蔣佩文，李 敏，張 帥，陳作志，徐姍楠

1. 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306

2. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)可持續(xù)利用重點實驗室/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510300

3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室 (廣州)，廣東 廣州 511458

珠江河口是南海北部最重要的河口型生態(tài)系統(tǒng)，是許多經(jīng)濟魚類產(chǎn)卵、索餌和避難的場所，也是多種經(jīng)濟魚類入?；蛩莺愉в蔚耐ǖ?，漁業(yè)資源豐富且種類繁多[1-2]。近年來，隨著粵港澳大灣區(qū)經(jīng)濟的不斷發(fā)展，人類活動頻繁，漁業(yè)資源被過度開發(fā)，魚類資源量和種類多樣性呈下降趨勢[3]。為保護珠江河口魚類資源，確保其可持續(xù)利用，亟需開展魚類多樣性的評估和監(jiān)測。長期以來，魚類多樣性的研究主要是通過對傳統(tǒng)的形態(tài)學特征進行比較作為分類依據(jù)，但由于魚類的生長具有階段性，傳統(tǒng)的形態(tài)學方法對于魚卵、幼魚或形態(tài)特征被破壞的魚類鑒定難度較大，即使有完整的成年標本，但遇到形態(tài)極其相似的物種，即便經(jīng)驗豐富的分類學家也很難識別[4]。因此，快速、準確的可模式化操作用于物種鑒定的方法顯得尤為重要。

DNA條形碼技術(shù)是一種利用生物體DNA中一段保守片段對物種進行區(qū)分的分子鑒定手段，經(jīng)過近20年的實踐和發(fā)展，已形成了一套完善的研究體系，能夠快速準確地識別鑒定魚類。而在DNA條形碼技術(shù)中，DNA條形碼的選擇十分關(guān)鍵[5]。2005年，Ward[6]提出使用線粒體細胞色素氧化酶I(Cytochrome oxidase subunit I, COI) 基因 5'端約 652 bp的序列用于鑒定澳大利亞的207種魚類，表明COI基因能夠有效區(qū)分不同物種。隨后該片段由于大小適宜、進化速度適中、相對保守且檢測簡單高效等特點，已成為魚類鑒定的經(jīng)典條形碼。

近年來，DNA條形碼技術(shù)不斷發(fā)展并且與環(huán)境 DNA (Environmental DNA) 結(jié)合產(chǎn)生了新型的環(huán)境DNA宏條形碼 (Meta-barcoding) 技術(shù)，該技術(shù)由于非侵入性、無污染、檢測范圍廣以及敏感性高等特點，在魚類多樣性研究中得到廣泛使用[7-9]。環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)就是從環(huán)境樣本提取DNA、選取特定序列擴增并進行高通量測序，通過測序分析獲得大量OTU序列 (Operational taxonomic units, OTUs)，然后通過序列檢索比對來鑒定環(huán)境中存在的目標生物類群物種組成[10]。該技術(shù)最重要的兩個條件是選取一段合理的序列擴增，以及一個全面的檢索數(shù)據(jù)庫。但由于環(huán)境樣本中DNA片段小，以及高通量測序長度的限定，就需要比較短的微型條形碼。Miya等[11]開發(fā)了一套12S rDNA基因的環(huán)境DNA通用PCR引物，針對880種魚類線粒體中具有的163～185 bp超可變區(qū)域。該微型條形碼即使在只獲得少量DNA的情況時也可以很容易地擴增，而且它在物種之間也有很高的差異，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于魚類多樣性研究[12-13]。然而12S rDNA序列也并不是完美的，其長度相對于國際上通用的 DNA 條形碼長度 (552～652 bp) 仍太短，可能在某些近緣物種間無法識別或者識別錯誤[14]。例如Wang等[15]根據(jù)12S rDNA序列將中華瞻星魚 (Uranoscopus chinensis) 鑒定為日本瞻星魚(U. japonicus)。

不管是DNA條形碼技術(shù)還是環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)都十分依賴對比數(shù)據(jù)庫的準確性和全面性[6,13]。目前，魚類條形碼數(shù)據(jù)庫有NCBI (National Center for Biotechnology Information) 和 BOLD(Barcode of Life Data)，但由于上傳門檻低，數(shù)據(jù)量冗余龐大，經(jīng)常出現(xiàn)比對錯誤，制約了條形碼技術(shù)的應(yīng)用。因此，本研究選取南海典型河口珠江河口的魚類作為研究對象，基于線粒體COI和12S rDNA基因構(gòu)建珠江河口魚類條形碼數(shù)據(jù)庫，并初步探討其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及兩種DNA條形碼在珠江河口魚類物種鑒定中的適用性，以期為珠江河口魚類的群落動態(tài)監(jiān)測以及物種多樣性保護提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及形態(tài)鑒定

在珠江河口設(shè)置采樣斷面，設(shè)置依據(jù)是盡可能覆蓋整個珠江河口水域以及鹽度范圍，但由于珠江河口航道繁忙，工程建設(shè)多，以及部分海域存在建筑垃圾，所以拖網(wǎng)站位的選取受到一定限制。本研究共設(shè)置9個采樣站位 (圖1)，其站位覆蓋地區(qū)鹽度范圍為9～32.17，此外在鹽度低于9的地區(qū)設(shè)置過站位，但這些地區(qū)基本處于航道，禁止底拖網(wǎng)。樣本采集通過底拖網(wǎng)方式進行，采集時間為2020年4月、2020年9月以及2021年4月。樣本冷凍運至實驗室后，根據(jù)《中國魚類系統(tǒng)檢索》[16]進行形態(tài)學分類鑒定。隨后取背部肌肉保存于95%乙醇中，于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 珠江河口采樣站位Fig. 1 Sampling stations in Pearl River Estuary

1.2 DNA 提取與目的片段的擴增

剪取20～30 mg保存的魚類肌肉，晾干酒精，用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒 (天根，中國) 提取基因組DNA。采用Ward等[6]設(shè)計的引物對COI基因片段進行擴增，引物序列為：Fish-F1：5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'和 Fish-R1：5'-TAGACTT CTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'。采用Miya等[11]設(shè)計的引物對12S rDNA基因片段進行擴增，引物序列為：Mi-Fish-F：5'-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3'和MiFish-R：5'-CATAGTG GGGTATCTAATCCCAGTTTG-3'。使用擎科生物 Golden Star T6 Super PCR Mix (1.1×) 試劑盒，擴增體系 (總體積 25 μL) 為：Mix 預(yù)混液 22 μL，正反向引物各1 μL，DNA 模板1 μL。COI序列擴增反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃ 變性 10 s，56 ℃ 復(fù)性 30 s，72 ℃ 延伸40 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min。12S rDNA序列擴增反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性 10 s，56 ℃ 復(fù)性30 s，72 ℃ 延伸 20 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。

PCR產(chǎn)物用2% TBE瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶清晰PCR產(chǎn)物送往北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

對照往年珠江河口魚類資源調(diào)查文獻[1,17-21]，整理得到珠江河口魚類名錄，物種的有效學名以Fishbase 數(shù)據(jù)庫 (www.fishbase.org) 為準。為全面構(gòu)建珠江河口魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，未通過拖網(wǎng)采集到的魚類種類從GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 篩選并下載COI序列和12S rDNA序列，下載標準是優(yōu)先下載具有全基因組的序列。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過DNAStar軟件包中的SeqMan軟件對測得的COI與12S rDNA序列進行人工校對和拼接[22]。校正后的序列經(jīng)MitoFish、BOLD、GenBank數(shù)據(jù)庫驗證，當序列相似度大于99%時，才能定為同種，確保序列的準確性。運用MEGA-X軟件將本研究所得序列與GenBank下載序列合并，分析序列特征，計算堿基組成[23]；基于Kimura2-parameter (K2P) 雙參數(shù)模型對種間遺傳距離 (Interspecific genetic distance) 和種內(nèi)遺傳距離 (Intraspecific genetic distance) 進行計算，同時使用COI序列和12S rDNA序列根據(jù)種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離繪制遺傳距離頻數(shù)分布直方圖[24]。采用ABGD (Automatic Barcode Gap Discovery) 軟件將全部序列自動分組，相對間隙寬度值取X=0.8，其余參數(shù)全部默認[25]。使用PhyloSuit軟件中的ModelFinder程序進行核苷酸序列的模型選擇，選出最佳模型GTR+F+I+G4，然后使用PhyloSuit軟件中的MrBayes進行貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[26]。最后使用itol軟件對系統(tǒng)樹進行展示和標記[27]。站位圖的底圖來源于廣東省標準地圖服務(wù)子系統(tǒng) (http://nr.gd.gov.cn/map/bzdt/)，地圖數(shù)據(jù)下載于全國地理信息資源目錄服務(wù)系統(tǒng) (http://www.webmap.cn/main.do?method=index)，采用ArcGis10.6軟件繪制后疊加而成。

2 結(jié)果

2.1 序列庫概況

通過底拖網(wǎng)采集珠江河口魚類標本251尾，經(jīng)過實驗獲得219條COI序列和247條12S rDNA序列，共鑒定出99種魚，隸屬于6目10科41屬。然后從GenBank數(shù)據(jù)庫下載魚類165條COI序列和128條12S rDNA序列，共得到384條COI序列和 375條12S rDNA序列，隸屬于 17目 66科125 屬 172 種 [圖2，附錄 A (詳見 http://dx.doi.org/10.12131/20210210 的資源附件)]。根據(jù)往年珠江河口魚類資源調(diào)查文獻初步統(tǒng)計出珠江河口魚類188種，本研究魚類占比91%。其中一半種類為鱸形目，占絕對優(yōu)勢，其次是鰈形目和鯡形目，共占比20%。其中包括棘頭梅童魚 (Collichthys lucidus)、風鱭 (Coilia mystus)、杜氏棱鳀 (Thryssa dussumieri) 等咸淡水魚類優(yōu)勢種以及麗葉鲹(Alepes djedaba)、帶魚 (Trichiurus lepturus)、銀鯧(Pampus argenteus) 等海水魚類優(yōu)勢種，常見經(jīng)濟種如龍頭魚 (Harpadon nehereus)、花鰶 (Clupanodon thrissa)、皮氏叫姑魚 (Johnius belangerii) 等也已全部包括[27]。此外在野外收集了軟骨魚綱的2個物種，條紋斑竹鯊 (Chiloscyllium plagiosum) 和日本燕魟 (Gymnura japonica)，從 GenBank 數(shù)據(jù)庫下載了軟骨魚綱1個物種，尖頭斜齒鯊 (Scoliodon laticaudus)。

圖2 珠江河口魚類種類組成Fig. 2 Fish species composition in Pearl River Estuary

2.2 線粒體 COI和 12S rDNA 序列的序列特征

172種魚類384條COI序列經(jīng)比對對齊，獲得一致序列長度為614 bp，平均堿基交換/顛換值為1.29，堿基T、C、A、G的平均含量分別為29.17%、28.60%、24.03%、18.20%，A+T (53.20%)含量均高于G+C (46.80%)，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性，該結(jié)果與海洋魚類COI基因堿基組成特征一致[6]。172種魚類375條12S rDNA序列經(jīng)比對對齊后，長度為163～182 bp，平均堿基交換/顛換值為1.09，堿基T、C、A、G的平均含量分別為19.61%、23.97%、33.90%、22.52%，與COI序列一樣，存在A+T (53.51%) 含量顯著高于G+C(46.49%) 的現(xiàn)象。

2.3 種間與種內(nèi)遺傳距離

根據(jù)K2P遺傳距離模型計算384條COI序列結(jié)果顯示 (表1)，172個種類COI序列的種內(nèi)遺傳距離為0～1.66%，平均為0.20%；種間遺傳距離為2.16%～40.87%，平均為25.54%，種間平均遺傳距離是種內(nèi)的127.7倍。這一結(jié)果符合Hebert等[5]提出的“10倍規(guī)則”，即滿足種間平均遺傳距離值大于種內(nèi)平均遺傳距離10倍的標準可用于區(qū)分物種?；?75條12S rDNA序列，172種魚類種內(nèi)遺傳距離為0～1.79%，平均為0.12%；種間遺傳距離為0.59%～72.32%，平均為34.39%；種間平均遺傳距離是種內(nèi)的286.6倍?；贑OI序列的遺傳距離頻數(shù)分布直方圖能形成明顯的條形碼間隙，而基于12S rDNA序列的遺傳距離頻數(shù)分布直方圖不能形成明顯的條形碼間隙，說明COI序列能對珠江河口魚類物種進行區(qū)分鑒定，而12S rDNA序列在有些物種間存在區(qū)分困難的情況 (圖3)。

表1 基于COI和12S rDNA序列的種內(nèi)與種間遺傳距離Table 1 Genetic distance of intraspecies and interspecies based on mitochondrial COI and 12S rDNA sequences %

2.4 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

基于COI序列構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4，在物種較多的科中，石首魚科、鲾科、舌鰨科、帶魚科、鲹科、鯔科可各自形成科的單系支，但在鲀科、鳀科、鰕虎魚科、鯡科、狗母魚科中個別物種存在互相交叉的現(xiàn)象，與傳統(tǒng)分類存在一些分歧。在屬水平上，絕大多數(shù)同屬物種都能各自聚在一起，僅有小公魚屬 (Stolephorus)，?屬 (Terapon)和細棘鰕虎魚屬 (Acentrogobius) 3個屬的物種未能聚成獨立的小分支。軟骨魚綱的3種物種可以形成一個單系支。當種內(nèi)先驗最大遺傳距離P為1.29%時，384條DNA序列根據(jù)ABGD分析顯示有172個分類單元，與本研究物種數(shù)量一致。

圖4 基于COI序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on COI sequence

基于12S rDNA序列構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5，在物種較多的科中，帶魚科、舌鰨科、鳀科、鲾科、鯔科、鲀科可各自形成單系支，但在狗母魚科、鰕虎魚科、石首魚科、鯡科、鲹科中聚類效果不明顯；軟骨魚綱3種物種可形成一個單系支。在屬的水平上，絕大多數(shù)同屬的物種都能各自聚在一起，僅有細棘鰕虎魚屬、舌鰨屬 (Cynoglossus)、蛇鯔屬 (Saurida) 和兔頭鲀屬 (Lagocephalus)4個屬未聚成小分支。軟骨魚綱的3種物種可以形成一個單系支。當種內(nèi)先驗最大遺傳距離P為1.29%時，375條DNA序列根據(jù)ABGD分析顯示有166個分類單元，將帶魚和南海帶魚 (T. nanhaiensis) 聚為一個分類單元，大甲鲹 (Megalaspis cordyla) 和六帶鲹 (Caranx sexfasciatus) 聚為一個分類單元，弓斑東方鲀 (Takifugu ocellatus)、星點東方鲀 (T. niphobles) 和黃鰭東方鲀 (T. xanthopterus)聚為一個分類單元，翼紅娘魚 (Lepidotrigla alata)和綠鰭魚 (Chelidonichthys kumu) 聚為一個分類單元，烏鲹 (Parastromateus niger) 和馬拉巴若鲹(Carangoides malabaricus) 聚為一個分類單元，剩余161個由單個物種組成，占比93.6%。這些結(jié)果說明COI序列能很好地劃分魚類物種，而12S rDNA序列對于少數(shù)近緣物種無法有效劃分。

圖5 基于12S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on 12S rDNA sequence

3 討論

為了使DNA條形碼技術(shù)和環(huán)境DNA宏條碼技術(shù)在珠江河口魚類多樣性的研究中得到充分和有效的應(yīng)用，本研究建立了珠江河口本地魚類的COI和12S rDNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫。而本地數(shù)據(jù)庫的有效構(gòu)建需到達到2個條件[27]：1) 數(shù)據(jù)庫所含物種基本覆蓋本地已出現(xiàn)的物種；2) 足夠的核苷酸序列特異性來區(qū)分密切相關(guān)的物種[28]。

3.1 數(shù)據(jù)庫的物種覆蓋度

本研究獲得172種魚類物種序列，占珠江河口統(tǒng)計魚類的91%。李因強[29]研究發(fā)現(xiàn)珠江河口魚類優(yōu)勢種主要為棘頭梅童魚、鳳鱭等，以及皮氏叫姑魚、麗葉鲹等一些常見經(jīng)濟種，本研究已全部包括。剩余16種魚類未在野外采集到樣本，可能是由于本研究的采集方式為底拖網(wǎng)，該方式主要采集底棲魚類，例如斑點馬鮫 (Scomberomorus guttatus)和革似鲹 (Scomberoides tol) 這種上層魚類很難捕獲[30]。另一方面，GenBank數(shù)據(jù)庫和Bold數(shù)據(jù)庫沒有詳細的數(shù)據(jù)可供下載，所以沒有進行收集。此外這些魚類在該地區(qū)基本屬于偶見種、非經(jīng)濟種，對本研究影響不大。在今后的研究中將持續(xù)不斷地完善數(shù)據(jù)庫。

3.2 COI 條形碼在珠江河口魚類物種鑒定中的適用性

目前已經(jīng)有多項關(guān)于COI條形碼在魚類鑒定的報道。2021年羅純等[31]使用COI序列研究中日沿海部分魚類DNA條形碼時，其種間與種內(nèi)平均遺傳距離比值為14.81，符合“10×”的閾值規(guī)則，可實現(xiàn)物種的高效鑒定；郜星晨和姜偉[32]在2020年使用COI序列建立三峽魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫時，其種間平均遺傳距離為種內(nèi)的9.38倍，表示COI基因可以作為三峽庫區(qū)常見魚類鑒定的有效條形碼基因。

本研究中，COI序列種間平均遺傳距離是種內(nèi)的127.7倍，也十分符合“10×”的閾值規(guī)則。與上述研究相比，遠大于其他研究中的遺傳距離比值，這可能由于不同地區(qū)魚類活動范圍不同，基因交流不同，所以遺傳距離有所差異[33-34]。還有可能就是本實驗每種魚類采樣量不足，部分種類COI僅1條，未收集到物種內(nèi)所有序列差異，導(dǎo)致種內(nèi)平均遺傳距離偏小。此外根據(jù)遺傳距離頻數(shù)分布直方圖顯示COI序列已形成明顯的條形碼間隙，同時根據(jù)ABGD正好將172種魚類分成172個分類單元，所以COI序列在本研究中具有較好的物種鑒別率，可以滿足珠江河口魚類精準識別的需求。

3.3 12S rDNA 條形碼在珠江河口魚類物種鑒定中的適用性

雖然12S rDNA序列種間平均遺傳距離是種內(nèi)的286.6倍，也十分符合“10×”的閾值規(guī)則。但是遺傳距離直方圖顯示，種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離發(fā)生了重疊，未形成明顯的條形碼間隙。此外ABGD將一些近緣物種劃分到了同一個分類單元，例如，本研究東方鲀屬的3個物種根據(jù)ABGD劃分為一個分類單元，且黃鰭東方鲀、星點東方鲀與弓斑東方鲀之間的遺傳距離介于0.59%～1.2%，在GenBank上相似度高達99%以上，只有2個堿基的差別。因為基因會發(fā)生交換和重組，所以即使同一個物種間，12S rDNA序列有時也會存在幾個堿基的差異，將導(dǎo)致該類型物種無法區(qū)分開來[35]。在Zou等[8]使用12S rDNA序列對南沙濕地的環(huán)境DNA研究中，出現(xiàn)了雙斑東方鲀 (T. bimaculatus) 和鉛點東方鲀 (T. alboplumbeus)，與本研究東方鲀屬的3個物種也僅有1～3個堿基的差異，所以很有可能會出現(xiàn)低估魚類多樣性的情況。此外在帶魚與南海帶魚兩個亞種的區(qū)分上，ABGD也將兩者劃分為一個物種，且兩者遺傳距離為1.8%，僅有3個堿基的差別，說明12S rDNA序列可能無法對亞種進行區(qū)分。在本研究172個魚類物種中，11個物種存在以上情況，占6.4%，說明12S rDNA序列還是可以用于大部分珠江河口魚類的種類鑒定。但是在今后的研究中，區(qū)分一些近緣種類需特別注意，應(yīng)當使用COI序列加以驗證，并參考當?shù)佤~類名錄，調(diào)查是否出現(xiàn)過該物種而后加以確認。

綜上所述，根據(jù)COI序列和12S rDNA序列建立的珠江河口魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫已經(jīng)達到數(shù)據(jù)庫建立的兩個條件。同時，證明了COI條形碼能很好地適用于珠江河口魚類鑒定，并且論證了線粒體12S rDNA條形碼適用于大部分珠江河口魚類的種類鑒定，但是對少數(shù)親緣關(guān)系近的物種可能難以區(qū)分，這可能會導(dǎo)致魚類多樣性的低估，在今后的研究中應(yīng)特別注意此類物種。