徐亞軍，趙龍飛 *，符 可，望子龍，秦丁梅，王子秋，許明晨，袁菲菲

（1.商丘師范學院 生物與食品學院 河南省特色微生物資源開發(fā)與應用工程研究中心，河南 商丘 476000；2.江南大學 生物工程學院 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122）

傷力草，又名生力草，是河南東部常見的一類多年生草本植物，根生，莖光滑，葉片兩面無毛，邊緣鋸齒，對生，葉柄長4～8 cm。花紫色或白色，總狀花序，全株有香味。主要生長在河南東部，安徽亳州等地也有生長。河南東部及附近地區(qū)百姓常在端午節(jié)時用其治療身體虛虧、過度勞累，國內外文獻中關于此植物的報道相對較少，其藥理作用和藥用價值也鮮有報道。王利等[1]研究傷力草水煎劑對小白鼠免疫機能的影響的實驗表明，傷力草水提液可提高小鼠脾臟和胸腺指數，有效提高小鼠的非特異性免疫功能。王利等[2]研究傷力草水煎液對肉仔雞部分血清生化指標的影響發(fā)現(xiàn)，傷力草水煎液可有效降低血清總膽固醇、三酰甘油、血清葡萄糖、低密度脂蛋白的含量，顯著提高血清高密度脂蛋白的含量。秦彩玲等[3]研究傷力草對動物免疫性能等方面影響，試驗結果表明，添加適量的傷力草提取物可以提高產蛋雞后期的產蛋性能、蛋品質和免疫功能，飼料里添加300 mg/kg傷力草提取物效果較好。

生物抑菌劑是天然生物中提取能抑制微生物生長的一類活性成分，一般來自動、植物提取物或微生物菌絲的物質，能有效抗菌防腐，與化學抑菌劑相比，生物抑菌劑更安全、更穩(wěn)定。楊慧軒等[4]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌憑借其天然的來源、提供可持續(xù)的保護作用，成為傳統(tǒng)抑菌劑良好的替代品。隨著國內外學者對天然植物研究的不斷深入，其化學組成、活性成分、生理功能、結構與功能關系逐漸被發(fā)現(xiàn)并廣泛應用于功能性食品和醫(yī)藥領域[5]。天然植物資源中主要化學成分有揮發(fā)油、多糖、酚類、生物堿、苷類、有機酸等，大量研究[6]表明，這些化學成分大多具有抑菌、增強免疫力、抗氧化等生理活性。張?zhí)砭盏萚7]研究表明，植物中抑菌活性物質在植物各組織（如種子、花、葉、莖、根、果等）均存在，可直接或提取后用于制備能夠殺死或抑制病原生物的植物源抗菌消毒制劑，防治植物病害。植物源抗菌消毒劑的活性成分可有效降低環(huán)境污染[8-9]。因此，利用植物資源開發(fā)植物性抗菌物質成為現(xiàn)代農藥研究的重要方向[10]。

大腸桿菌（Escherichia coli）在自然環(huán)境中普遍存在，但致病性大腸桿菌會使人類及動物染病[11]。大腸桿菌O157還會造成土壤和水資源污染，作為土壤中最為常見的致病菌，大腸桿菌O157主要通過糞肥進入土壤，且研究發(fā)現(xiàn)，土壤中的致病性大腸桿菌O157還會向地下轉移，大腸桿菌便會通過土壤上種植的作物進入人類食物鏈，引發(fā)大規(guī)模的食物和水源污染[12]。因此，使用經過綠色處理的糞肥和保護灌溉水源對生態(tài)環(huán)境保護至關重要。為此，研究傷力草提取液對大腸桿菌的抑制作用，對有效控制大腸桿菌超標造成的食品污染及環(huán)境污染，研發(fā)污染食品的病原菌抑制劑或防腐劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）：由國家自然科學基金（U1204301）課題組提供；傷力草：采自商丘市梁園區(qū)傷力草種植基地（E115°28′0.69″，N34°29′16.83″，海拔：42 m）。

LB液體培養(yǎng)基、牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基：按參考文獻[7]配制，所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

RE-52B旋轉蒸發(fā)儀：上海書培實驗設備有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器：南北儀器有限公司；ZHPW-250臥式恒溫振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；HH-2數顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；MEDIFRIGER BL-S臺式高速冷凍離心機：西班牙MEDIFRIGER公司；V-5800PC分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取傷力草全株，將根、莖、葉、花各組織分離，清洗表面灰塵及泥垢后陰干，置于60 ℃烘箱中烘至恒質量，破碎機粉碎，備用。

1.3.2 傷力草浸提液的制備

稱取傷力草粉末，在不同處理下提取液過濾，保留上層清液，將上清液置于離心機4 ℃、4 000 r/min離心15 min，保留上層清液，置于旋轉蒸發(fā)儀65 ℃濃縮至一定濃度后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 菌株活化及菌懸液的制備

大腸桿菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑一環(huán)大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，充分振蕩，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，離心棄上清，在無菌操作臺上用蒸餾水將沉淀稀釋至OD600nm≈0.1，置于4 ℃冰箱中短期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 抑菌實驗方法

濾紙片藥液浸泡法[13]：將直徑準=0.6 cm的濾紙片121 ℃高壓滅菌后冷卻，浸泡在浸提液20 min，瀝去濾紙片上殘留浸提液，平貼在含菌培養(yǎng)基平板表面。每個培養(yǎng)皿有3～5片，培養(yǎng)基中央浸泡無菌水的空白對照。37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈現(xiàn)象，并測量抑菌圈直徑（cm），記錄結果并拍照。

1.3.5 抑菌活性測定

抑菌活性分別用抑菌圈直徑和抑菌率表示，抑菌圈直徑由十字交叉法[14]測定，取數據平均值，抑菌率按照如下公式計算[15]：

1.3.6 單因素試驗

（1）浸提液質量濃度對抑菌效果的影響[16]：精確稱取干燥傷力草莖組織粉末6份，凈質量分別為5 g、10 g、15 g、20 g、25 g、30 g，分別使用體積為50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL、300 mL蒸餾水浸泡，于25 ℃恒溫水浴鍋中浸提24 h，試驗中直接濃縮至1.0 g/mL、2.0 g/mL、3.0 g/mL、4.0 g/mL、5.0 g/mL、6.0 g/mL。

（2）浸提溫度對抑菌效果的影響[17]：精確稱取干燥傷力草莖組織粉末6份，分別用200 mL蒸餾水浸泡，溫度分別為25 ℃、37 ℃、50 ℃、65 ℃、80 ℃、95 ℃的水浴鍋中加熱24 h，將提取液過濾，保留上層清液，將上層清液置于離心機中4 ℃、4 000 r/min離心15 min，保留上層清液，置于旋轉蒸發(fā)儀65 ℃濃縮至一定濃度后，置于4 ℃冰箱冷藏室中保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）浸提時間對抑菌效果的影響：精確稱取干燥傷力草莖組織粉末6份，分別用200 mL蒸餾水浸泡，于25 ℃恒溫水浴鍋中分別浸提6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h，將提取液過濾，保留上層清液，將上層清液置于離心機中4 ℃、4 000 r/min離心15 min，保留上層清液，置于旋轉蒸發(fā)儀65 ℃濃縮至一定濃度后，置于4 ℃冰箱冷藏室中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 響應面分析

以單因素試驗為基礎，選擇蒸餾水為浸提溶劑，選擇浸提液質量濃度（A）、浸提溫度（B）和浸提時間（C）3個因素，每個因素3個水平，響應面法[18-20]優(yōu)化傷力草莖水提液提取條件，響應面試驗因素與水平如表1所示。

表1 傷力草莖部水提液抑菌成分提取工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extract process optimization of antibacterial components of water extract form Shangli grass stem

1.3.8 數據處理

試驗數據用Excel 2016、SPSS 26.0、Design Expert 10.0.7軟件進行統(tǒng)計分析，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同組織水浸提液對大腸桿菌抑制效果

由圖1可知，以無菌水浸泡的濾紙片為對照，經初篩發(fā)現(xiàn)只有傷力草莖部的浸提液對大腸桿菌具有一定抑制作用。復篩發(fā)現(xiàn)傷力草莖部水提液濾紙片四周出現(xiàn)明顯的抑菌圈，進一步研究傷力草莖部水提液對大腸桿菌的抑制作用。

圖1 不同組織水浸提液對大腸桿菌抑制效果的影響Fig. 1 Effect of different tissue extracts on bacteriostasis of Escherichia coli

2.2 不同條件對傷力草莖部浸提液抑菌效果的影響

2.2.1 不同浸提液質量濃度對傷力草莖部浸提液抑菌率的影響

傷力草莖部的不同浸提液質量濃度對大腸桿菌的抑制作用影響見圖2。由圖2可知，抑菌率隨浸提液質量濃度的增大呈現(xiàn)上升的趨勢。當浸提液質量濃度為1.0 g/mL時，傷力草莖部提取液的抑菌率最小，當浸提液質量濃度為5.0 g/mL時，對大腸桿菌的抑制作用最明顯。根據試驗結果，選擇浸提液質量濃度為4.0 g/mL、5.0 g/mL、6.0 g/mL作為響應面試驗水平。

圖2 不同質量濃度對傷力草莖部浸提液抑菌率的影響Fig. 2 Effect of different extracts mass concentration from Shangli grass stem on bacteriostasis

2.2.2 不同浸提溫度對傷力草莖部浸提液抑菌率的影響

不同浸提溫度對傷力草莖部浸提液抑菌效果的影響見圖3。由圖3可知，抑菌率隨浸提溫度升高呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，浸提溫度為37 ℃時，傷力草莖提取液抑菌率達到最大值；繼續(xù)升高浸提溫度到50 ℃時，傷力草莖提取液抑菌率開始下降；浸提溫度達到80 ℃以上時，則沒有抑制作用。根據試驗結果，選擇浸提溫度為25 ℃、37 ℃、50 ℃作為響應面試驗水平。

圖3 不同浸提溫度對傷力草莖部浸提液抑菌率的影響Fig. 3 Effect of different temperature of extracts from Shangli grass stem on bacteriostasis

2.2.3 不同浸提時間對傷力草莖部浸提液抑菌率的影響

不同浸提時間的浸提液對傷力莖部的影響見圖4。由圖4可知，只有浸提時間超過18 h浸提液才有一定的抑菌現(xiàn)象出現(xiàn)，浸提時間為24 h時，傷力草莖部提取液抑菌率達到峰值，繼續(xù)浸提到30 h時，抑菌率相對于24 h降低了19.8%，可能是浸提時間延長，破壞了抑菌活性物質；但繼續(xù)延長浸提時間到36 h，抑菌率又出現(xiàn)了上升，這可能是隨時間的延長，又浸提出了其他的具有抑菌作用的成分。根據試驗結果，選擇浸提時間為18 h、24 h、30 h作為響應面試驗水平。

圖4 不同浸提時間對傷力草莖部浸提液抑菌率的影響Fig. 4 Effect of different extraction time of extracts from Shangli grass stem on bacteriostasis

2.3 響應面法優(yōu)化傷力草莖水浸提液提取條件

2.3.1 響應面試驗結果

在單因素試驗結果基礎上，以傷力草莖部水浸提液的抑菌率為響應值，以浸提液質量濃度（A）、浸提溫度（B）、浸提時間（C）為自變量，利用響應面法進一步優(yōu)化傷力草莖部水浸提液的提取工藝[21]，所得的試驗方案及結果見表2。

表2 傷力草莖部水浸提液抑菌成分提取工藝優(yōu)化響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments for extract process optimization of antibacterial components of water extracts from Shangli grass stem

利用Design-Expert 10.0.7軟件將表2數據進行多元回歸擬合，得出傷力草莖部浸提液對大腸桿菌抑制作用的二次多項回歸方程：Y=87.392+0.175A+0.126B+1.152C-0.022AB+0.125AC-0.007BC-0.911A2-2.078B2-5.273C2。

2.3.2 方差分析

對模型進行方差分析[22]，結果如表3所示。結果表明，該模型P＜0.000 1，表示該模型極顯著（P＜0.01）。失擬項=0.175 9＞0.05，模型失擬項不顯著（P＞0.05）[23]，說明所得方程回歸模型擬合真實水平，所選模型合適，可以使用該回歸方程代替試驗真實點分析試驗結果[24]，本次試驗的試驗數據有意義。相關系數R2=97.44%，說明有97.44%的數據都可用該方程進行解釋，具有較高的相關性，模型試驗誤差合理[25]。校正相關系數R2Adj=94.15%，該模型適應響應值變化94.15%。變異系數（coefficient of variation，CV）值[26]為0.92%，說明提取優(yōu)化方法的結果準確可靠。由P值可知，模型的一次項中浸提時間對抑菌率影響高度顯著（P＜0.01），交互項對抑菌率影響均不顯著（P＞0.05），二次項中浸提液質量濃度對抑菌率影響顯著（0.01＜P＜0.05），浸提溫度和浸提時間對抑菌率影響極顯著（P＜0.001）。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of regression equations for response surface experiments results

根據回歸模型做出各因素交互作用對結果影響的響應曲面及等高線，結果見圖5。

圖5 浸提液質量濃度、浸提溫度、浸提時間交互作用對傷力草莖部提取液抑菌率影響的響應曲面及等高線圖Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between extract concentration,extract temperature and extract time on inhibition rate of water extracts from Shangli grass

響應面圖坡度越陡表示響應值受該因素的影響越大[27]。由圖5a可知，傷力草莖水提取液抑菌率隨著浸提液質量濃度和浸提溫度增加，均呈先上升后下降趨勢，但是浸提液質量濃度的曲面坡度較緩慢于浸提溫度的曲面坡度。由圖5b可知，隨著浸提液質量濃度的提高，傷力草莖部提取液抑菌率表現(xiàn)出先上升后下降趨勢，但趨勢較緩慢。而傷力草莖部水提取液抑菌率隨浸提時間增加呈現(xiàn)明顯先上升后下降趨勢?？芍?，浸提時間對傷力草莖部水提液抑菌率的影響大于浸提液質量濃度對抑菌率的影響。由圖5c可知，浸提時間的曲面坡度明顯比浸提溫度的曲面坡度陡峭，則浸提時間對傷力草莖部水提液抑菌率的影響大于浸提溫度對其抑菌率的影響。綜上所述，影響傷力草莖部水提取液抑菌率的因素順序為浸提時間＞浸提溫度＞浸提液質量濃度。

2.3.3 響應面優(yōu)化結果驗證

根據響應面擬合方程與模型預測可得出傷力草莖部水提取液抑菌率最高時的最佳提取工藝為：浸提液質量濃度5.104 g/mL，浸提溫度37.876 ℃，浸提時間為24.663 h，預測抑菌率為87.467%，根據實際條件將最佳提取條件優(yōu)化為浸提液質量濃度5.0 g/mL，浸提溫度37 ℃，浸提時間為24 h，重復試驗3次得到力草莖部水提取液抑菌率實際值為87.89%，模型預測值與實際測定結果相對誤差為0.42%，說明響應面模型最終優(yōu)化結果可靠。

3 結論

本試驗采用傷力草葉部、莖部、根部的水提液抑制大腸桿菌，結果表明，葉部和根部的水提物不能抑制大腸桿菌的生長，只有莖部水提液對大腸桿菌抑制效果明顯。本試驗得出的傷力草莖部水提液對大腸桿菌抑制效果最佳的提取工藝為37 ℃水浴24 h，濃縮浸提液質量濃度為5.0 g/mL。此優(yōu)化條件下，抑菌率是87.89%。