周勝杰，楊 蕊，于 剛，馬振華

1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南 三亞 572018

2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)可持續(xù)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300

3. 三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南 三亞 572018

黃鰭金槍魚 (Thunnus albacares) 屬硬骨魚綱、輻鰭魚亞綱、鱸形目、鯖亞目、鯖科、金槍魚屬，是名貴的海洋暖水性上層魚類。因其背鰭和臀鰭呈黃色 (成年后尤為明顯)而得名，屬于金槍魚中產(chǎn)量最高的一種。黃鰭金槍魚具有高度洄游的特性，廣泛分布于世界三大洋的熱帶和溫帶水域，最大體長可達3 m，體質(zhì)量可達225 kg。因營養(yǎng)價值豐富、味道鮮美可口而深受消費者喜愛[1]。目前，關(guān)于黃鰭金槍魚的研究主要集中在營養(yǎng)成分、捕撈、魚群分布、開發(fā)利用、保鮮運輸?shù)确矫?。澳大利亞、日本、墨西哥、巴拿馬等國已開展黃鰭金槍魚的網(wǎng)箱養(yǎng)殖作業(yè)并取得良好效果[2-9]。我國關(guān)于黃鰭金槍魚養(yǎng)殖研究的公開報道較少。Ma等[10]研究了美濟礁深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的黃鰭金槍魚幼魚馴化過程中攝食水深的變化；方偉等[11]開展了5月齡黃鰭金槍魚幼魚形態(tài)性狀對體質(zhì)量的相關(guān)性及通徑分析。目前黃鰭金槍魚養(yǎng)殖方式主要為網(wǎng)箱養(yǎng)殖，養(yǎng)殖所需幼魚主要來自于野生苗種誘捕。我國黃鰭金槍魚網(wǎng)箱及陸基循環(huán)水馴化養(yǎng)殖技術(shù)仍處于起步階段[12]。

高價值經(jīng)濟魚類新品種的開發(fā)需要詳細的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，體質(zhì)量能反映同批魚苗的生長狀況，通常用作優(yōu)質(zhì)品種選育的常規(guī)手段[13-16]。魚類為低等變溫脊椎動物，特異性免疫力較低，主要依靠非特異性免疫對外來入侵病原生物、異物或機體產(chǎn)生的有害物質(zhì)進行清除[17]，因此非特異性免疫對其生存具有重要意義[18]。而免疫相關(guān)酶的活性變化能夠有效反映黃鰭金槍魚幼魚免疫能力的變化。魚體腸道在營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收中發(fā)揮著重要作用，消化酶活性與魚類消化系統(tǒng)的功能相適應(yīng)[19]，在一定程度上反映了魚體消化道的生理狀態(tài)，魚體內(nèi)消化酶活性及其腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)受到多種因素影響[20]。有研究表明，投喂策略、投喂餌料種類、發(fā)育階段等均會影響魚體內(nèi)的消化酶活性[20-21]。因此測定不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚幼魚的各種消化酶活性對研究其食性偏好有重要意義。目前關(guān)于黃鰭金槍魚幼魚陸基循環(huán)水養(yǎng)殖的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)較少，尚未見不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚幼魚酶活指標差異的研究。本研究測定了不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚幼魚的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為其陸基養(yǎng)殖積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有利于構(gòu)建設(shè)施化金槍魚養(yǎng)殖技術(shù)體系，為我國后續(xù)開展金槍魚深遠海養(yǎng)殖和陸基循環(huán)水養(yǎng)殖推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

黃鰭金槍魚幼魚共60尾，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院深遠海養(yǎng)殖技術(shù)與品種開發(fā)創(chuàng)新團隊于2020年11月—2021年2月在海南陵水黎族自治縣新村鎮(zhèn)附近海域誘捕，并轉(zhuǎn)運至基地后進行馴化養(yǎng)殖，馴養(yǎng)池規(guī)格為長8.6 m×寬5.6 m×高 2.8 m。各項水質(zhì)指標為：水溫 (22.5±0.5) ℃，溶解氧質(zhì)量濃度>8.50 mg·L?1，pH 7.93±0.12，鹽度 33，氨氮<0.1 mg·L?1，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度<0.1 mg·L?1，實驗用魚體質(zhì)量410～2 580 g。馴化期間投喂新鮮雜魚。

1.2 實驗設(shè)計

經(jīng)過1個月的馴養(yǎng)，野生黃鰭金槍魚幼魚能正常攝食人工投料視為馴化成功。馴化成功后，將其按照體質(zhì)量分為 4組 [500 g (250～750 g)、1 000 g (750～1 250 g)、1 500 g(1 250～2 000 g)、2 500 g (2 000～3 000 g)]，每組 15 尾，每組隨機抽取5尾進行麻醉。黃鰭金槍魚幼魚使用丁香酚 (10～30 μg·L?1) 麻醉后，用一次性注射器 (注射器用抗凝劑肝素潤洗) 從幼魚尾部抽取血液樣品 (每尾取血 4 mL) 并按照比例加入抗凝劑 [(每 mL 血液肝素用量為 (15±2.5) U]，于4 ℃保存并靜置30 min，然后用臺式高速冷凍離心機 (型號 EXPERT 18K-R) 4 ℃、3 000 r·min?1離心 10 min。提取上清液后測定血液樣品酶活。采血完成后的黃鰭金槍魚幼魚解剖取肌肉、胃、前腸、肝臟等組織用于樣品測定。測定酸性磷酸酶 (ACP)、堿性磷酸酶 (AKP)、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)精確到小數(shù)點后兩位。

1.3 樣品處理

稱量各實驗組樣品后，與0.2 mol·L?1生理鹽水按指定比例進行研磨，研磨液 2 ℃，研磨后 4 ℃、15 000 r·min?1離心10 min，取上清，置于?80 ℃?zhèn)錅y，各消化酶及免疫酶活性分別采用相關(guān)試劑盒進行測定 (南京建成生物工程研究所)。本實驗中酶活性以每毫克可溶解蛋白酶活性值(U·mg?1)、每克可溶解蛋白酶活性值 (U·g?1)、每升可溶解蛋白酶活性值 (U·L?1) 表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)并作圖，利用SPSS 19.0軟件進行顯著性差異分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚幼魚ACP活性差異

不同體質(zhì)量的黃鰭金槍魚幼魚不同組織中的ACP活性存在一定差異，均表現(xiàn)為腸道>肌肉>肝臟>血清 (圖1)。血清中的ACP活性在體質(zhì)量 500 g時達到最高 [(1 655.99±194.95) U·L?1]，而后隨著體質(zhì)量的增加逐漸降低，而當(dāng)體質(zhì)量達 1 500 g 時降至最低 [(763.67±38.14) U·L?1]，當(dāng)體質(zhì)量達 2 500 g 時又輕微回升 [(929.64±86.85) U·L?1]，且相鄰兩組之間差異顯著 (P<0.05) 。僅在體質(zhì)量為 1 000 g時，腸組織中 ACP 活性 [(420 382.21±37 313.08) U·L?1]，顯著低于其余體質(zhì)量組 (P<0.05) ，其余組間差異不顯著(P>0.05)。肌肉組織和肝臟中ACP活性在不同體質(zhì)量組間差異不顯著 (P>0.05)，未見規(guī)律性變化。

圖1 黃鰭金槍魚幼魚不同組織中酸性磷酸酶活性差異Fig. 1 Difference of ACP activity in various tissues of juvenile T. albacares

2.2 不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚幼魚AKP活性差異

不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚幼魚各組織中AKP活性存在差異，均表現(xiàn)為腸道>肝臟>肌肉>血清 (圖2)。血清中AKP活性在體質(zhì)量為 500、1 000、1 500 g 組中差異不顯著，當(dāng)體質(zhì)量為 2 500 g時血清中 AKP活性驟降 [(29.97±3.56) U·g?1]，與其他體質(zhì)量組之間差異顯著 (P<0.05)。腸組織中AKP活性在體質(zhì)量為1 000 g時有所下降 [(29.97±3.56) U·g?1]，與其他體質(zhì)量組之間差異顯著 (P<0.05)，其他各組間差異不顯著 (P>0.05)。肌肉組織中AKP活性隨著體質(zhì)量的增加呈先下降后逐漸穩(wěn)定的趨勢，500 g體質(zhì)量組中 AKP 活性 [(411.62±49.32) U·g?1]顯著高于 1 000 和2 500 g 組 (P<0.05)，1 500 g 體質(zhì)量組與其他各組間差異不顯著 (P<0.05)。肝臟中AKP活性隨著體質(zhì)量的增加呈先輕微下降后緩慢增加的趨勢，當(dāng)體質(zhì)量為1 000 g時，活性最低[(74 883.05±991.00) U·g?1]，體質(zhì)量為 2 500 g 時活性最高 [(116 359.06±1 295.10) U·g?1]，相鄰兩組間差異顯著(P<0.05)。

圖2 黃鰭金槍魚幼魚不同組織中堿性磷酸酶活性差異Fig. 2 Difference of AKP activity in various tissues of juvenile T. albacares

2.3 不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚幼魚消化酶 活 性差異

隨著體質(zhì)量的增加，黃鰭金槍魚幼魚消化器官中各消化酶活性出現(xiàn)一定波動，但整體較穩(wěn)定 (圖3)。腸道中3種消化酶活性依次為胰蛋白酶>淀粉酶>脂肪酶；胃中2種消化酶活性為淀粉酶>胃蛋白酶。黃鰭金槍魚幼魚各體質(zhì)量之間腸道淀粉酶、腸道脂肪酶、胃淀粉酶、胃蛋白酶活性差異均不顯著 (P>0.05)。腸道胰蛋白酶活性呈波動性變化，體質(zhì)量為 500 g 時活性最高 [(3 230.51±628.91) U·mg?1]，顯著高于體質(zhì)量 1 000 和 2 500 g 組 (P<0.05)，其他 3 組間差異不顯著 (P>0.05)。

圖3 黃鰭金槍魚幼魚不同器官中消化酶活性差異Fig. 3 Difference of digestive enzyme activities in various tissues of juvenile T. albacares

3 討論

3.1 不同體質(zhì)量組之間黃鰭金槍魚幼魚4種組織中ACP和AKP活性差異

磷酸酶包括ACP和AKP 兩種，是重要的磷代謝酶，具有促進含磷 (P) 物質(zhì)消化吸收、代謝、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)運、再利用等的功能，同時是重要的免疫反應(yīng)酶及重要的解毒酶類[22]。有研究表明，ACP和AKP是細胞磷酸化和去磷酸化可逆性調(diào)節(jié)機制的重要參與者，也是細胞增殖啟動的重要參與者[23-24]，因此其活性高低可有效反映魚類對P或含P物質(zhì)的分解、吸收、再利用、轉(zhuǎn)運等功能的有效性，反映對外來入侵物的分解能力，起到免疫的效果[25]。

3.1.1 ACP 活性差異

ACP是溶酶體的標志酶之一，其反應(yīng)顆粒分布之處表明溶酶體和其他水解酶的存在，細胞內(nèi)消化過程在此處進行[18]。4個體質(zhì)量組4種組織中ACP活性均表現(xiàn)為腸道>肌肉>肝臟>血清。研究結(jié)果與茴魚 (Thymdlus grube) 相似(腎臟>肌肉>肝臟)，且活性均高于茴魚[18]。說明本實驗中黃鰭金槍魚幼魚溶酶體和其他水解酶豐富，細胞內(nèi)消化過程活躍，其中腸道、肌肉和肝臟代謝速率較高，對含P物質(zhì)的分解、吸收和利用效率高，對外來入侵物質(zhì)或入侵生物的清理能力強。外在表現(xiàn)為免疫力強、生長速度快和運動量大。其中腸道的ACP活性在所有質(zhì)量組中均最高，表明本實驗中腸道ACP更活躍，而其高活性代表對含P物質(zhì)分解、消化和吸收能力更強?？赡芤驗槟c道是與食物直接接觸的重要器官，需要更強的免疫力來分解細菌、病毒或有毒有害物質(zhì)，保證自身的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。而肌肉和肝臟中ACP活性較高可能是因為在本實驗中黃鰭金槍魚幼魚處于快速生長階段，需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)參與機體構(gòu)建，因此通過提高ACP活性的方式提高細胞對含P物質(zhì)的吸收利用能力。而血清中ACP活性最低，可能與血液的主要功能為轉(zhuǎn)運有關(guān)。腸道、肌肉、肝臟3種組織中的ACP活性保持穩(wěn)定，同時血清中ACP活性穩(wěn)步地降低，表明無明顯的外界刺激，黃鰭金槍魚內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，養(yǎng)殖過程中生活環(huán)境及餌料供給較穩(wěn)定，未發(fā)生突發(fā)性疾病印證了這一點。

3.1.2 AKP 活性差異

AKP是一種重要的免疫反應(yīng)酶，直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移，具有重要的調(diào)控功能，其活性在機體代謝中起著非常關(guān)鍵的作用，在臨床醫(yī)學(xué)中通常作為診斷外來病原入侵或環(huán)境毒素入侵等的重要指示[26-28]。在本研究中，AKP活性在所有體質(zhì)量組中均表現(xiàn)為腸道>肝臟>肌肉>血清，這與長絲鱸 (Osphronemus goramy)、茴魚及草魚 (Ctenopharyngodon idella) 的研究結(jié)果類似，均為肝>肌肉[29-30]。且在本研究中，腸道及肝臟中AKP活性值遠大于肌肉和血清 (相差3個數(shù)量級)，表明與外界食物直接接觸的腸道和重要的免疫器官肝臟需要更高活性的AKP來提高免疫能力。同時腸道是含P物質(zhì)重要的分解、吸收、轉(zhuǎn)運起點，肝臟是磷酸基團重要的中間存儲轉(zhuǎn)化合成器官和免疫器官，對AKP活性均有較高的需求。隨著體質(zhì)量的增加，黃鰭金槍魚幼魚腸道和肝臟的AKP活性輕微上升，而血清和肌肉中的則逐漸下降。這可能是因為隨著體質(zhì)量的增加，黃鰭金槍魚幼魚器官組織發(fā)育程度逐漸完善，組織器官功能的定位及功能分化愈發(fā)清晰。同時，養(yǎng)殖條件下黃鰭金槍魚幼魚攝食難度低，運動量必然小于野生狀態(tài)，這可能是導(dǎo)致肌肉AKP活性輕微下降的原因之一。在體質(zhì)量為2 500 g時，血清中AKP活性驟降，且誤差值較小，表明活性數(shù)值穩(wěn)定，受突發(fā)性環(huán)境因素干擾的可能性較小，應(yīng)與所處生長發(fā)育階段有關(guān)，具體機理有待進一步研究。

AKP和ACP活性在腸道和肝臟中均較高，表明黃鰭金槍魚對P具有較強的分解和合成能力，對氨基酸、核苷酸等大分子物質(zhì)具有較好的分解和再利用能力；對外源物質(zhì)和自身廢棄物有較強的分解和再利用能力；對外界環(huán)境因子變化和病原體入侵具有較強的免疫能力和抗逆性。血清中AKP和ACP活性的降低可能與免疫器官逐步發(fā)育完善有關(guān)。

3.2 不同體質(zhì)量組間黃鰭金槍魚幼魚3種消化酶活性差異

蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等是參與營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要酶類，是評估消化吸收能力及功能的重要指標[31]。淀粉酶可將淀粉催化分解成單糖以便吸收利用[32]；脂肪酶能夠?qū)⑹澄镏械闹痉纸鉃橹舅岷透视头肿右员阄绽肹33]；蛋白酶可將食物中的蛋白質(zhì)水解為可供機體吸收的氨基酸[34]。因此測定消化器官中各種消化酶的活性，有助于了解養(yǎng)殖魚類對所攝食餌料的消化狀態(tài)[35]。魚類消化酶活性受多種因素影響，包括發(fā)育階段、季節(jié)變化、餌料變化、投喂策略、環(huán)境變化等。有研究表明魚類在不同的發(fā)育階段，其口徑有較大變化，導(dǎo)致其攝食餌料的種類也發(fā)生變化，為充分吸收利用足夠的營養(yǎng)，各種消化酶活性隨著攝入餌料種類的變化而改變，例如大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris) 幼魚、成魚消化酶活性有顯著差異[36]。本研究中，不同體質(zhì)量的黃鰭金槍魚幼魚，口徑和體型存在一定差異，測定消化酶活性可有效反映其不同體質(zhì)量之間生理生化及所需營養(yǎng)的變化。本研究中，黃鰭金槍魚幼魚消化器官中各消化酶活性隨體質(zhì)量的增加出現(xiàn)一定波動，但整體較穩(wěn)定。不同體質(zhì)量之間腸道淀粉酶、腸道脂肪酶、胃淀粉酶、胃蛋白酶活性均無顯著差異 (P>0.05)。腸道蛋白酶活性呈波動性變化，體質(zhì)量為500 g時活性最高 [(3 230.51±628.91) U·mg?1]，顯著高于體質(zhì)量為1 000 g 和 2 500 g 兩組 (P<0.05)，其他體質(zhì)量組之間差異不顯著 (P>0.05)。有研究表明，脂肪酶活性在肉食性魚類中較高，淀粉酶活性在草食性魚類中較高[37]，如在青魚(Mylopharyngodon piceus) 腸道中發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，即胰蛋白酶活性>脂肪酶活性>淀粉酶活性[38]。本研究結(jié)果與之不同，黃鰭金槍魚幼魚腸道中3種消化酶活性排序為胰蛋白酶>淀粉酶>脂肪酶。與青魚相比，黃鰭金槍魚的淀粉酶活性更高、胰蛋白酶活性相似、脂肪酶活性較低，表明黃鰭金槍魚幼魚對蛋白類營養(yǎng)物質(zhì)和淀粉類營養(yǎng)物質(zhì)有較好的吸收利用能力，而對脂肪的需求量相對較少；與大彈涂魚對比發(fā)現(xiàn)，本研究中黃鰭金槍魚胃蛋白酶、淀粉酶活性更高，而脂肪酶活性差異較小[36]，表明黃鰭金槍魚對蛋白類和淀粉類食物有更好的消化吸收能力。有研究指出黃鰭金槍魚肌肉脂肪含量較低[4]，對脂肪的消化吸收能力相對較差，可能是導(dǎo)致肌肉的脂肪含量較低的原因。而降低對脂肪類食物的消化吸收速率，保持較高的蛋白酶、淀粉酶消化吸收速率，有利于降低體脂率，保持更好的運動能力。

4 結(jié)論

本研究表明，黃鰭金槍魚幼魚在陸基循環(huán)水養(yǎng)殖條件下不同體質(zhì)量之間存在免疫酶和消化酶活性差異。AKP和ACP活性在腸道和肝臟中均較高，黃鰭金槍魚在重要的外源物質(zhì)接觸器官和重要的免疫器官對P或含P類營養(yǎng)物質(zhì)具有較強的分解、吸收和合成利用的能力，對外源入侵物具有較高的免疫能力。肌肉ACP活性高于AKP，表明肌肉對P的利用功能大于轉(zhuǎn)運。ACP和AKP活性隨著體質(zhì)量的增加在黃鰭金槍魚幼魚不同組織中的表達量有所變化。黃鰭金槍魚幼魚消化酶活性整體穩(wěn)定，隨著體質(zhì)量的變化小范圍地增加或降低，差異較小。蛋白酶活性最高表明其攝食偏好肉類。黃鰭金槍魚2種免疫相關(guān)酶活性及其相關(guān)指標隨體質(zhì)量增加的變化規(guī)律有所差異，這可能與免疫器官的逐步發(fā)育完善有關(guān)，具體機理有待進一步研究。黃鰭金槍魚幼魚對蛋白類營養(yǎng)物質(zhì)和淀粉類營養(yǎng)物質(zhì)有較好的吸收利用能力，而對脂肪的需求量相對較少，內(nèi)在原因及機理有待進一步探索。