陳曉雷，李 敏，陳作志，張 俊，張 帥，齊占會(huì)，徐姍楠

1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306

3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室 (廣州)，廣東 廣州 511458

燈籠魚是棲息于中層海域 (200～1 000 m) 的小型游泳魚類，廣泛分布于全球各大洋開闊海域，是中層魚的主要生物類群，其資源量巨大，約占全球深海中層魚類生物量的65%[1]。燈籠魚在攝食浮游生物的同時(shí)又被更高營養(yǎng)級(jí)生物 (如大中型魚類)所捕食，在海洋食物網(wǎng)的能量流動(dòng)和轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作用[2]。

亮眶燈魚 (Diaphus splendidus) 隸屬于燈籠魚科、眶燈魚屬，是燈籠魚的主要優(yōu)勢種之一。食性研究是魚類生物學(xué)和生態(tài)學(xué)研究的重要內(nèi)容，是了解不同魚類間營養(yǎng)關(guān)系的基礎(chǔ)，同時(shí)也是探討攝食策略、評(píng)估魚類生存狀況和生態(tài)系統(tǒng)功能的重要依據(jù)[3]。目前，國外對(duì)燈籠魚食性研究的相關(guān)報(bào)道按照區(qū)域劃分有太平洋[4-6]、大西洋[7-8]、印度洋[9]、阿拉伯海[10]及南大洋[11-12]等。國內(nèi)對(duì)燈籠魚攝食方面的研究也有陸續(xù)報(bào)道，如東海和黃海海域的七星底燈魚 (Benthosema pterotum)[13]，南海海域的金鼻眶燈魚 (D. chrysorhynchus)[14]、瓦氏眶燈魚(D. watasei)[15]等。已有研究顯示，燈籠魚的食物組成主要以橈足類、介形類、端足類、磷蝦類、翼足類、毛頜類等浮游動(dòng)物為主，也有少量的頭足類和魚類幼體及其卵，采用的研究方法多為形態(tài)學(xué)鑒定。胃含物形態(tài)學(xué)鑒定雖然操作簡單，但針對(duì)消化程度較高、腐爛程度較嚴(yán)重的胃含物則難以鑒定甚至無法鑒定[16-17]，從而可能低估了食物多樣性，不適于個(gè)體較小生物的食性分析[18]，且工作量大，對(duì)鑒定人員專業(yè)技術(shù)能力要求高[17]。

宏條形碼技術(shù)結(jié)合DNA條形碼和高通量測序技術(shù)，將樣本中所有生物作為一個(gè)整體提取DNA，使用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序后得到的可操作分類單元 (Operational taxonomic units, OTU) 進(jìn)行物種鑒定[19]，具有信息量大、靈敏度高、成效快、成本低等優(yōu)勢，在生物食性研究的應(yīng)用上越來越廣泛[20]。近年來，該技術(shù)已應(yīng)用于魚類、翼足類和水母等海洋生物的攝食多樣性研究[21-24]，彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)鑒定方法在鑒別消化程度較高、腐爛程度較嚴(yán)重的胃含物方面的不足。

目前，尚未有使用宏條形碼技術(shù)研究南海燈籠魚食性的報(bào)道。本研究選取南海亮眶燈魚為研究對(duì)象，運(yùn)用宏條形碼技術(shù)分析其食性組成，探討宏條形碼技術(shù)在燈籠魚食性研究中的可行性，為今后南海燈籠魚食性研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

亮眶燈魚樣本由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所“南鋒”號(hào)調(diào)查船于2020年7月在南海(110°22.603'E, 16°46.704'N—110°25.950'E,16°44.952'N) 進(jìn)行中層魚類拖網(wǎng)中采集。該船總長66.66 m，船寬 12.40 m，總噸位 1 537 GT，滿載排水量1 980 t，主機(jī)功率 1 920 kW，副機(jī)功率 450 kW×2。采樣點(diǎn)位置水深為1 350 m，使用中層網(wǎng) (主尺度為 136. 10 m×50. 85 m，網(wǎng)囊網(wǎng)目尺寸為 10 mm)于 500 m 水深平行拖網(wǎng) 1 h，拖速為3.1 kn。采集的樣品經(jīng)鑒定后于?20 ℃保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后于?80 ℃ 保存。

1.2 樣品處理

待魚體解凍后，隨機(jī)挑選亮眶燈魚8尾，用濾紙吸干魚體表面水分后進(jìn)行生物學(xué)測定(圖1)，樣品的生物學(xué)信息見表1。各項(xiàng)測定指標(biāo)參照GB/T 12763.6—2007《海洋調(diào)查規(guī)范 第6部分：海洋生物調(diào)查》，主要包括體長、體質(zhì)量和攝食強(qiáng)度等。亮眶燈魚的攝食強(qiáng)度使用目測法進(jìn)行鑒定，分為5級(jí) (0～4級(jí))，分別對(duì)應(yīng)空胃，胃內(nèi)有少量食物且體積不超過胃腔的1/2，胃內(nèi)食物較多且體積超過胃腔的1/2，胃內(nèi)充滿食物但胃壁不膨脹和胃內(nèi)食物飽滿、胃壁膨脹變薄5種狀態(tài)。鑒定完畢后將亮眶燈魚的全部胃含物 (包括胃內(nèi)黏液) 放入離心管中進(jìn)行DNA提取。

圖1 南海亮眶燈魚與其胃含物Fig. 1 D. splendidus of South China Sea andits stomach contents

表1 亮眶燈魚生物學(xué)信息Table 1 Sampling information of D. splendidus

由于拖網(wǎng)時(shí)燈籠魚形態(tài)受損，依據(jù)形態(tài)特征鑒定較為困難，為確保物種鑒定的準(zhǔn)確性，同時(shí)取背部肌肉用于分子鑒定。為避免實(shí)驗(yàn)過程中的交叉污染，嚴(yán)格按照無污染操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 DNA 提取與擴(kuò)增

使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根) 按照其說明書進(jìn)行總DNA提取。DNA濃度和質(zhì)量使用超微量分光光度計(jì)測量，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

肌肉DNA使用魚類通用引物FishF1和FishR1[25](表2) 對(duì)線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(COI) 區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段大小為655 bp。擴(kuò)增總體系為 25 μL：1.1×PCR Mix 22 μL (擎科生物)，正反引物 (5 μmol·L?1) 各 1 μL，DNA 模板 1 μL。擴(kuò)增程序如下：98 ℃ 預(yù)變性 2 min；98 ℃ 變性10 s，55 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 12 s，共 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸4 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢驗(yàn)合格后送至測序公司測序。

表2 亮眶燈魚肌肉和胃含物種類鑒定的PCR引物Table 2 PCR primers for species identification of muscle and stomach contents of D. splendidus

胃含物DNA使用通用引物mlCOIintF和jgHCO2198[26-27](表2) 對(duì) COI基因高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約為313 bp。擴(kuò)增總體系為50 μL：10×High Fidelity PCR buffer 5 μL，dNTPs(10 mmol·L?1) 2 μL，TaKaRaTaq酶 0.2 μL，MgSO4(25 mmol·L?1) 4 μL，ddH2O 35.8 μL，含有 barcode 的正反引物 (5 μmol·L?1) 各 1 μL，DNA 模板1 μL。由于引物簡并堿基較多，簡并性較高，所以采用冷啟動(dòng)降落PCR程序盡可能地減少非特異擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；16個(gè)降落循環(huán) (95 ℃ 變性 10 s，62 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min)，每個(gè)循環(huán)退火溫度下降1 ℃；25個(gè)普通循環(huán) (95 ℃ 變性 10 s，46 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min)；72 ℃ 延伸 4 min。PCR 產(chǎn)物通過 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至上海生工進(jìn)行高通量測序。DNA提取和PCR擴(kuò)增均使用ddH2O做陰性對(duì)照，所有的陰性對(duì)照均無目的條帶，表明實(shí)驗(yàn)過程中無污染產(chǎn)生。

1.4 數(shù)據(jù)處理

肌肉序列使用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進(jìn)行比對(duì)，若兩者序列相似度≥97%，則認(rèn)為可以鑒定到種水平[22]，即為亮眶燈魚。

通過 Illumina Miseq 2×300 bp 測序平臺(tái) (Illumina，美國) 雙端測序得到下機(jī)數(shù)據(jù)，去除引物接頭序列，根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系，將成對(duì)的讀長拼接成一條序列，然后按照標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對(duì)各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本的有效序列。應(yīng)用Usearch(11.0.667)[28]軟件對(duì)有效序列按照97%的序列相似度進(jìn)行聚類得到OTU，選擇OTU代表序列使用BLAST 與 NCBI NT (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫比對(duì)進(jìn)行物種注釋并人工校對(duì)，篩選出序列的最佳比對(duì)結(jié)果。若滿足序列相似度 (per. identity)≥97%，則認(rèn)為鑒定到種水平；若滿足序列相似度90%～97%，則認(rèn)為鑒定到屬水平[29-30]，不滿足條件的序列則被歸為未分類。通過OTU分析可得出胃含物組成的多樣性和不同物種的相對(duì)豐度 (Relative abundance，即單個(gè)物種的序列數(shù)/總序列數(shù))。

2 結(jié)果

2.1 分類地位鑒定

肌肉樣本的分子鑒定結(jié)果顯示，除了LK-3外其余樣本與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，均是亮眶燈魚(LK-3序列相似度<97%，僅鑒定到眶燈魚屬，做舍棄處理)。

胃含物樣本共獲得長度約為313 bp的序列138 414條，剔除亮眶燈魚的自身序列、未分類序列以及豐度較低的序列后，共獲得14 533條序列。按照97%相似性聚類后得到34條OTU代表序列，注釋得到34種餌料生物 (表3)，分屬于5門7綱11目18科29屬，其中有79.41%的OTU鑒定到種水平。

表3 亮眶燈魚胃含物組成Table 3 Stomach contents of D. splendidus

2.2 胃含物組成

根據(jù)亮眶燈魚胃含物的相對(duì)豐度顯示 (圖2)，介形蟲綱占比最高 (79.12%)，其次是甲殼綱(11.28%)，其余綱占比如下：軟甲綱 4.03%、水螅綱 2.66%、輻鰭亞綱 1.94%、腹足綱 0.81%、多毛綱 0.16%。從餌料種類數(shù)量來看，輻鰭亞綱的生物種類最多，共11種，甲殼綱和介形蟲綱均為7種，軟甲綱和腹足綱均為3種，水螅綱2種，多毛綱1種。

圖2 亮眶燈魚胃含物相對(duì)豐度組成百分比 (綱水平)Fig. 2 Relative abundance proportion of stomach contents for D. splendidus (class level)

根據(jù)物種序列豐度百分比顯示 (表3)，排在前三位的種類分別是胖海浮螢 (Halocypris inflata)、茗荷屬和武裝片戎 (Vibilia armata)，合計(jì)占亮眶燈魚餌料生物相對(duì)豐度的91.1%。從種類數(shù)量上分析，魚類、橈足類和介形類是亮眶燈魚重要的食物組成，分別有11、7和7種，占總數(shù)量的82.35%。此外還檢測到3種翼足類：Clio pyramidata、Diacria major和駝龜螺；2種水母類：棍手水母屬(Rhopalonemasp.) 和Botrynemasp.；1 種磷蝦類：擬遂足磷蝦(Thysanopoda aequalis)；1種十足類：莫氏硬殼寄居蟹 (Calcinus morgani)；1 種多毛類：葉須蟲屬 (Phyllodocesp. 11BIOAK-1 631)。

3 討論

3.1 亮眶燈魚的食物組成特征

研究物種的食性特征，首先要確定其食物組成結(jié)構(gòu)。本次研究共鑒定出34種餌料生物，分屬于9大類群。從亮眶燈魚的食物種類組成分析，浮游甲殼動(dòng)物是其主要的攝食對(duì)象，包括橈足類、介形類、磷蝦類、端足類以及十足類，共17種，占總種類數(shù)量的50%；其中橈足類和介形類為絕對(duì)優(yōu)勢類群，共14種，種類數(shù)占41.2%。龔玉艷等[14]利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法研究金鼻眶燈魚的食性時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)食物組成中的浮游甲殼動(dòng)物占絕對(duì)優(yōu)勢，其中橈足類的種類數(shù)量最多，占總種類數(shù)量的68.38%；因此推測浮游甲殼動(dòng)物是眶燈魚屬燈籠魚的主要攝食對(duì)象。此外，僅從生物類群來看，魚類的種類數(shù)最多，共11種，占總種類數(shù)量的32.35%，因此，魚類也是亮眶燈魚的重要食物組成。根據(jù)龔玉艷等[14]的研究結(jié)果，燈籠魚捕食的魚類多為仔稚魚或燈籠魚科幼魚[14]。從亮眶燈魚的食物序列豐度分析，同樣是浮游甲殼動(dòng)物的序列豐度最高，占總序列豐度的95.5%，其中胖海浮螢所占比列最高(77.71%)，其次是茗荷屬物種 (9.83%) 和武裝片戎(3.56%)，結(jié)果表明胖海浮螢是介形類生物中的優(yōu)勢餌料生物。Clarke等[31]使用宏條形碼技術(shù)對(duì)4種裸燈魚屬燈籠魚的食性研究結(jié)果顯示，甲殼類浮游動(dòng)物的序列占總餌料生物序列的90%以上，因此推測甲殼類浮游動(dòng)物是燈籠魚的主要攝食類群。

水母是浮游動(dòng)物群落中的一類常見物種，在各大海域廣泛分布。本研究從亮眶燈魚胃含物中檢測出棍手水母屬和Botrynemasp.兩種水母。同樣，Clarke等[31]利用宏條形碼技術(shù)在后鰭裸燈魚 (Gymnoscopelus opisthopterus) 的胃含物中檢測出水母。然而，以往的食性的報(bào)道中[13-15,32]并未鑒定出水母這一食物類群，可能因?yàn)樗讣捌溆左w形態(tài)差異小且消化程度高而難以鑒別，因此被忽略或歸為不可辨認(rèn)類別。例如在解剖亮眶燈魚的胃部時(shí)發(fā)現(xiàn)其胃含物多為食糜狀態(tài)，難以用形態(tài)學(xué)方法鑒定(圖1)。而宏條形碼技術(shù)不依賴形態(tài)學(xué)特征，可利用高度降解、片段小的DNA以發(fā)掘更多物種信息[21]，因此宏條形碼技術(shù)可作為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的潛在應(yīng)用工具，運(yùn)用于燈籠魚的食性研究。

此外，本研究與利用形態(tài)學(xué)鑒定方法對(duì)南海海域燈籠魚食性組成的研究做了對(duì)比 (表4)，結(jié)果顯示共同檢測到的食物類群包括介形類、橈足類、端足類、魚類和磷蝦類，說明這5大類是南海燈籠魚的重要食物來源。另外，從檢測的餌料生物種類數(shù)量來看，兩項(xiàng)研究結(jié)果差異較大，本研究鑒定出34種餌料生物，龔玉艷等[14]鑒定出117種餌料生物 (其中包括未鑒定到種及不可辨認(rèn)種類)，可能原因如下：1) 本研究的樣本量較小 (7 尾 vs 50 尾)；2)本研究中亮眶燈魚的攝食強(qiáng)度位于1～2級(jí)間，胃含物呈食糜狀態(tài)，而龔玉艷等[14]研究中金鼻眶燈魚的攝食強(qiáng)度普遍較高 (3～4級(jí)占72%)。攝食強(qiáng)度的差異由樣本采集時(shí)間不同所致，攝食強(qiáng)度高的樣本包含更多的食物組成信息，因此能夠檢測到更多的餌料生物。同時(shí)，由于采集燈籠魚的種類、水域、季節(jié)不同，其結(jié)果也可能存在差異。

3.2 餌料的生物學(xué)特征

魚類的食性特征受到餌料生物種類及其分布的影響，浮游動(dòng)物作為亮眶燈魚的主要食物類群，其種類組成和數(shù)量分布對(duì)亮眶燈魚的攝食習(xí)性有著重要影響。龔玉艷等[33]對(duì)南海浮游動(dòng)物群落的空間分布研究結(jié)果顯示，橈足類、端足類、介形類、水母類為主要生物類群，本研究中檢測到的亮眶燈魚的主要食物類群與該研究基本一致。此外，燈籠魚具有明顯的晝夜垂直遷移習(xí)性，白天一般棲息于300～700 m水層，晚上則游至200 m以淺覓食[9,34-35]，這一特征與浮游動(dòng)物的分布密切相關(guān)[36]。浮游動(dòng)物具有明顯的垂直分層現(xiàn)象，該現(xiàn)象受其晝夜垂直遷移影響導(dǎo)致浮游動(dòng)物在水層中分布不均，使得生物的種類和豐度總體隨水深的增加而減少，即0～200 m水層生物種類最豐富，600～750 m水層最貧乏。因此推斷，捕食時(shí)隨餌料生物遷移是燈籠魚晝夜垂直遷移的原因之一。

3.3 宏條形碼技術(shù)的不足

宏條形碼技術(shù)在魚類食性研究中的應(yīng)用越來越廣泛，但也存在一些不容忽視的局限性。如無法區(qū)分魚類自身序列的具體來源、PCR擴(kuò)增偏向性等，這可能導(dǎo)致一些豐度低的食物類群無法被鑒定出來，使得獲取的食物組成信息不夠完整。

本研究所獲得的序列中亮眶燈魚自身序列占88.33%，如此高的自身序列比例很難確定具體來源，推測主要與亮眶燈魚自身DNA的干擾、同類自食行為以及同類基因碎片有關(guān)。亮眶燈魚自身DNA的干擾主要來源于胃液中，在提取胃含物總DNA時(shí)一并提取出來，后經(jīng)PCR擴(kuò)增不斷放大。關(guān)于燈籠魚的同類自食行為已有研究證實(shí)，如瓦氏眶燈魚是一種比較兇猛的肉食性中層魚，在捕食時(shí)偶爾會(huì)攝食同類[15]。金海衛(wèi)等[13]在利用形態(tài)學(xué)方法鑒定七星底燈魚的食物組成時(shí)發(fā)現(xiàn)其胃含物中有同類殘骸，因此推測亮眶燈魚同種之間也存在自食行為，從而在胃含物中檢測到同類的DNA。同類基因碎片 (如同類的皮膚碎片、黏膜、唾液和糞便等) 主要來源于亮眶燈魚棲息的水體中，這些碎片可能在亮眶燈魚進(jìn)食過程中帶到胃內(nèi)，從而被擴(kuò)增出來。目前，為了去除自身序列的干擾，最簡便且常用的方法是將測序結(jié)果中含有目標(biāo)物種本身的序列剔除[21-23]，更優(yōu)化的方法是通過設(shè)計(jì)阻斷引物以阻止自身序列的擴(kuò)增[37-38]。

魚類胃含物是包含多種生物模板的混合體，由于不同模板與引物的結(jié)合程度不同，在PCR擴(kuò)增中，其擴(kuò)增效率也不同，擴(kuò)增效率高的模板很可能會(huì)對(duì)擴(kuò)增效率低的產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致PCR受到抑制的食物類群被低估甚至無法鑒別[20]。因此，選擇合適的引物、增加實(shí)驗(yàn)重復(fù)以及測序深度，對(duì)提高物種的檢出率有很大作用[39]。

由于本研究的樣本量有限，僅作為利用宏條形碼技術(shù)對(duì)亮眶燈魚食性組成的初步探究，在今后的研究中將增加樣本量并分析不同時(shí)空分布燈籠魚的食性組成和特征。本研究結(jié)果表明宏條形碼技術(shù)作為燈籠魚食性分析的有效工具，顯示出了良好的食性鑒別潛力，尤其是難以通過形態(tài)學(xué)鑒定的魚類食性研究。