同[3，27]。

2.2.8 呋喃類

呋喃類化合物通常具有溫和的木頭或化學(xué)試劑味[25]。由圖1h可知，除在樣品C中未檢測到外，在其他酒樣中都有檢出。酒樣A中含量最高（9.91 mg/L），顯著高于其他樣品（P＜0.05）。樣品B、D、E、F中呋喃類物質(zhì)的總含量差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.9 其他類物質(zhì)

其他類物質(zhì)主要由烯烴類和雜環(huán)類物質(zhì)組成，均未見有關(guān)風(fēng)味方面報道。由圖1i可知，也未表現(xiàn)出受生產(chǎn)因素影響的規(guī)律。

2.3 哈密瓜蒸餾酒樣的揮發(fā)性風(fēng)味成分主成分分析

對全部樣品中檢出揮發(fā)性物質(zhì)進行PCA，結(jié)果見圖2。

圖2 不同生產(chǎn)因素哈密瓜蒸餾酒樣品揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析結(jié)果Fig. 2 Principal component analysis results of the volatiles in Hami melon spirits samples with different production factors

由圖2可知，前3個主成分的總方差貢獻率達81.57%，其中PC1方差貢獻率42.17%，PC2方差貢獻率22.27%，PC3方差貢獻率17.13%。相同生產(chǎn)因素的蒸餾酒被聚集在一起，證明實驗重復(fù)性較好。另外，酒樣A、B、D在PC1上進行了聚集，酒樣C、D、E、F在PC2上進行了聚集，證明產(chǎn)區(qū)對哈密瓜蒸餾酒影響最大，在這兩個主要成分上首先被區(qū)分。在地區(qū)差異性上，哈密大南湖與伊吾淖毛湖差異較大，瓜州南岔鎮(zhèn)產(chǎn)地介于兩者之間。相同產(chǎn)地下，品種、酵母的種類及氮源的添加對酒樣成分的影響也有顯著差異（P＜0.05）。在品種的差異上，西州蜜與金花蜜之間差異較大，銀蒂介于兩者之間。

3 結(jié)論

本研究從工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模水平上探究了哈密瓜品種、產(chǎn)區(qū)、酵母品種以及外加氮源4個生產(chǎn)因素對哈密瓜蒸餾酒的揮發(fā)性物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，共檢出76種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酯類23種、醇類12種、萜烯類8種、醛酮類5種、酸類4種、苯環(huán)類15種、呋喃類4種、含硫化合物3種、其他類化合物2種。各生產(chǎn)因素對揮發(fā)性物質(zhì)的種類及含量均有顯著影響（P＜0.05）。其中產(chǎn)區(qū)影響最為顯著（P＜0.05），品種、酵母、氮源也對揮發(fā)性物質(zhì)有一定影響。為保持蒸餾酒產(chǎn)品的一致性，應(yīng)注重不同產(chǎn)區(qū)、品種及不同生產(chǎn)輔料的蒸餾酒的相互勾兌工作。另外，生產(chǎn)因素對蒸餾酒最終品質(zhì)的影響，還應(yīng)結(jié)合揮發(fā)性物質(zhì)閾值和酒樣的感官評價做進一步分析研究。