王一賀，張嘉璇，王 楠，張萃異，石 侃，2，3，4，5，劉樹文，2，3，4，5*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100；3.國(guó)家林業(yè)和草原局 葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100；4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 合陽(yáng)葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 渭南 715300；5.西北農(nóng)林科技大學(xué) 寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗(yàn)站，寧夏 永寧 750104）

酒酒球菌（Oenococcus oeni）主導(dǎo)的蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）是大多數(shù)紅葡萄酒和少數(shù)白葡萄酒在酒精發(fā)酵（alcoholic fermentation，AF）后的重要工藝環(huán)節(jié)，該過程可降低葡萄酒酸度、增加香氣復(fù)雜度、改善葡萄酒酸澀口感、增強(qiáng)葡萄酒微生物穩(wěn)定性，進(jìn)而提高葡萄酒的質(zhì)量[1-2]。依靠釀酒環(huán)境中存在的乳酸菌進(jìn)行的自發(fā)MLF通常較難控制，一些情況下甚至無(wú)法正常啟動(dòng)發(fā)酵，并且一旦其他的細(xì)菌（如片球菌屬等）成為發(fā)酵過程的主導(dǎo)菌，還會(huì)給葡萄酒帶來不愉悅的香氣、過高的揮發(fā)酸和生物胺等[3-4]。因此，接種高活性、高活菌數(shù)的商業(yè)發(fā)酵劑是保障MLF順利啟動(dòng)完成的關(guān)鍵[5-7]。

隨著我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)本土優(yōu)質(zhì)葡萄酒的需求不斷提升，我國(guó)葡萄酒企業(yè)對(duì)優(yōu)質(zhì)O.oeni發(fā)酵劑的需求也越來越大[8]，然而目前我國(guó)葡萄酒企業(yè)使用的O.oeni發(fā)酵劑嚴(yán)重依賴進(jìn)口，對(duì)本土發(fā)酵劑的開發(fā)緩慢，缺乏本土優(yōu)良O.oeni發(fā)酵劑，導(dǎo)致我國(guó)葡萄酒同質(zhì)化嚴(yán)重、本土風(fēng)格不突出，開發(fā)本土優(yōu)良菌株的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵劑迫在眉睫。

目前，制作乳酸菌發(fā)酵劑的方法主要有真空干燥法、噴霧干燥法、真空冷凍干燥法，其中使用較為廣泛且有效的方法是采用真空冷凍干燥法制備乳酸菌發(fā)酵劑[9]。真空冷凍干燥發(fā)酵劑制備的關(guān)鍵前提和基礎(chǔ)就是實(shí)現(xiàn)菌體的高密度培養(yǎng)[10]?，F(xiàn)有的乳酸菌高密度培養(yǎng)方法主要有緩沖鹽法、化學(xué)中和法、補(bǔ)料培養(yǎng)法和滲析法[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，呂兵等[12]曾綜合運(yùn)用緩沖鹽法和化學(xué)中和法使培養(yǎng)液中嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)達(dá)到2.4×109CFU/mL；賀稚非等[13]運(yùn)用緩沖鹽法及補(bǔ)料培養(yǎng)法相結(jié)合的方案，使培養(yǎng)液中植物乳桿菌混菌發(fā)酵的活菌數(shù)達(dá)到7.24×109CFU/mL。影響高密度培養(yǎng)的因素有很多，如培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、pH值、接種量、補(bǔ)料方式、生長(zhǎng)抑制物的積累等[14]。對(duì)于酒酒球菌，目前有關(guān)其高密度培養(yǎng)的研究較少，紀(jì)赟等[15]采用連續(xù)流加補(bǔ)料的方法，使自動(dòng)誘導(dǎo)超級(jí)肉湯（autoinductive terrific broth，ATB）培養(yǎng)基中酒酒球菌的活菌數(shù)達(dá)到7.5×108CFU/mL。但是，少有研究對(duì)酒酒球菌不同的高密度培養(yǎng)方法進(jìn)行比較。本研究選取了實(shí)驗(yàn)室保藏的4株優(yōu)良O.oeni菌株（O.oeniES-1、O.oeni144-46、O.oeni28A-1和O.oeniSD-2a），通過研究L-蘋果酸對(duì)酒酒球菌的促進(jìn)生長(zhǎng)作用，選取最終菌密度（OD600nm值）較高且性狀較為優(yōu)良的O.oeniES-1為出發(fā)菌株進(jìn)行培養(yǎng)基條件優(yōu)化，結(jié)合不同的高密度培養(yǎng)方法，對(duì)本土優(yōu)良O.oeniES-1的高密度培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高最終O.oeni的菌體密度，為本土優(yōu)良酒酒球菌商業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

酒酒球菌（O.oeni）ES-1、144-46、28A-1、SD-2a：西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院葡萄酒微生物實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸鎂：西隴化工股份有限公司；硫酸錳：淮南市科迪化工科技有限公司；L-鹽酸半胱氨酸、瓊脂粉：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水碳酸鈉、丙三醇：四川西隴科學(xué)有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：北京博奧拓達(dá)科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

ATB培養(yǎng)基：參照參考文獻(xiàn)[16]制備。

1.2 儀器與設(shè)備

SS325型高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY公司；DGG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5417R1型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Cary 60 UV-Vis型分光光度計(jì)：美國(guó)安捷倫公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒酒球菌的活化

取-80 ℃保藏的菌株接入ATB培養(yǎng)基，26 ℃培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)接2次。

1.3.2 菌密度的考察方法

本研究通過細(xì)菌活菌數(shù)和OD600nm值為兩個(gè)考察指標(biāo)衡量菌密度。采用稀釋涂布平板法計(jì)算活菌數(shù)，采用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值，以空白培養(yǎng)基調(diào)零，以測(cè)得的OD600nm值衡量菌株的生長(zhǎng)情況。

1.3.3L-蘋果酸對(duì)酒酒球菌生長(zhǎng)的影響

在ATB培養(yǎng)基中分別添加0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L的L-蘋果酸，以不添加L-蘋果酸的ATB培養(yǎng)基為對(duì)照組，將ATB培養(yǎng)基的pH調(diào)至4.8，并以4%的接種量，分別接種O.oeni28A-1、O.oeni144-46、O.oeniES-1和O.oeniSD-2a，每隔4 h測(cè)其OD600nm值并繪制生長(zhǎng)曲線，探究L-蘋果酸對(duì)酒酒球菌生長(zhǎng)的影響。

1.3.4 酒酒球菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

以O(shè).oeniES-1為出發(fā)菌株，ATB培養(yǎng)基pH調(diào)至5.1，按3%接種量將同一試管中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的母液接種至L-蘋果酸添加量為1 g/L的培養(yǎng)基中，每隔4 h測(cè)其OD600nm值。分別考察L-蘋果酸添加量（0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5 g/L）、初始pH值（4.4、4.8、5.1、5.4、5.8）和接種量（1%、3%、5%、7%）對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以初始pH（A）、接種量（B）和L-蘋果酸添加量（C）為3個(gè)因素設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，分別以到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)的OD600nm值和活菌數(shù)為考察指標(biāo)，確定3個(gè)因素的最優(yōu)組合。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 酒酒球菌培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for culture conditions optimization of Oenococcus oeni

1.3.5 不同高密度培養(yǎng)方法的比較

首先進(jìn)行連續(xù)補(bǔ)料法條件的優(yōu)化，即培養(yǎng)基的初始pH調(diào)至5.1，添加L-蘋果酸1 g/L，接種量為3%。分別在穩(wěn)定期前期向發(fā)酵液中補(bǔ)充不同量（10 g/L、13.3 g/L、16.7 g/L、20 g/L）的葡萄糖溶液，并且在培養(yǎng)過程中間斷添加20%Na2CO3溶液以中和細(xì)菌代謝所產(chǎn)生的酸，控制pH在5.1，減少培養(yǎng)過程中pH值降低對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用。測(cè)定其達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的OD600nm值。

然后進(jìn)行半連續(xù)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，即把培養(yǎng)基的初始pH調(diào)至5.1，添加L-蘋果酸1 g/L，接種量為3%。將細(xì)菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期前期在不同離心力（429×g、966×g、1 718×g、2 685×g、3 866×g）和離心時(shí)間（10 min、20 min）條件下進(jìn)行離心收集菌體，以探究最適離心條件，之后向離心收獲菌體中添加等量新鮮培養(yǎng)基，并且在培養(yǎng)過程中間斷添加20%Na2CO3溶液以中和細(xì)菌代謝所產(chǎn)生的酸，使其pH控制在5.1，然后測(cè)細(xì)菌達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的OD600nm值。

分別考察化學(xué)中和法與連續(xù)補(bǔ)料法、半連續(xù)培養(yǎng)法相結(jié)合的方案。在上述優(yōu)化培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，方案一為間歇式添加堿液[18]與連續(xù)補(bǔ)料法[19]相結(jié)合，即培養(yǎng)基的初始pH調(diào)至5.1，添加L-蘋果酸1 g/L，接種量為3%，碳源（葡萄糖）固定在10 g/L，通過改變氮源（蛋白胨）的添加量來改變補(bǔ)料液的碳氮比，比較不同碳氮比（1∶0、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1）的補(bǔ)料液對(duì)最終菌密度影響，并在培養(yǎng)過程中間斷添加20% Na2CO3溶液控制pH在5.1，測(cè)定其達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的OD600nm值和活菌數(shù)。方案二為間歇式添加堿液與半連續(xù)培養(yǎng)法[20]相結(jié)合，即培養(yǎng)基的初始pH調(diào)至5.1，添加L-蘋果酸1 g/L，接種量為3%，在所得最適離心條件（離心力1 718×g，離心時(shí)間10 min）下收集菌體，之后向離心收獲的菌體中添加等量新鮮培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)過程中間斷添加20%Na2CO3溶液控制pH在5.1，測(cè)定其達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的OD600nm值和活菌數(shù)。

1.3.6 測(cè)定方法

培養(yǎng)液中殘?zhí)呛康臏y(cè)定：為了探究培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)匱乏的具體時(shí)期，獲得開始補(bǔ)料的時(shí)間點(diǎn)，采用DNS法[17]，對(duì)培養(yǎng)液中的殘?zhí)敲扛? h進(jìn)行測(cè)定。

本研究對(duì)半連續(xù)培養(yǎng)法的離心條件進(jìn)行優(yōu)化，以離心收得率為衡量指標(biāo)，離心收得率計(jì)算公式[18-21]如下：

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel 2010進(jìn)行初步分析，GraphPad Prism進(jìn)行差異顯著性分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-蘋果酸對(duì)酒酒球菌生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，添加一定量的L-蘋果酸可以顯著促進(jìn)酒酒球菌的生長(zhǎng)。添加0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L的L-蘋果酸可使O.oeni28A-1在穩(wěn)定期達(dá)到較高的OD值；與不添加蘋果酸的對(duì)照組相比，添加L-蘋果酸的試驗(yàn)組O.oeni遲滯期較短，且均在16 h左右到達(dá)對(duì)數(shù)期，而對(duì)照組在24 h左右到達(dá)對(duì)數(shù)期。試驗(yàn)組與對(duì)照組均在生長(zhǎng)72 h左右到達(dá)穩(wěn)定期。添加0.5 g/L的L-蘋果酸對(duì)O.oeni28A-1生長(zhǎng)促進(jìn)作用最好，O.oeni28A-1在穩(wěn)定期獲得最高的OD值。L-蘋果酸對(duì)于其他供試菌株生長(zhǎng)同樣具有顯著促進(jìn)作用，添加0.5g/L、1.0 g/L、1.5 g/L的L-蘋果酸可以促進(jìn)O.oeni144-46的生長(zhǎng)（圖1B）；添加0.5g/L、1.0 g/L的L-蘋果酸可以促進(jìn)O.oeniES-1和O.oeniSD-2a的生長(zhǎng)（圖1C、圖1D）。O.oeni可將L-蘋果酸轉(zhuǎn)化成L-乳酸，同時(shí)也產(chǎn)生丙酮酸或其代謝產(chǎn)物如乙酰磷酸，這些物質(zhì)可以作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH2）的氫受體，乙酰磷酸在轉(zhuǎn)化為乙酸的過程中，可以借助底物水平磷酸化產(chǎn)生額外的ATP，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量[22]。因此，L-蘋果酸對(duì)O.oeni生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可能是由于O.oeni對(duì)L-蘋果酸的代謝為其提供了更多的能量。當(dāng)L-蘋果酸添加量為2.0 g/L時(shí)，對(duì)O.oeni28A-1、144-46均無(wú)顯著促進(jìn)生長(zhǎng)作用，而對(duì)O.oeniES-1、SD-2a有顯著抑制作用，推測(cè)是因?yàn)榧尤脒^量的L-蘋果酸導(dǎo)致培養(yǎng)后期培養(yǎng)基的pH下降至較低水平，但是過低的pH值會(huì)嚴(yán)重抑制O.oeni的生長(zhǎng)[18]，所以加入L-蘋果酸為2.0 g/L時(shí)，對(duì)這4株菌的生長(zhǎng)無(wú)促進(jìn)效果?；诖私Y(jié)果，向ATB培養(yǎng)基中引入L-蘋果酸，并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高菌體密度。在這4株菌中，最終菌密度（OD600nm值）最高的菌株為O.oeniES-1（1.774 4±0.005 2），故選擇該株菌為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 L-蘋果酸添加量對(duì)酒酒球菌28A-1（A）、144-46（B）、ES-1（C）、SD-2a（D）生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effect of L-malic acid addition on the growth of Oenococcus oeni 28A-1 (A),144-46 (B),ES-1 (C) and SD-2a (D)

2.2 酒酒球菌ES-1培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 酒酒球菌ES-1培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

由圖2A可知，向ATB培養(yǎng)基中添加1.0 g/L或0.5 g/LL-蘋果酸可以顯著促進(jìn)菌株生長(zhǎng)（P＜0.05），最終可獲得較高的菌體密度。添加1.5 g/L的L-蘋果酸對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制作用不顯著（P＞0.05），添加2.0 g/L或2.5 g/L的L-蘋果酸對(duì)菌株生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，最終菌體密度明顯低于不添加L-蘋果酸的對(duì)照組（P＜0.01）。推測(cè)是由于高濃度的有機(jī)酸會(huì)對(duì)菌株細(xì)胞膜產(chǎn)生毒性作用，一定程度抑制菌體生長(zhǎng)[23]。故選擇1.0 g/L為L(zhǎng)-蘋果酸的最適添加量，此條件下達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的OD600nm值為1.726 9±0.006 8。

圖2 L-蘋果酸添加量（A）、初始pH（B）和接種量（C）對(duì)酒酒球菌ES-1生長(zhǎng)影響Fig. 2 Effects of L-malic acid addition (A),initial pH (B) and inoculum(C) on the growth of Oenococcus oeni ES-1

O.oeni可以一定程度地耐受高酸低pH環(huán)境，能夠在葡萄酒酒精發(fā)酵后的高酸低pH環(huán)境中進(jìn)行MLF[24]。但是過低的pH值會(huì)嚴(yán)重抑制O.oeni的生長(zhǎng)代謝，甚至造成其無(wú)法生存[18]。由圖2B可知，當(dāng)初始pH低于4.8時(shí)，O.oeniES-1的生長(zhǎng)受到極顯著的抑制（P＜0.01），隨著pH的降低，對(duì)O.oeni生長(zhǎng)的抑制作用越明顯。當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH提高至4.8時(shí)，O.oeni菌體生長(zhǎng)速度明顯加快，最終菌體密度也顯著升高（P＜0.01），但其生長(zhǎng)并不是隨著pH值的上升而呈上升趨勢(shì)，當(dāng)pH值升高至5.8時(shí)，菌體的長(zhǎng)勢(shì)略有下降。因此，O.oeniES-1在此條件下的最適生長(zhǎng)pH值范圍為4.8～5.8。當(dāng)pH為4.8時(shí)，細(xì)菌到達(dá)穩(wěn)定期的菌密度最高，OD600nm值為1.721 7±0.011 9。所以在此培養(yǎng)基條件下，該菌的最適pH為4.8。

接種量是影響菌株生長(zhǎng)及代謝的一個(gè)重要因素。由圖2C可知，接種量為1%的菌液生長(zhǎng)延滯期最長(zhǎng)；接種量為3%、5%的菌液生長(zhǎng)延滯期較短，對(duì)數(shù)期較長(zhǎng)；接種量為7%時(shí)，菌體前期生長(zhǎng)過快，產(chǎn)生的有機(jī)酸類代謝物質(zhì)快速積累，使pH迅速下降，影響了菌體自身生長(zhǎng)。除此之外，過快的生長(zhǎng)速率使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)快速消耗且菌種易老化[19]。因此，3%～7%的接種量較為適宜，當(dāng)接種量為3%時(shí)穩(wěn)定期的菌密度最高，OD600nm值為1.682 6±0.065 5。

2.2.2 酒酒球菌ES-1培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表2可知，影響O.oeniES-1最終菌體密度因素的主次順序?yàn)镃＞B＞A，即L-蘋果酸添加量＞接種量＞初始pH。由K值可以確定最優(yōu)組合為A2B1C2，即初始pH值5.1、接種量3%、L-蘋果酸添加量為1.0 g/L，在此優(yōu)化條件下可獲得最高的菌體密度，OD600nm值為1.831 3±0.017 7，活菌數(shù)為（7.33±0.40）×109CFU/mL。

表2 酒酒球菌培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for culture conditions optimization of Oenococcus oeni

2.3 高密度培養(yǎng)方法的比較

2.3.1 酒酒球菌培養(yǎng)過程中殘?zhí)菨舛群蚈D值變化曲線

細(xì)菌高密度培養(yǎng)是生產(chǎn)凍干發(fā)酵劑的基礎(chǔ)。實(shí)現(xiàn)細(xì)菌高密度培養(yǎng)的核心是為菌體生長(zhǎng)提供合理的營(yíng)養(yǎng)、及時(shí)除去毒性代謝產(chǎn)物和保持穩(wěn)定的比生長(zhǎng)速率[25]。乳酸菌發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸（如乳酸、乙酸等），會(huì)使發(fā)酵過程中pH值逐漸降低。如本研究中酒酒球菌發(fā)酵初始培養(yǎng)基pH為5.1，生長(zhǎng)到穩(wěn)定期時(shí)pH會(huì)降至3.4左右。雖然乳酸菌具有一定的低pH耐受性，但當(dāng)pH值過低時(shí)，酒酒球菌等乳酸菌的生長(zhǎng)代謝會(huì)受到明顯抑制[26]。因此，有必要采用化學(xué)中和法來控制培養(yǎng)過程pH值，減少由于pH降低對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用。

由圖3可知，酒酒球菌在發(fā)酵20 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體密度（OD600nm）迅速上升，培養(yǎng)基中殘?zhí)呛垦杆傧陆?；培養(yǎng)至80 h后到達(dá)穩(wěn)定期，菌密度無(wú)明顯變化，殘?zhí)呛肯陆邓俣染徛Ｔ谂囵B(yǎng)76 h后，培養(yǎng)基中的殘?zhí)呛肯拗萍?xì)菌的生長(zhǎng)。因此，在酒酒球菌培養(yǎng)至76 h（穩(wěn)定期前期）左右補(bǔ)加一定量的糖，或者補(bǔ)加新鮮的培養(yǎng)基等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于提高最終穩(wěn)定期時(shí)的菌體密度。故采用化學(xué)中和法分別與連續(xù)補(bǔ)料法、半連續(xù)培養(yǎng)法相結(jié)合的方案，探究不同高密度培養(yǎng)方案對(duì)O.oeni菌密度的影響，以期進(jìn)一步提高菌體密度。

圖3 酒酒球菌ES-1培養(yǎng)過程中殘?zhí)呛亢蚈D600nm值變化曲線Fig. 3 Change curve of residual sugar concentration and OD600nm value of Oenococcus oeni ES-1 during culture

2.3.2 連續(xù)補(bǔ)料法的葡萄糖補(bǔ)加量對(duì)O.oeniES-1菌體密度的影響

由圖4可知，補(bǔ)加10 g/L、13.3 g/L、16.7 g/L的葡萄糖均可以顯著提高O.oeniES-1最終的菌體密度（P＜0.05）。其中補(bǔ)加10 g/L葡萄糖的O.oeniES-1最終菌體密度最高，故10 g/L為其最適葡萄糖補(bǔ)加量。

圖4 葡萄糖補(bǔ)加量對(duì)酒酒球菌ES-1的OD600nm值影響Fig. 4 Effect of glucose supplement on OD600nm value of Oenococcus oeni ES-1

2.3.3 半連續(xù)培養(yǎng)法的離心條件對(duì)O.oeni菌體密度的影響

對(duì)于化學(xué)中和法和半連續(xù)培養(yǎng)法相結(jié)合的方案，本研究主要探究了離心時(shí)間和離心力對(duì)細(xì)胞離心收得率的影響。研究發(fā)現(xiàn)離心時(shí)間過短，離心力過低無(wú)法充分的收集到菌體，離心時(shí)間過長(zhǎng)，離心力過高則會(huì)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞造成損傷[27-29]。由圖5可知，得出的最適離心條件為離心力1 718×g，離心時(shí)間10 min，最終菌體收得率為97.65%。

圖5 半連續(xù)培養(yǎng)離心條件對(duì)細(xì)菌得率的影響Fig. 5 Effect of semi-continuous culture centrifugation conditions on bacterial yield

2.3.4 兩種高密度培養(yǎng)方案的比較優(yōu)化

圖6 不同高密度培養(yǎng)方法對(duì)細(xì)菌穩(wěn)定期OD600nm值的影響Fig. 6 Effects of different high-density culture methods on OD600nm value in bacteria stationary phase

兩種高密度培養(yǎng)方案為化學(xué)中和法分別與連續(xù)補(bǔ)料法、半連續(xù)培養(yǎng)法相結(jié)合。采用化學(xué)中和法的前提下，對(duì)比在離心力1 718×g，離心時(shí)間10 min條件下收集菌體的半連續(xù)培養(yǎng)法和補(bǔ)充不同碳氮比的連續(xù)培養(yǎng)法對(duì)菌體密度的影響。結(jié)果表明，化學(xué)中和結(jié)合連續(xù)培養(yǎng)方案中，當(dāng)碳氮比為5∶1時(shí)的菌體密度OD600nm值為1.867 6±0.010 7，活菌數(shù)為（1.08±0.17）×1010CFU/mL，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）?；瘜W(xué)中和結(jié)合半連續(xù)培養(yǎng)方案中，在離心力1 718×g，離心時(shí)間10 min條件下最終菌密度OD600nm值為1.960 7±0.018 5，活菌數(shù)為（1.67±0.11）×1010CFU/mL，顯著高于連續(xù)培養(yǎng)組和對(duì)照組（P＜0.05），且是對(duì)照組活菌數(shù)（（1.50±0.53）×109CFU/mL）的11倍，達(dá)到了高密度培養(yǎng)的目的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在ATB培養(yǎng)基中添加一定量L-蘋果酸能促進(jìn)O.oeni生長(zhǎng)。并將添加L-蘋果酸應(yīng)用于高密度培養(yǎng)的條件優(yōu)化，以O(shè).oeniES-1為出發(fā)菌株進(jìn)行菌體高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化，通過正交試驗(yàn)獲得的適宜培養(yǎng)條件為初始pH 值5.1、接種量3%、L-蘋果酸添加量1 g/L，此時(shí)O.oeniES-1活菌數(shù)可達(dá)（7.33±0.40）×109CFU/mL。采用化學(xué)中和法與半連續(xù)培養(yǎng)法相結(jié)合的方法進(jìn)一步提高菌體密度，即：間斷補(bǔ)加20% Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH，于培養(yǎng)76 h（穩(wěn)定期前期）、在離心力1 718×g，離心時(shí)間10 min條件下離心收集菌體，并補(bǔ)加新鮮ATB培養(yǎng)基，最終活菌數(shù)可達(dá)到（1.67±0.11）×1010CFU/mL，是對(duì)照組活菌數(shù)的11倍，達(dá)到了高密度培養(yǎng)的目的。