林 楓，賈若南，王法祥，許強華,2

1. 上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306

2. 上海海洋大學(xué)/大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室/國家遠洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心/遠洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306

魚類在水體中的生命活動會受到不同環(huán)境的影響，水中的溶解氧濃度變化對魚類有至關(guān)重要的影響。水中溶解氧質(zhì)量濃度在4.0 mg·L?1以上時，魚類可以正常生長發(fā)育；低于1.0 mg·L?1時，大部分魚類會出現(xiàn)浮頭現(xiàn)象[1]。水中溶解氧濃度降低，不僅使魚類呼吸和攝氧能力下降[2]，還會影響魚類細胞的存活和信號傳遞[3]，并直接影響其產(chǎn)卵、交配、生長、發(fā)育等一系列生命活動[4]，嚴(yán)重時還會出現(xiàn)死亡，破壞種群內(nèi)部的動態(tài)平衡。

斑馬魚 (Danio rerio) 具有易繁殖、發(fā)育快等優(yōu)點[5]，一直作為模式生物用于生物醫(yī)學(xué)研究[6-7]。作為模式生物，斑馬魚的應(yīng)激調(diào)節(jié)功能、心血管系統(tǒng)功能等與人類高度相似[8-9]。鰓是魚類重要的黏膜免疫器官和呼吸器官，在魚類低氧適應(yīng)研究中常作為主要的研究對象，如低氧脅迫下鰓組織中熱休克蛋白的研究[10]，草魚 (Ctenopharyngodon idellus)在低氧脅迫下鰓的差異蛋白質(zhì)組學(xué)及熱休克誘導(dǎo)[11]，低氧脅迫對卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus) 魚體鰓器官的影響[12]等。

miRNAs可以通過調(diào)控其靶基因的表達水平從而參與細胞的各類進程，并參與許多關(guān)鍵的生理進程與病理過程[13]。已有多項研究表明，miRNAs是植物和動物面臨環(huán)境脅迫作出響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，一些miRNAs可以通過調(diào)控基因表達，恢復(fù)或重建新的表達程序，從而增強細胞對脅迫的耐受性[14]。低氧是生物常常面臨的一種脅迫，目前已有一些應(yīng)對低氧脅迫miRNAs的報道。如缺氧性神經(jīng)膠質(zhì)瘤來源的外泌體通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子 3 (STAT3) 和核因子 κB (NF-κB) 途徑靶向端粒重復(fù)結(jié)合因子2 (terf2ip)，傳遞microRNA-1246誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化[15]。miR-204可以作用于血管內(nèi)皮生長因子 (vegf) 的3'-UTR區(qū)，是一個內(nèi)源性的vegf表達調(diào)控因子。miR-204通過基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控應(yīng)答低氧脅迫[16]。miR-126-5p可以作為一種新型的miRNA，在缺氧條件下靶向白細胞介素17 (IL-17A)來調(diào)節(jié)大鼠心肌細胞 (H9c2) 的活力和凋亡[17]。

熱休克蛋白 (Heat shock proteins, HSPs) 是生物在面對環(huán)境中的物理、化學(xué)、生物等刺激發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)后大量產(chǎn)生的，常被稱為應(yīng)激蛋白[18]。熱休克蛋白是生物體內(nèi)最古老的分子之一。生物體為抵御環(huán)境變化所帶來的刺激，會減少其他正常蛋白的合成，同時增加HSP的合成以應(yīng)對環(huán)境的變化，幫助生物體恢復(fù)正常[10]。因此本文在對常氧和低氧脅迫下的斑馬魚鰓組織進行小RNA組測序的基礎(chǔ)上，進一步篩選可能與低氧脅迫相關(guān)的micRNAs，并用其對熱休克蛋白基因進行了靶基因預(yù)測，以期進一步挖掘斑馬魚的低氧適應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑

small RNA 分離試劑盒，DEPC 水 (生物生工有限公司)，氯仿 (24∶1)，Trizol 試劑，異丙醇，無水乙醇 (吉泰生物公司)。

1.1.2 實驗器材

研磨棒、EP管、超凈工作臺、冰塊、移液器、各類槍頭、剪刀、鑷子、錫紙均購買于上海生物生工有限公司，低氧馴化箱 (長沙華曉電子科技有限公司定制)，離心機，旋渦儀 (德國Eppendorf有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本低氧處理

將本實驗室培養(yǎng)的多代斑馬魚分別置于1.0 mg·L?1的低氧馴化箱中，保持該濃度進行低氧脅迫，同時保留6.7 mg·L?1的溶解氧質(zhì)量濃度作為常氧對照組。在使用1.0 mg·L?1的溶解氧質(zhì)量濃度進行低氧脅迫時，發(fā)現(xiàn)2周后斑馬魚不再出現(xiàn)浮頭的現(xiàn)象，推測經(jīng)2周低氧脅迫后其逐漸適應(yīng)了低氧環(huán)境。故采用低氧馴化2周后的斑馬魚與常氧下的斑馬魚進行比對。低氧脅迫2周后，取出常氧/低氧條件下的斑馬魚，每個溶解氧質(zhì)量濃度下取樣本15尾 (體長3～4 cm)，解剖取出兩組樣本的鰓組織，備用。

1.2.2 高通量測序和生信分析

提取RNA樣本，按照NucleoZOL試劑盒進行。將所提取的RNA進行電泳檢測。檢測后將EP管放入?80 ℃冰箱進行保存。將上述常氧和低氧下斑馬魚鰓組織提取后檢測合格的RNA[19]，按照small RNA分離試劑盒的方法，分別進行small RNA的分離。將提取的small RNA進行純化，運用熒光光度計進行定量，上機檢測測序得到原始測序結(jié)果。為保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量，對原始數(shù)據(jù)進行處理。去除低質(zhì)量的reads (N比例大于10%的reads、有5'接頭污染的reads、無3'接頭序列和插入片段的reads、3'接頭序列以及polyA/T/G/C的reads)后得到的 clean small RNA reads數(shù)。其中大多數(shù)小RNA的長度為21～23 nt。對于該物種的ncRNA注釋，若有該物種小RNA的注釋信息，就用該物種ncRNA注釋所測的small RNA。若沒有該物種的信息，則選擇Rfam數(shù)據(jù)庫中rRNA、tRNA、snRNA 和 snoRNA 來注釋測序所得的 small RNA。

1.2.3 靶基因預(yù)測

本實驗室前期通過對低氧、常氧條件下鰓組織的轉(zhuǎn)錄組比較分析發(fā)現(xiàn)，常氧低氧條件下斑馬魚鰓中一共篩選獲得28個顯著差異表達的熱休克蛋白基因，包括表達量顯著下調(diào)基因12個，顯著上調(diào)基因16個[12]。對miRNAs 測序和斑馬魚鰓轉(zhuǎn)錄組進行關(guān)聯(lián)分析。針對低氧脅迫和常氧條件下斑馬魚鰓中顯著差異表達的miRNAs，對實驗室前期篩選獲得的28個差異熱休克蛋白基因進行靶基因的預(yù)測分析。miRNAs的靶基因預(yù)測使用TargetScan-Fish (http://www.targetscan.org/fish_62/)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do) 2 個網(wǎng)站同時進行。

2 結(jié)果

2.1 低氧與常氧下斑馬魚鰓的小RNA測序

常氧和低氧斑馬魚鰓樣本的小RNA組測序分別產(chǎn)生 6 995 009 和 6 662 504 bp 的原始數(shù)據(jù)。去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后分別得到 6 585 748 和 5 941 304 bp的 clean data。

常氧與低氧小RNA序列比對后獲得了相應(yīng)結(jié)果，獲得餅狀圖 (圖1)。根據(jù)餅圖比例分析，可以看出，其中常氧的miRNA約占整個small RNA總數(shù)量的40%。而低氧的約占20%。提示與常氧相比，低氧脅迫下的miRNA有降低的趨勢 (圖1)。

圖1 常氧與低氧中鰓組織miRNA占小RNA的比例Fig. 1 Proportion of miRNA in whole small RNAs sequence in normoxic and hypoxic gill tissues

2.2 低氧/常氧下鰓組織的差異 miRNAs 分析

根據(jù)測序結(jié)果，首先排除tRNA、rRNA等小分子的RNA。利用歸一化法對比低氧脅迫斑馬魚與常氧斑馬魚中同一個miRNA的表達差異量。利用火山圖呈現(xiàn)差異miRNAs的整體分布情況。結(jié)果顯示，低氧/常氧條件下的斑馬魚鰓間一共篩選出差異表達的miRNAs共32個 (圖2)。使用校正后的顯著水平 (P) 和差異倍數(shù) (Fold change) 2 個水平進行評估，設(shè)置顯著差異表達miRNAs的篩選條件為P<0.01 和 |log2(fold change)|>1。

圖2 常氧和低氧鰓組織差異miRNAs火山圖Fig. 2 miRNAs volcano map of difference between normoxic and hypoxic gill tissues

針對32個差異miRNAs，同時使用 |log2FC|≥1，P<0.05，且表達量≥50作為臨界值，從低氧和常氧的比較中，一共鑒定獲得低氧與常氧條件下顯著差異表達的15個miRNAs。其中，13個miRNAs在低氧脅迫斑馬魚鰓中的表達量顯著上調(diào)、2個miRNAs (miR-455-3p、miR-125b-5p) 的表達量顯著下調(diào)。圖3為顯著差異表達miRNAs的聚類。

圖3 常氧和低氧鰓組織差異miRNAs聚類圖Fig. 3 miRNAs clustering map of difference between normoxic and hypoxic gill tissues

2.3 差異 miRNAs 靶向熱休克蛋白基因的預(yù)測結(jié)果

針對前期篩選獲得的低氧脅迫與常氧條件下顯著差異表達的28個熱休克蛋白基因 (包括12個表達量顯著下調(diào)的hsp基因、16個顯著上調(diào)的hsp基因)[11]進行靶基因預(yù)測，結(jié)果顯示，7個顯著差異表達的miRNAs可以靶向9個熱休克蛋白基因。圖4顯示出單個miRNA靶向熱休克蛋白基因的數(shù)量。

圖4 差異miRNAs靶基因數(shù)量統(tǒng)計分析Fig. 4 Statistical analysis of number of differential miRNAs target genes

表達量顯著下調(diào)的miR-455-3p可以靶向2個顯著上調(diào)的熱休克蛋白基因 (表1)。表達量顯著上調(diào)的 miRNAs (dre-miR-194a、dre-miR-155、dremiR-130c、dre-miR-9、dre-miR-29a、dre-miR-96-5p)可以靶向7個顯著下調(diào)的熱休克蛋白基因 (表2)。

表1 斑馬魚低氧與常氧鰓中下調(diào)的miRNAs靶基因預(yù)測Table 1 Prediction of down-regulated miRNAs target genes in hypoxic and normoxic gills of D. rerio

表2 斑馬魚低氧與常氧鰓中上調(diào)miRNAs靶基因預(yù)測Table 2 Prediction of up-regulated miRNAs target genes in hypoxic and normoxic gills of D. rerio

2.4 差異 miRNAs 靶向的熱休克蛋白基因富集分析

針對差異miRNAs靶向的熱休克蛋白基因進行富集分析發(fā)現(xiàn)，富集到的生物過程功能前6條通路主要與發(fā)育相關(guān)，包括dnajb6b和hspg2兩個靶基因 (圖5)。低氧脅迫的斑馬魚鰓中表達量顯著上調(diào)的miR-455-3p靶向dnajb6b，而hspg2同時受到2 個上調(diào)的 miRNAs (miR-155 和 miR-29a) 調(diào)控。差異miRNAs靶向的熱休克蛋白基因富集的前20條通路主要涉及的基因除了上面提及的2個miRNAs外，還包括miR-194a和miR-130c同時靶向的hspb7。

圖5 差異miRNAs靶向的熱休克蛋白基因GO富集Fig. 5 GO enrichment of differential miRNAs-targeted heat shock protein genes

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)了在缺氧反應(yīng)中差異表達的15個miRNAs，13個miRNAs在低氧脅迫的斑馬魚鰓中表達量上調(diào)，2個miRNAs的表達顯著下調(diào)。也有研究表明，在下調(diào)的miRNAs中，miR-125b-5p的靶基因rps3a通過在翻譯機制中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用以抑制細胞凋亡[20]；而在上調(diào)的miRNAs中，mir-192可以通過靶向E盒結(jié)合鋅指蛋白基因 (Zeb2) 來保護肝臟免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷，增強肝臟的低氧耐受性[21-22]。在人類細胞中，miR-29b的上調(diào)可以靶向TNF受體相關(guān)因子5 (TRAF5) 保護心肌細胞免受缺氧誘導(dǎo)的細胞凋亡[23]。miR-29b在調(diào)節(jié)細胞凋亡中顯示出重要作用[24]。另外，小鼠中miR-216b可以作用于自噬相關(guān)蛋白13基因 (Atg13)，且使缺氧條件下細胞的自噬減少，并減少細胞的凋亡[25]。

高海拔人群中的miR-210-3p水平與紅細胞計數(shù)以及血紅蛋白和血細胞比容顯示出強正相關(guān)性，被認(rèn)為是人類適應(yīng)高海拔地區(qū)生活的重要miRNA[26]。miR-194過表達可以保護缺氧誘導(dǎo)的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞 (HK-2) 損傷[27]。miR-155被發(fā)現(xiàn)在低氧條件下促進內(nèi)皮細胞的血管生成[28]。人參皂甙 (GS-Rb1) 可以增加mir-29a的表達量，保護缺氧的心肌細胞[29]。大鼠中Hif-1α誘導(dǎo)的miR-9上調(diào)在缺氧期間有助于肺動脈平滑肌細胞的表型調(diào)節(jié)[30]，miR-96-5p已知有抑制細胞凋亡的功能[31]。miR-1可能在轉(zhuǎn)錄后水平直接或間接調(diào)控HSP90aa1和HSP90b1。過表達miR-1后缺氧復(fù)氧的HSP90蛋白及其亞型90aa1和90b1表達水平更低，結(jié)合之前的結(jié)果提示miR-1可能在心肌缺氧復(fù)氧中調(diào)控HSP90[32]。在高血壓心肌肥厚的早期代償階段，心肌miR-378表達的下降使其對內(nèi)源性HSF1轉(zhuǎn)錄后抑制作用減弱，進而對HSF1的代償性升高發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[33]。可見，miRNAs在低氧條件下在其他器官起著抑制細胞凋亡，增強器官的低氧耐受性，保護細胞免受缺氧帶來的損傷等一系列功能。因此，本研究篩選出的低氧和常氧之間差異表達的miRNAs很可能在低氧適應(yīng)機制中起重要作用。已知生物體在面對環(huán)境變化時會通過改變蛋白或者調(diào)節(jié)mRNAs的翻譯以適應(yīng)環(huán)境，本實驗室已經(jīng)發(fā)表過低氧脅迫下鰓組織相關(guān)熱休克差異蛋白基因，驗證了一些熱休克蛋白基因應(yīng)對低氧脅迫的作用[11]。因此，本研究利用篩選到的斑馬魚低氧與常氧狀態(tài)下差異表達的15條miRNAs對28個熱休克蛋白基因[11]進行靶基因預(yù)測，再結(jié)合miRNAs與預(yù)測的mRNAs的表達呈負(fù)相關(guān)這一特性，對預(yù)測的靶基因進行分析。

熱休克蛋白被認(rèn)為與正常和異常的胚胎發(fā)育密切相關(guān)。低氧脅迫下，低表達的miR-455-3p通過同時靶向提高hspa14和dnajb6b的表達，有可能增強了生物體的發(fā)育和機體保護，進而增強對低氧的適應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-194a同時靶向5個熱休克蛋白基因 (hspa12a、dnajc5aa、hspb7、hsp70.3、dnajb2)；而miR-155可以同時靶向4個熱休克蛋白基因 (hspa12a、hspg2、hspa13、dnajb2)。本研究還發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白基因dnajb2同時受到5個miRNAs調(diào)控。基因dnajb2是HSP70的伴侶調(diào)節(jié)劑，主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達[34]。等距遺傳性運動神經(jīng)病 (dHMN) 是一組罕見的遺傳性神經(jīng)肌肉疾病，其特征是在沒有感覺癥狀的情況下會影響腓骨肌肉的萎縮，dnajb2是23個與dHMN有關(guān)的基因之一，主要從dnajb2起始[35]?？梢酝茰y，5個miRNAs靶向抑制dnajb2基因的表達，有可能減輕了對低氧環(huán)境下生物體神經(jīng)系統(tǒng)的傷害。

Hspa14可能是肢體發(fā)育的相關(guān)基因[36]，在成年斑馬魚中進行無偏見的誘變篩選，確定了dnajb6b是心肌病的新型遺傳修飾劑[37]。缺乏熱休克蛋白基因hspg2可減輕在低氧中引起的動脈高壓[38]。另外，在靶向的熱休克蛋白基因GO功能富集前20條通路中，均有hspg2的參與。miR-155和miR-29a同時靶向hspg2，很可能通過抑制hspg2的表達來降低低氧脅迫下引起的動脈高壓，增強對低氧環(huán)境的適應(yīng)。

綜上，本研究結(jié)合常氧與低氧下差異表達的miRNAs和熱休克蛋白基因的關(guān)聯(lián)分析，為探究魚類低氧適應(yīng)機制提供了新的研究思路。