閆 莉，李 慷,2，KAMALA Gharti Chetri,3，魯 強，徐 巖，劉如聰，王桂香，ABDOUL Gadiri Sow，劉利平,2

1. 上海海洋大學/水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306

2. 上海海洋大學/上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術研究中心/水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306

3. 尼泊爾農(nóng)林大學 動物科學、獸醫(yī)和漁業(yè)學院，奇特旺 44209

淡水養(yǎng)殖是我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟生產(chǎn)的重要手段之一，淡水水產(chǎn)品是優(yōu)質(zhì)動物蛋白的重要來源[1]。近年來水產(chǎn)品品質(zhì)問題逐漸顯現(xiàn)[2]，尤其是淡水水產(chǎn)品的土腥味成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及其加工業(yè)的棘手問題，影響了產(chǎn)業(yè)發(fā)展[3-4]。已有學者對土腥味的來源[5-6]、組成[7]、積累[8]和檢測[9]等方面進行了研究。結(jié)果表明二甲基異莰醇 (2-methylisoborneol, 2-MIB) 和土臭素 (Geosmin, GSM) 是造成水產(chǎn)品土腥味的主要物質(zhì)[10]，兩者形成的原因主要為養(yǎng)殖水體中一些藻類與放線菌等所釋放的次級代謝產(chǎn)物[7]，被魚體吸收、累積。魚肉中2-MIB和GSM的嗅覺閾值分別為 0.6和0.9μg·kg?1[11-12]，因此即使?jié)舛容^低仍會影響水產(chǎn)品品質(zhì)。

對不同養(yǎng)殖模式中水生動物土腥味累積的研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖模式與水產(chǎn)品土腥味的累積關系密切。王賽[13]研究指出尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus)養(yǎng)殖塘的底質(zhì)差異影響了水環(huán)境與藻類的變化，導致水產(chǎn)品土腥味的累積；周夢海等[14]對羅非魚純投料養(yǎng)殖、水庫養(yǎng)殖、魚菜共生養(yǎng)殖模式等開展了類似實驗。在生態(tài)經(jīng)濟一體化發(fā)展的新形勢下，環(huán)境友好型的復合-生態(tài)-水產(chǎn)養(yǎng)殖模式成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的趨勢[15]。池塘內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖系統(tǒng) (Inpond raceway system, IPRS) 是一種新型的養(yǎng)殖模式，該模式利用生態(tài)處理系統(tǒng)對養(yǎng)殖水體進行凈化以達到養(yǎng)殖用水循環(huán)利用的目的[15]。目前對該模式的研究主要集中在水質(zhì)改善[16-17]、生產(chǎn)效益[18]等方面，但其中土腥味物質(zhì)的累積情況尚未見報道。

現(xiàn)今對淡水養(yǎng)殖動物土腥味物質(zhì)的研究逐漸增多，研究對象主要是鰱 (Hypophthalmichthys molitrix)[19-20]、鯉 (Cyprinus carpio)[21]、鯽 (Carassius auratus)[22]、羅非魚[14,23]等。草魚 (Ctenopharyngodon idella) 是我國主要的淡水養(yǎng)殖品種，在全國大部分地區(qū)養(yǎng)殖且產(chǎn)量居淡水魚類首位[24]，而有關草魚土腥味的研究鮮有報道。為有效評估草魚養(yǎng)殖過程土腥味累積情況，本實驗對IPRS和傳統(tǒng)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的草魚特征性土腥味物質(zhì)累積開展動態(tài)研究，分析不同養(yǎng)殖模式對特征性土腥味物質(zhì)累積的影響，為降低草魚養(yǎng)殖過程中土腥味物質(zhì)累積提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

GSM標準品、2-MIB標準品 (色譜純，Supleco, USA)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀型號為Agilent 6890N Network GC System 和 5975 inert XL Mass Selective Detector (USA, Agilent)。

本實驗于同一養(yǎng)殖場的IPRS和傳統(tǒng)養(yǎng)殖池塘開展，其中IPRS面積為20 000 m2，共有10條長25 m×寬 5 m×深 2.5 m 的養(yǎng)殖槽，養(yǎng)殖密度為32 尾·m?3；傳統(tǒng)池塘面積為 3 300 m2，池塘基質(zhì)為天然泥土，養(yǎng)殖密度為675尾·hm?2。實驗期間投喂飼料和投喂頻率一致。除IPRS少量添加由蒸發(fā)損失的水量外，其他池塘均未換水。兩種養(yǎng)殖模式的溶解氧質(zhì)量濃度均在 6 mg·L?1以上，水溫為34.20～22.23 ℃；IPRS的pH為7.7～7.1，傳統(tǒng)池塘為7.8～7.3；在實驗開始的第0、第33和第83天對IPRS和傳統(tǒng)池塘進行采樣。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗魚樣

每個模式下取3組平行，每個跑道、池塘各取3尾草魚，采集的魚樣于4 ℃保存，運回實驗室立即解剖，將采集的肌肉于?80 ℃冰箱保存待測。

1.2.2 實驗水樣

IPRS模式下，分別于跑道的前、中、后3點各采集水樣1 L；傳統(tǒng)池塘在池塘四角和中心采集水樣1 L，采樣深度均為30～50 cm[25]；分別將水樣進行充分混合后，各取1 L于棕色聚乙烯瓶，每個模式下取3組平行，水樣于4 ℃恒溫保溫箱保存后運回實驗室，于?80 ℃保存待測。

1.3 樣品分析

1.3.1 微波蒸餾萃取

魚肉解凍后，每份取5 g在冰水浴條件下勻漿，搗碎并研磨肌肉組織直至成為魚糜狀態(tài)。將顆粒氯化鈉 (NaCl) 于馬弗爐進行烘干處理，參照王國超等[26]的方法，將 50 mL 質(zhì)量濃度為 200 g·L?1的NaCl溶液與魚糜樣品混合，并加入沸石，防止爆沸；其中NaCl溶液可以利用鹽效應來增加2種待測物質(zhì)的提取效率。運用微波蒸餾法進行目標物質(zhì)的提取[14]，并用15 mL固相微萃取瓶收集萃取餾分，每份樣品重復3次平行，計算平均值。

1.3.2 固相微萃取

吸取樣品 (草魚蒸餾餾分、水樣) 5 mL 置于頂空瓶中。采用DVB/PDMS/DVB纖維頭 (65 μm，安譜) 進行頂空萃取，50 ℃下孵育15 min，萃取40 min，在GC進樣口中脫吸附5 min。然后按照設定參數(shù)進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián) (GC-MS)分析。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜分析

色譜柱為 DB-WAX (30 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度為 250 ℃；初溫 60 ℃ 保留 2.5 min，以 8 ℃·min?1升至 250 ℃，保留 5 min；載氣為高純氦氣 (99.999 9%)，載氣流速為 1.0 mL·min?1；進樣方式為無分流進樣；接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子轟擊源70 eV；檢測器2 000 V；根據(jù)保留時間及全掃描譜圖，進行物質(zhì)的定性分析，根據(jù)離子豐度高低進行物質(zhì)定量離子選擇。質(zhì)譜掃描介于 20～400 m·z?1；2-MIB的定性特征離子的質(zhì)荷比數(shù)為95、108、135；GSM定性特征離子的質(zhì)荷比數(shù)為112、125、97，SIM模式2-MIB和GSM定量特征離子質(zhì)荷比數(shù)分別為95和112。

將 2-MIB和GSM 2種標準品母液用甲醇稀釋為標準儲備液，用超純水逐級稀釋，濃度梯度分別為 0.02、0.05、0.2、0.4、0.8、2、4、10、20 μg·L?1。每個濃度設置3個平行，將檢測到的目標物質(zhì)量濃度比為橫坐標，檢出對應的峰面積響應值為縱坐標，繪制標準曲線。同時，對草魚樣品進行基質(zhì)加標，加入 0.5、2、4 μg·L?1標準溶液時，測定該方法的檢出限和回收率 (N=6)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS Statistics 26 軟件進行單因子方差分析 (One-way ANOVA)。各組數(shù)據(jù)值以“平均值±標準差 (±SD)”表示，Duncan's進行組間差異的多重比較，相關性分析采用Pearson分析方法，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線、檢出限和回收率

圖1為2-MIB和GSM工作曲線，兩者線性良好，R2分別為 0.997 7 和 0.999 4。3 倍信噪比計算得出 2-MIB 和 GSM 的檢出限分別為 5.48 和 4.72 ng·L?1。

圖1 二甲基異莰醇和土臭素標準曲線Fig. 1 Standard curve of 2-MIB and GSM

固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 (SPME-GCMS) 方法的參數(shù)檢驗見表1，其中加標質(zhì)量濃度分別為 0.5、2.0、4.0 μg·L?1情況下，兩者在微波蒸餾-固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法的回收率介于44%～74%，滿足實驗要求。

表1 固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法的參數(shù)檢驗Table 1 Parameter verification of SPME-GC-MS method

2.2 2-MIB 和 GSM 含量變化

IPRS中，水體的2-MIB質(zhì)量濃度呈逐漸上升趨勢且增加顯著 (P<0.05，圖2-a)，魚肉中的2-MIB質(zhì)量分數(shù)也隨時間的延長逐漸增加且在第33和第83天顯著高于初期 (P<0.05)；魚肉中的2-MIB質(zhì)量分數(shù)變化與水體一致。水體的GSM質(zhì)量濃度也呈逐漸增加趨勢，第83天水體和魚肉的GSM含量均顯著高于第0和第33天 (P<0.05，圖2-b)，魚肉的GSM質(zhì)量分數(shù)變化趨勢與水體一致。

圖2 兩種養(yǎng)殖模式下水體和魚肉中二甲基異莰醇、土臭素含量變化Fig. 2 Change of concentrations of 2-MIB and GSM in aquaculture water and fish muscle in different culture systems

傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式中，實驗第0和第33天水體中的2-MIB質(zhì)量濃度差異不顯著 (P>0.05，圖2-c)，但仍隨時間的延長逐漸增加；魚肉中的2-MIB質(zhì)量分數(shù)呈先降后升趨勢，第33天出現(xiàn)小幅下降，但差異不顯著 (P>0.05)，第83天魚肉中的2-MIB質(zhì)量分數(shù)顯著增加 (P<0.05)。水體中的GSM質(zhì)量濃度呈先降后升趨勢，實驗初期最高，但變化差異不顯著 (P>0.05，圖2-d)；魚肉中的GSM質(zhì)量分數(shù)呈先降后升趨勢，末期達到最大值，各個時間段內(nèi)魚肉中的GSM質(zhì)量分數(shù)變化差異顯著 (P<0.05)。

IPRS與傳統(tǒng)養(yǎng)殖池塘水體中的2-MIB質(zhì)量濃度均呈逐漸上升趨勢，實驗第83天達到最大值 (0.41和 0.44 μg·L?1) 且顯著高于第 0 和第 33 天 (P<0.05，圖3-a)。實驗第0和第83天，兩種養(yǎng)殖模式水體中2-MIB質(zhì)量濃度差異不顯著 (P>0.05)，但第33天IPRS中2-MIB質(zhì)量濃度顯著高于傳統(tǒng)池塘(P<0.05)；兩種養(yǎng)殖模式水體GSM質(zhì)量濃度無顯著差異 (P>0.05，圖3-b)。實驗期間IPRS中GSM質(zhì)量濃度呈逐漸上升趨勢，第83天顯著高于其他時期 (P<0.05)；傳統(tǒng)池塘各時期GSM質(zhì)量濃度差異不顯著 (P>0.05)。

圖3 兩種養(yǎng)殖模式水體中土臭素和二甲基異莰醇質(zhì)量濃度比較Fig. 3 Comparison of GSM and 2-MIB concentrations in aquaculture water in two culture systems

2.3 不同規(guī)格魚體土腥味物質(zhì)含量變化

IPRS中，為期83 d的實驗期間草魚的增重率為 (33.13±3.98)%，相對體長增長率為 (44.60±10.69)%；傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式中，草魚的增重率為(9.38±3.05)%，相對體長增長率為 (19.44±3.53)%(表2)。

表2 不同養(yǎng)殖模式中草魚的生長變化Table 2 Growth of C. idella in different culture systems

Pearson相關性分析顯示，IPRS模式下，魚肉的2-MIB和GSM質(zhì)量分數(shù)與體質(zhì)量、體長均具有顯著正相關關系 (P<0.05，表3)；傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式下，魚肉的2-MIB、GSM質(zhì)量分數(shù)與體質(zhì)量、體長均具有正相關關系。

表3 草魚體內(nèi)二甲基異莰醇和土臭素含量與規(guī)格的相關性分析Table 3 Correlation analysis between concentration of off-flavor compounds and fish sizes

3 討論

3.1 不同養(yǎng)殖模式下土腥味特征性物質(zhì)含量變化

本研究中，不同養(yǎng)殖模式水體中土腥味物質(zhì)的累積存在明顯差異。IPRS模式中2種土腥味物質(zhì)含量均隨養(yǎng)殖時間的延長而增加；傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式下2-MIB含量隨時間的延長也呈逐漸上升趨勢，但GSM的變化差異不顯著。傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式下2種土腥味物質(zhì)變化有差異可能與異味發(fā)生的不同步性有關。產(chǎn)生土腥味物質(zhì)的浮游藻類具有特異性[27]，即使同一屬的藻株產(chǎn)生土腥味物質(zhì)的情況也不盡相同。Izaguirre和Taylor[27]通過對能產(chǎn)生土腥味物質(zhì)的藻株進行分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有的藻株只產(chǎn)生 2-MIB，如泥生顫藻 (Oscillatoria limosa)；有的藻株只產(chǎn)生GSM，甚至從不同水體中分離出的相同藻株的土腥味產(chǎn)出能力也有所差異。李林[28]對東湖同一種類的2株銅綠微囊藻 (Microcystis aeruginosa) 培養(yǎng)物進行異味鑒定，發(fā)現(xiàn)FACHB525有強烈異味，而FACHB938卻毫無異味；從滇池分離的13株銅綠微囊藻中，僅7株會產(chǎn)生異味。由于不同養(yǎng)殖模式下水體環(huán)境不同，影響了產(chǎn)生土腥味浮游植物的種類和生物量，從而抑制了土腥味物質(zhì)的產(chǎn)生。對比兩種養(yǎng)殖模式水體中土腥味物質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，在實驗初期和末期兩種模式下2-MIB含量無顯著差異，但實驗中期IPRS模式中2-MIB含量顯著高于傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式；GSM含量在整個采樣期間均無顯著差異。相較于傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式，IPRS模式的養(yǎng)殖密度較高，單位水體投餌量也高，導致單位養(yǎng)殖水體氮、磷含量上升，系統(tǒng)中藍藻等產(chǎn)土腥味物質(zhì)的藻類更易繁殖[13,29]，加劇了土腥味物質(zhì)的積累。因此在實驗中期IPRS模式的2-MIB含量顯著高于傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式，但實驗后期，兩種養(yǎng)殖模式水體2-MIB含量無顯著差異，說明IPRS模式相較于傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式對水體中土腥味物質(zhì)的降低有積極作用。池塘管理的方式不同，使水質(zhì)因子的變化出現(xiàn)差異，導致水體中產(chǎn)生土腥味的浮游植物和微生物繁殖增生受到影響，進而影響水體中土腥味物質(zhì)含量[30-31]。IPRS模式通過在生態(tài)處理區(qū)域種植空心菜 (Ipomoea aquaticak)、鳳眼蓮 (Eichhornia crassipes)等水生植物，可以吸收水中氮、磷營養(yǎng)物質(zhì)，凈化養(yǎng)殖槽中的尾水，同時防止產(chǎn)生異味的微囊藻暴發(fā)[32-33]。因此，當養(yǎng)殖溫度降低，產(chǎn)生土腥味物質(zhì)的藻類、放線菌等環(huán)境因子的活動相對減弱，IPRS模式中池塘的自凈能力發(fā)揮作用，使得其2-MIB含量低于傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式。

本研究顯示，水體中土腥味物質(zhì)含量不能完全反映出草魚肌肉中的土腥味物質(zhì)含量。當水體中2-MIB含量逐漸增大時，草魚中該物質(zhì)的變化呈先降后升的趨勢；而水體中的GSM含量變化差異不顯著，魚肉中的GSM含量在實驗末期顯著高于實驗前期和中期。由于土腥味物質(zhì)在水生動物體內(nèi)的積累過程緩慢且持久，水生動物對土腥味物質(zhì)的吸收不僅取決于環(huán)境中土腥味物質(zhì)的含量，還與其自身的吸收與代謝能力有關。研究發(fā)現(xiàn)，當親脂性化合物如GSM等通過血液循環(huán)系統(tǒng)運輸?shù)紧~全身時，它們首先在高血流量器官 (如肝臟) 中迅速積累，其次在低血流量器官 (如肌肉和組織) 中緩慢積累[34]，進而影響土腥味物質(zhì)在其體內(nèi)的分布和積累[35]。將虹鱒 (Oncorhynchus mykiss) 暴露于一定濃度的GSM養(yǎng)殖環(huán)境中，按照不同采樣時間測定虹鱒的肝臟與無肝胴體GSM含量，發(fā)現(xiàn)無肝胴體虹鱒GSM含量隨暴露時間的增加顯著升高，而肝臟脂質(zhì)部分中最高GSM含量在第一個采樣點(2 h) 出現(xiàn)，隨后下降[35]。水生動物吸收與代謝能力受個體的影響較大，這與遺傳基礎有關，也可能與環(huán)境因素有關[36]，正是這種生物轉(zhuǎn)化機制導致水生動物對土腥味物質(zhì)的積累程度出現(xiàn)差異。徐立浦等[37]通過對天津地區(qū)寡鹽水池塘養(yǎng)殖水體與養(yǎng)殖魚體內(nèi)土腥味物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，水體土腥味嚴重的池塘中，魚體土腥味含量并非最高，這與本研究中傳統(tǒng)池塘的結(jié)果一致。有研究指出，較高的水溫是導致土腥味物質(zhì)積累的主要原因之一[38]。水溫不僅影響水生動物的攝食、生長[39]，還會引起魚鰓通氣量增加[7]，從而促進水體中土腥味物質(zhì)在魚體血液中的擴散，加快其對2-MIB和GSM的吸收。本研究于夏季8—10月開展實驗，期間溫度較高，導致兩種養(yǎng)殖模式下草魚體內(nèi)土腥味物質(zhì)含量均在10月達到最高。

因養(yǎng)殖模式的差異，IPRS的養(yǎng)殖密度明顯高于傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式，養(yǎng)殖槽內(nèi)有機負荷高于傳統(tǒng)池塘并導致富營養(yǎng)化，同時IPRS整體凈化優(yōu)勢被養(yǎng)殖槽內(nèi)高密度差異所覆蓋。因此，IPRS養(yǎng)殖槽內(nèi)水體的土腥味物質(zhì)含量高于傳統(tǒng)養(yǎng)殖池塘。傳統(tǒng)池塘中草魚肌肉的土腥味物質(zhì)含量與水體中的變化趨勢不一致，可能是魚體自身代謝水平差異所致，具體原因有待進一步研究。

3.2 不同規(guī)格草魚的土腥味特征性物質(zhì)含量變化

2-MIB和GSM在水生動物體內(nèi)的積累受水中土腥味物質(zhì)、魚體脂質(zhì)含量和魚體大小的影響。本研究將不同規(guī)格 (0.42～3.61 kg) 草魚肌肉中的土腥味物質(zhì)含量與其體質(zhì)量、體長進行相關性分析，結(jié)果表明草魚體質(zhì)量、體長與其肌肉中土腥味物質(zhì)含量呈正相關。有研究指出，魚的脂肪含量影響了魚肉中腥味化合物的積累程度[40]。含脂量高的魚，其土腥味物質(zhì)的溶解率也高[41]；Yarnpakdee等[42]研究發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚和斑點胡子鯰 (Clarias macrocephalus) 腹部肌肉脂肪含量高于背部，腹部肌肉中GSM和2-MIB的含量高于背部肌肉。Dionigi等[40]24 h急性實驗結(jié)果表明，高脂魚對 2-MIB 的積累能力是低脂魚的3倍以上。韓萃等[43]研究了不同規(guī)格、不同含脂量的虹鱒土腥味含量，發(fā)現(xiàn)規(guī)格越大、含脂量越高的魚體，土腥味越重。水生動物體內(nèi)土腥味物質(zhì)的積累速率與個體差異有關，魚體中土腥味物質(zhì)的吸收和凈化相對速率不同，導致體內(nèi)土腥味物質(zhì)的積累程度存在差異[40]?？傮w而言，不同規(guī)格的草魚對土腥味物質(zhì)的富集程度不同，水生動物體內(nèi)土腥味物質(zhì)的積累速率是否與一定范圍內(nèi)水生動物的生長速率有關還需進一步研究。

4 結(jié)論

養(yǎng)殖水體和草魚肌肉中的土腥味物質(zhì)含量受養(yǎng)殖模式的影響，同時草魚體內(nèi)土腥味物質(zhì)的積累速度受魚體規(guī)格的影響。