何思蓮，施燦璨，李 瓊，陳麗娜，唐金銘，黃潔梅，陳 淵*

（玉林師范學(xué)院 化學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院 廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 玉林 537000）

果酒是一種以新鮮水果為原料，經(jīng)過打漿取汁、調(diào)節(jié)糖度、酸度等工藝，采用酵母菌為菌種發(fā)酵，制備的一種具有低酒精度、一定果香味及豐富營養(yǎng)物質(zhì)的酒品[1]。將新鮮水果制成的果酒，富含人體所需的有機(jī)酸、酯類等成分，不僅保留了原有的營養(yǎng)物質(zhì)，而且還能讓水果中的營養(yǎng)物質(zhì)更好地被人體吸收，果酒中豐富的多酚類物質(zhì)可以強(qiáng)化人體血管壁、促進(jìn)腸胃消化。同時(shí)果酒中的酒精含量比白酒等要低，能調(diào)節(jié)人體新陳代謝、改善心腦血管功能，控制體內(nèi)膽固醇平衡等功能[2]。

龍眼（Dimocarpus longanLour.），別名桂圓，是華南地區(qū)種植和加工的大宗水果之一，產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的60%～70%。其果肉為白色，含糖量可達(dá)18%以上，富含人體所需的膳食纖維、各類維生素（如維生素B1、維生素C等）、多糖等物質(zhì)，同時(shí)具有清除自由基[3]、降低血糖[4]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[5]、抗癌及促進(jìn)智力發(fā)育等功效[6]，營養(yǎng)成分極高，味道香甜爽口，深受廣大民眾的喜愛。目前龍眼主要以鮮果銷售，但龍眼產(chǎn)量大且采摘期集中，造成供大于求的市場局面。雖然有少部分龍眼被加工成龍眼干、龍眼膏、龍眼罐頭等產(chǎn)品并銷售，仍有部分龍眼無法得到合理利用，給果農(nóng)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。若將龍眼加工成既有保健功效又能將龍眼果香最大限度保留的龍眼果酒，不但可以因減少龍眼產(chǎn)量大造成的銷售壓力，更能避免“果賤傷農(nóng)”現(xiàn)象的出現(xiàn)，而且還能大幅度提高龍眼的附加值、完善龍眼產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、進(jìn)而推動(dòng)龍眼產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前有關(guān)龍眼果酒的加工工藝及抗氧化活性有一些研究報(bào)道。劉冬梅等[7-8]選取不同的發(fā)酵菌株進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化龍眼果酒的加工工藝，獲得最佳制備工藝條件。羅汝鋒等[9-10]等選取酒精度、總酚轉(zhuǎn)化量等為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化釀造工藝，確定釀造工藝條件。羅汝鋒等[9]在優(yōu)化釀造工藝的基礎(chǔ)上測定了果酒的總酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除能力，評定了果酒的抗氧化性。邱松山等[11]采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定了龍眼果酒的香氣成分及相對含量。這些研究為龍眼果酒的生產(chǎn)、品質(zhì)評價(jià)、保健機(jī)制等方面提供了科學(xué)依據(jù)，但與浸泡龍眼果酒的對比研究較少，且未能形成產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)以龍眼為原材料，通過接種酵母發(fā)酵制備龍眼果酒，以酒精度、感官評價(jià)為評價(jià)指標(biāo)，分別探討酵母接種量、初始糖度、初始pH、發(fā)酵溫度等因素對龍眼果酒的品質(zhì)影響，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，并對龍眼果酒的感官、理化指標(biāo)、抗氧化性成分、香氣成分等指標(biāo)進(jìn)行分析檢測，以期為龍眼果酒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼（石硤龍眼）：產(chǎn)地廣西北流；安琪葡萄酒用高活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；食用酒精：鄭州鑫河陽酒精有限公司；維生素C：河南圣斯德實(shí)業(yè)有限公司；香草醛、偏磷酸：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；沒食子酸、殼聚糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；白砂糖：太古糖業(yè)有限公司；無水檸檬酸：山東濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；碳酸鈉：南京甘汁園糖業(yè)有限公司；DPPH：上海源葉生物科技有限公司；水楊酸、酒石酸鉀鈉：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；鄰苯三酚：河北陌槿生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、鄰苯二甲酸氫鉀：成都市科龍化工試劑廠；磷酸氫二鈉：成都金裕生物科技有限公司；無水硫酸鈉：西隴科學(xué)股份有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ATY224EXP型電子分析天平：日本SHIMADZU公司；STARTER 2100/3C Pro-FpH計(jì)：寧波衡欣科技股份有限公司；JYL-C19V型打漿機(jī)：九陽股份有限公司；LH-32型手持糖度計(jì)：杭州陸恒生物科技有限公司；DA-130N手持酒精計(jì)：內(nèi)蒙古曼德拉生物科技有限公司；Cary5000紫外光譜儀、7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）：安捷倫科技（中國）有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-500DE超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；WYA-2S自動(dòng)阿貝折光儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；ZNCL-5D型多點(diǎn)磁力攪拌器：河南愛博特科技發(fā)展有限公司；722sp型可見分光光度計(jì)：上海光學(xué)儀器五廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵型龍眼果酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)[12]

新鮮龍眼→清洗、剝殼→打漿取汁→過濾→調(diào)整糖度、pH→添加酵母→發(fā)酵→過濾→陳釀→過濾→裝瓶→成品

操作要點(diǎn)：龍眼果實(shí)用自來水沖洗干凈；用榨汁機(jī)將龍眼肉打碎取汁，并用200目濾網(wǎng)過濾果汁，調(diào)整果汁糖度、pH；向果汁中接種0.25 g/L已活化（5 g干酵母加入100 mL 38 ℃龍眼果汁中，攪拌溶解，保溫20 min后冷卻至室溫25 ℃）的安琪葡萄酒用高活性干酵母；發(fā)酵期用煮沸的蒸餾水液封發(fā)酵罐口，設(shè)置發(fā)酵溫度，發(fā)酵時(shí)間為7 d；發(fā)酵完成時(shí)（發(fā)酵液中糖度和酒精度基本保持不變），通過500目的濾網(wǎng)過濾得到龍眼果酒原酒，將原酒轉(zhuǎn)移到特制的瓶子中，并將龍眼果原酒進(jìn)行陳釀（5 ℃、30 d），陳釀結(jié)束后用兩層500目的濾網(wǎng)過濾、沉淀，得到發(fā)酵型龍眼果酒成品。

1.3.2 浸泡型龍眼果酒工藝流程及操作要點(diǎn)[13]

新鮮龍眼→挑選、除雜→清洗→剝殼去核→浸泡→過濾→成品

操作要點(diǎn)：將龍眼洗凈、剝殼、去核后，把龍眼果肉加入酒基中進(jìn)行浸泡，浸泡龍眼酒選用乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的食用酒精。將食用酒精用純凈水稀釋至35%左右，把龍眼和食用酒精（乙醇體積分?jǐn)?shù)35%）按照料液比1∶5（g∶mL）混合，放進(jìn)干凈的容器，用保鮮膜封緊蓋上蓋，把容器放入陰涼處避光（25 ℃）密封保存7 d，得到浸泡型龍眼果酒成品。

1.3.3 龍眼果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

分別考察初始糖度（20%、22%、24%、26%、28%）、初始pH值（5.0、5.8、6.6、7.4、8.0）、酵母接種量（0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.27 g/L、0.30 g/L）、發(fā)酵溫度（21 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、30 ℃）等因素對龍眼果酒發(fā)酵酒精度和感官評價(jià)的影響。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酒精度和感官評價(jià)為評價(jià)指標(biāo)，以初始糖度（A）、酵母接種量（B）、初始pH值（C）、發(fā)酵溫度（D）等4個(gè)因素，安排L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化發(fā)酵型龍眼果酒發(fā)酵工藝條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.4 分析檢測

酒精度、總糖、總酸含量測定：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；維生素C含量測定：紫外分光光度法[14]；多酚含量測定：紫外可見分光光度法[15]；超氧陰離子自由基、羥基自由基及DPPH自由基清除率測定：參照蘇龍等[16]的方法。

1.3.5 香氣成分測定方法

龍眼果酒香氣成分測定參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。

風(fēng)味物質(zhì)提?。喝?0 mL龍眼果酒于100 mL具塞錐形瓶中，加40 mL二氯甲烷混勻，加蓋密封。用磁力攪拌器以500 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌1 h，25 ℃條件下超聲15 min，用梨形分液漏斗分離有機(jī)層和水層，并收集有機(jī)相。稱量5 g無水Na2SO4加入有機(jī)相干燥、抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液至2 mL，樣品于4 ℃冷藏供GC-MS上機(jī)分析。樣品平行處理3次，做重復(fù)性試驗(yàn)。

GC條件：DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 μm×0.25 mm），進(jìn)樣口溫度為240 ℃，載氣為高純氦氣（He），流速為1.83 mL/min，檢測器溫度為35 ℃。柱溫采用程序升溫方式：35 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至115 ℃，保持3 min，然后以5℃/min升至235℃，保持10min。不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1.0μL。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度為200 ℃；電子能量為70 eV；接口溫度為250 ℃；掃描范圍為45～450m/z。

定性定量方法：用美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）02.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫自帶的譜庫檢索，確定其化學(xué)式，再通過資料分析、結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，確認(rèn)各種香氣成分。采用面積歸一法對各風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

1.3.6 感官評價(jià)

感官評價(jià)法[18]結(jié)合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，由數(shù)位具有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的老師和學(xué)生組成品酒小組，對龍眼果酒的香氣、滋味、外觀、典型性進(jìn)行綜合評價(jià)，滿分100分，取平均分作為最終評分結(jié)果。龍眼果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 龍眼果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of longan fruit wine

續(xù)表

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每組做3個(gè)平行樣品檢測結(jié)果，試驗(yàn)中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（顯著性檢驗(yàn)為t檢驗(yàn)）采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始糖度對龍眼果酒品質(zhì)的影響

初始糖度對龍眼果酒品質(zhì)的影響見圖1。由圖1可知，隨著初始糖度在20%～24%范圍內(nèi)的增加，龍眼果酒中感官評分、酒精度隨之升高；當(dāng)初始糖度為24%時(shí)，龍眼果酒的感官評分最高為86分，酒精度為11.9%vol；糖是酵母的主要碳源和能源，適宜的糖度會(huì)使酵母菌產(chǎn)出更多的酒精，當(dāng)初始糖度＞24%之后，龍眼果酒的酒精度繼續(xù)升高，但感官評分有所下降，龍眼果酒中的龍眼的清香風(fēng)味不明顯，果酒滋味偏酸。當(dāng)糖度過高時(shí)，發(fā)酵液滲透壓升高抑制酵母菌的生理活動(dòng)，成品酒的殘?zhí)瞧?，影響果酒的品質(zhì)[19]。綜合考慮，發(fā)酵龍眼果酒的最佳初始糖度為24%。

圖1 初始糖度對龍眼果酒品質(zhì)的影響Fig. 1 Effect of initial sugar contents on the quality of longan fruit wine

2.1.2 初始pH值對龍眼果酒品質(zhì)的影響

初始pH值對龍眼果酒品質(zhì)的影響見圖2。由圖2可知，隨著初始pH值在5.0～6.6范圍內(nèi)的增加，龍眼果酒中感官評分、酒精度隨之升高；當(dāng)初始pH值為6.6時(shí)，果酒顏色為金黃色、果酒滋味濃郁，龍眼特征風(fēng)味明顯，感官評分最高，為86分，酒精度為11.7%vol；當(dāng)初始pH值＞6.6之后，果酒酒精度繼續(xù)升高，但升高幅度放緩，說明所試驗(yàn)的初始pH值范圍有利于酵母的生長繁殖，但pH值太高會(huì)導(dǎo)致雜菌的生長繁殖，使酒體渾濁、果酒中龍眼特征風(fēng)味不明顯，感官評分有所降低。初始pH過高時(shí)，會(huì)影響酵母菌的發(fā)酵，且果酒中的酯類物質(zhì)產(chǎn)生水解，降低果酒的品質(zhì)[20]。綜合考慮，發(fā)酵龍眼果酒的最佳初始pH值為6.6。

圖2 初始pH值對龍眼果酒品質(zhì)的影響Fig. 2 Effect of initial pH value on the quality of longan fruit wine

2.1.3 酵母接種量對龍眼果酒品質(zhì)的影響

酵母用量對龍眼果酒品質(zhì)的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)酵母接種量為0.15～0.25 g/L時(shí)，龍眼果酒中感官評分、酒精度隨之升高；當(dāng)酵母接種量為0.25 g/L時(shí)，龍眼果酒感官評分、酒精度最高，分別為86分和11.4%vol。果酒滋味柔和爽口、醇厚協(xié)調(diào)；當(dāng)酵母接種量＞0.25 g/L之后，酵母接種量過高，酵母菌數(shù)量過多，生理活動(dòng)旺盛，導(dǎo)致果酒較渾濁，酵母味濃，口感偏酸[21]，果酒感官評分低。因此，發(fā)酵龍眼果酒的最佳接種量為0.25 g/L。

圖3 酵母接種量對龍眼果酒品質(zhì)的影響Fig. 3 Effect of inoculum on the quality of longan fruit wine

2.1.4 發(fā)酵溫度對龍眼果酒品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對龍眼果酒品質(zhì)的影響見圖4。由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為21～25 ℃時(shí)，龍眼果酒中感官評分、酒精度隨之升高；當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，感官評分最高，為86分，酒精度為11.8%vol；當(dāng)發(fā)酵溫度高于25 ℃之后，龍眼果酒的酒精度繼續(xù)升高，說明21～25 ℃為酵母繁殖和發(fā)酵的適宜溫度范圍，酵母活力高，發(fā)酵徹底。發(fā)酵溫度過高，發(fā)酵速度會(huì)很快，但酵母菌衰老的也快，發(fā)酵停止的時(shí)間會(huì)提前，酒精度也達(dá)不到預(yù)期要求。發(fā)酵溫度過低，酵母活性降低，發(fā)酵周期變長，影響果酒的口感[22]。因此，發(fā)酵龍眼果酒的最佳溫度為25 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對龍眼果酒品質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperature on the quality of longan fruit wine

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酒精度和感官評價(jià)為評價(jià)指標(biāo)，以初始糖度（A）、酵母接種量（B）、初始pH值（C）、發(fā)酵溫度（D）為影響因素，按照L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，龍眼果酒發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

由表3可知，對果酒品質(zhì)影響的4個(gè)因素的強(qiáng)弱順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即初始糖度＞酵母接種量＞初始pH值＞發(fā)酵溫度。以酒精度為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)酵工藝最佳組合為A3B2C2D1；以感官評分為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)酵工藝最佳組合為A2B2C2D1。兩個(gè)最佳組合中3個(gè)因素相同，由極差討論出，通過初始糖度對酒精度的影響（Rj=4.27）與對感官評價(jià)的影響（Rj=11.67）對比，可得出對感官評價(jià)影響最大的因素是初始糖度，選擇該因素的水平為A2。故龍眼果酒的最佳發(fā)酵工藝組合為A2B2C2D1，即初始糖度24%、酵母接種量0.25g/L、初始pH值6.6、發(fā)酵溫度23 ℃。在此最佳發(fā)酵工藝條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，龍眼果酒酒精度為11.5%vol，感官評分為89分。

2.3 龍眼果酒品質(zhì)指標(biāo)及抗氧化活性分析

有研究表明，發(fā)酵果酒的抗氧化活性成分含量高于浸泡型果酒[23]。發(fā)酵型龍眼果酒與浸泡型龍眼果酒的品質(zhì)指標(biāo)及抗氧化活性對比結(jié)果見表4。由表4可知，發(fā)酵型果酒具有低酒度、低總糖和高酸度的特點(diǎn)，而浸泡型果酒具有高酒精度、高總糖和低酸度的特點(diǎn)。果酒的酸度適中可使酒醇厚爽口，平衡苦味，但酸度過高會(huì)造成酒味酸澀、酒體粗糙[24]，發(fā)酵型龍眼果酒與浸泡型龍眼果酒兩種果酒的相互融合可以較好地平衡各自在酸度的不足。

表4 龍眼果酒品質(zhì)指標(biāo)及抗氧化活性測定結(jié)果Table 4 Determination results of quality indexes and antioxidant activity of longan fruit wine

發(fā)酵型龍眼果酒的多酚含量、維生素C含量、超氧陰離子自由基清除率、羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率均高于浸泡型龍眼果酒，抗氧化能力明顯優(yōu)于浸泡型龍眼果酒，說明發(fā)酵可使龍眼果實(shí)中的活性成分更好地溶出。果酒中的抗自由基及抗氧化成分能提高機(jī)體免疫機(jī)能，促進(jìn)機(jī)體健康[25]。

2.5 發(fā)酵型龍眼果酒與浸泡型龍眼果酒香氣成分分析

香氣成分是果酒的重要品質(zhì)指標(biāo)，如何最大程度地保留原料水果特有的香氣特征，又能具有良好的口感是果酒研發(fā)的主要目的之一。發(fā)酵型龍眼果酒與浸泡型果酒的香氣成分GC-MS分析結(jié)果見表5。

表5 兩種龍眼果酒中香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 5 Results of aroma components in two kinds of longan fruit wines analyzed by GC-MS

由表5可知，發(fā)酵型龍眼果酒中共檢出27種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類共6種，占香氣成分的56.03%；酯類有7種，占香氣成分的34.44%；有機(jī)酸類有5種，占香氣成分的4.98%；酮類有2種，占香氣成分的1.86%；醛類有3種，占香氣成分的1.43%；雜環(huán)類為2種，占香氣成分的0.57%；烯烴類有1種，占香氣成分的0.36%；醚類為二乙二醇醚，占香氣成分的0.33%。而浸泡型龍眼果酒中只有13種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類2種、酯類4種、有機(jī)酸3種、醛類1種、酚類2種、烯烴類1種，香氣成分遠(yuǎn)少于發(fā)酵型龍眼果酒。發(fā)酵果酒的發(fā)酵工藝添加了果膠酶、酵母等物質(zhì)，在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生芳香化合物[26]，使酒體風(fēng)味更豐滿。

3 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對發(fā)酵型龍眼果酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的發(fā)酵龍眼果酒最佳發(fā)酵工藝條件為：初始糖度24%、酵母0.25 g/L、初始pH值6.6、發(fā)酵溫度23 ℃。此優(yōu)化工藝下，發(fā)酵型龍眼果酒的酒精度為11.5%vol，酒體澄清，口感柔和，具有龍眼典型性風(fēng)味，感官評分為89分?？偺呛繛?.6%、多酚含量為114.515 μmg/L、維生素C含量為100.045 μg/mL、超氧陰離子自由基清除率為64.97%、DPPH自由基清除率為93.75%、羥基自由基清除率為69.17%，而浸泡型龍眼果酒酒精度、總糖和總酸含量較高，其他各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)均低于發(fā)酵型龍眼果酒。發(fā)酵型龍眼果酒共檢出27種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中醇類6種、酯類7種、酸類5種、酮類2種，醛類3種，雜環(huán)類2種，烯烴類1種，醚類1種。