李紅婷，張 帥，鄒柯姝，陳作志，陳曉雷，蔣佩文，曹漪婷，李 敏,3

1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)可持續(xù)利用重點實驗室/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510300

2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室 (廣州)，廣東 廣州 511458

3. 廣東珠江口生態(tài)系統(tǒng)野外科學(xué)觀測研究站，廣東 廣州 510300

4. 上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306

5. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，廣東 廣州 510642

6. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023

環(huán)境 DNA (Environmental DNA, eDNA) 是生物體釋放 (皮膚、糞便、唾液等) 到水體、土壤、沉積物等環(huán)境中的DNA分子的總和[1]。環(huán)境DNA技術(shù)通過從環(huán)境樣本中收集、提取和擴增DNA片段，利用測序技術(shù)對生物進行定性或定量分析[2]。與傳統(tǒng)水生物種的調(diào)查方法相比，環(huán)境DNA技術(shù)僅需采集研究物種所在區(qū)域的水樣進行分析，不需要捕撈、干擾或傷害生物，是一種環(huán)境友好型的研究方法。近年來，環(huán)境DNA技術(shù)已廣泛用于水體環(huán)境中的物種檢測[3-5]、生物量評估[6-8]、食性分析[9-11]以及生物多樣性評估[12]等方面。

環(huán)境DNA技術(shù)依賴于環(huán)境樣本中的DNA片段來檢測物種的存在[13]，從環(huán)境中獲取高質(zhì)量的DNA片段是成功檢測的前提。eDNA的獲取包括環(huán)境樣本的采集、保存和提取等步驟。在實驗過程中研究人員會根據(jù)成本、取樣的便利性以及個人喜好選擇實驗方法[14-15]。不同的方法組合會對eDNA的產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生很大的影響，進而影響目標(biāo)物種的檢測率，尤其是針對稀有物種的檢測[14-16]。目前，國內(nèi)外已有關(guān)于不同區(qū)域水樣獲取的相關(guān)研究，陳治等[17]建立和優(yōu)化了舟山近海高濁度水樣的eDNA獲取方法，結(jié)果表明對于高濁度水樣的eDNA獲取，乙醇沉淀法要優(yōu)于濾膜法。黎慧等[18]利用大型水塘中的水樣對比了濾膜法和沉淀法的富集效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)濾膜法處理后的水樣獲得的eDNA 濃度更高。Deiner等[19]以湖泊和河流水為研究樣本，結(jié)果顯示兩種處理方法的捕獲效果相同。一般而言，沉淀法更適用于靜水生態(tài)系統(tǒng)中小體積水樣的富集，如養(yǎng)殖水體或其他人工水體。自然生態(tài)系統(tǒng)的物種密度相對較低，且水體環(huán)境和水質(zhì)情況更加復(fù)雜，濾膜法更利于eDNA的富集[20]。由此看來，不同水域由于環(huán)境差異，通用的方法并不一定都適用。因此，在對特定區(qū)域進行eDNA研究時，有必要篩選出適合該區(qū)域的針對性的操作方案流程，最大程度提高eDNA回收率，增加目標(biāo)物種的檢測率，從而獲得更為真實可靠的結(jié)果。

珠江河口是我國最富生產(chǎn)力的河口區(qū)域之一，是多種經(jīng)濟水生物種產(chǎn)卵、索餌和育肥的重要場所，也是多種珍稀瀕危動物的棲息地[21-22]。該區(qū)域水文、水質(zhì)及生態(tài)極為復(fù)雜，咸淡水體交換頻繁[23]，為eDNA相關(guān)研究的開展增加了難度。目前，尚無該區(qū)域關(guān)于eDNA獲取方法優(yōu)化方面的研究。因此，本研究以珠江河口咸淡水生態(tài)系統(tǒng)為研究對象，評估不同類型的濾膜、保存方法和提取試劑盒對eDNA產(chǎn)量和質(zhì)量的影響。建立適用于珠江河口咸淡水海域eDNA獲取的實驗流程，為珠江河口及相似水域環(huán)境的eDNA研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 水樣的采集

水樣于2021年3月采集于珠江河口西部的荷包島南面海域 (113°09'E, 21°49'N)，采樣點水溫23 ℃，鹽度16。用采水器采集近表層水置于塑料桶中，根據(jù)下文中的實驗方案進行過濾。過濾裝置型 (NALGENE 300-4100, 500 mL)。抽濾泵型 (津騰GM-0.5 A)，抽氣速度為 30 L·min?1，電機功率為 160 W。

為了避免交叉污染，過濾裝置依次經(jīng)過次氯酸鈉 (NaClO) 浸洗、蒸餾水沖洗和水樣潤洗，同時過濾蒸餾水作為陰性對照。

1.2 不同材質(zhì)的濾膜和提取方法的比較

選取直徑47 mm、孔徑0.45 μm的玻璃纖維濾膜 (GF，Whatman，德國)、硝酸纖維濾膜 (CN，Whatman，德國)、聚碳酸酯濾膜 (PC，Millipore，愛爾蘭)、醋酸纖維濾膜 (CA，金晶，上海) 4種類型的濾膜，比較同種保存條件下不同材質(zhì)濾膜和提取試劑盒對eDNA獲取的影響。采用真空抽濾裝置過濾，每張濾膜過濾1 L水樣，每種濾膜過濾6張，并記錄過濾時間，同時過濾對應(yīng)的陰性對照，過濾完畢后分別裝入無菌凍存管中，放入液氮保存，直至進行DNA提取。使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒 (天根，北京，以下簡稱T 試劑盒) 和 DNeasy Blood and Tissue kit試劑盒(Qiagen，德國，以下簡稱Q試劑盒) 2種試劑盒提取不同類型濾膜的DNA (圖1)。每次過濾前用無菌水沖洗過濾裝置，再用待濾水樣沖洗以防止交叉污染。

圖1 4種濾膜與2種試劑盒的實驗設(shè)計方案Fig. 1 Experimental design of four kinds of filtration membranes and two kinds of kits

1.3 不同保存方法的比較

選取直徑47 mm、孔徑0.45 μm的硝酸纖維濾膜和醋酸纖維濾膜過濾水樣，比較不同保存方法對eDNA獲取的影響。每張濾膜過濾1 L水樣，每種濾膜過濾12張，同時過濾對應(yīng)的陰性對照，過濾完畢后分別裝入無菌凍存管中，依據(jù)圖2所示保存直至進行DNA提取。另外為了評估不具備現(xiàn)場過濾條件下的DNA提取效果，取10 L水樣常溫放置3 d后帶回實驗室，使用以上兩種濾膜進行過濾后，進行DNA提取。

圖2 濾膜與保存方法的不同組合Fig. 2 Different combinations of membrane and preservation methods

1.4 eDNA 提取方法的比較

使用兩種試劑盒提取不同材質(zhì)濾膜所富集的eDNA以及陰性對照組，由于試劑盒說明書中建議添加的試劑量體積較小，不能完全浸沒濾膜，不適用于濾膜上eDNA的提取，考慮到會影響提取效果，因此對個別步驟稍作修改。

T試劑盒提取方法修改內(nèi)容為：1) 加入800 μL GA 緩沖液和 80 μL 蛋白酶 K；2) 加入 500 μL GB緩沖液，后續(xù)步驟與說明書一致，最后使用100 μL TE 緩沖液進行洗脫。為提高 DNA 產(chǎn)率，將第一次離心得到的溶液再次加入吸附柱中進行二次洗脫。

Q試劑盒提取方法修改內(nèi)容為：1) 加入800 μL ATL Buffer和 80 μL 蛋白酶 K，置于 56 ℃ 恒溫水浴 2.5 h，每 30 min 旋渦振蕩 15 s；2) 加入 400 μL AL Buffer，56 ℃ 恒溫水浴 20 min，12 000 r·min?1離心 30 s，將上清液全部轉(zhuǎn)移至新的離心管中；3) 加入400 μL無水乙醇，混勻后分批將混合物轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12 000 r·min?1離心 30 s，直至過濾完所有混合物；4) 加入 500 μL AW1 Buffer，12 000 r·min?1離心 30 s；5) 加入 500 μL AW2 Buffer，12 000 r·min?1離心 3 min；6) 將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 離心管中，加入 100 μL AE Buffer以洗脫 DNA，為提高 DNA 產(chǎn)率，將第一次離心得到的溶液再次加入吸附柱中進行二次洗脫。

提取過程中均設(shè)置陰性對照，以檢測提取過程中是否存在污染情況。提取后的DNA用超微量分光光度計 (凱奧-K5600) 檢測其濃度和A260/A280值，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測降解情況，選擇提取DNA濃度高的試劑盒提取1.3中的濾膜。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，分別計算每組樣品3個重復(fù)的DNA濃度、A260/A280以及濾膜過濾時間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。為評估不同樣品eDNA獲取量的差異，運用一般線性模型對eDNA濃度數(shù)據(jù)進行差異分析，差異顯著系數(shù)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濾膜和試劑盒對 DNA 獲取的影響

4種濾膜用2種試劑盒提取的總eDNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。同種濾膜的3個重復(fù)組之間的提取效果基本相當(dāng)。由于提取樣本為環(huán)境樣本，所有eDNA的條帶都存在拖帶、模糊現(xiàn)象，說明樣本存在不同程度的降解。其中聚碳酸酯膜 (PC) 降解程度最為嚴(yán)重，降解片段長度主要集中在250 bp附近。陰性對照組經(jīng)電泳檢測均未出現(xiàn)條帶，且用超微量分光光度計檢測濃度為0。表明在水樣過濾和DNA提取過程中不存在污染。

圖3 濾膜與試劑盒組合提取的總eDNA電泳圖Fig. 3 Electrophoresis diagram of total eDNA extracted by combination of membrane and kit

根據(jù)eDNA濃度方差分析結(jié)果 (圖4)，T試劑盒提取的不同材質(zhì)濾膜的eDNA濃度無顯著性差異(P>0.05)；而Q試劑盒提取的eDNA濃度具有顯著性差異 (P<0.05)，說明不同材質(zhì)的濾膜對eDNA的獲取產(chǎn)生影響。T試劑盒提取的eDNA質(zhì)量濃度整體高于Q試劑盒，平均值分別為 (233.13±70.71)ng·μL?1(T)和 (184.22±25.33) ng·μL?1(Q)。其中，兩種試劑盒提取的醋酸膜 (CA) 的eDNA質(zhì)量濃度均最高，分別為 (293.37±63.46) ng·μL?1(T) 和(236.98±44.19) ng·μL?1(Q)。

圖4 濾膜與試劑盒組合獲得的eDNA濃度比較Fig. 4 Comparison of eDNA concentration obtained by combination of membrane and extraction kit

eDNA純度結(jié)果顯示 (圖5)，兩種試劑盒提取eDNA的A260/A280分別介于1.97～2.02 (T)和1.80～1.98 (Q)。一般認為，DNA 提取物的最佳質(zhì)量范圍是 A260/A280介于1.8～2.0，偏離該范圍的程度越高說明 DNA 提取物的質(zhì)量越低?？傮w上看，eDNA樣品的A260/A280基本位于1.8～2.0，說明所獲DNA質(zhì)量較高，僅有Q試劑盒提取的硝酸膜 (CN) 的 A260/A280 超出 2.0。

圖5 濾膜與試劑盒組合獲得的eDNA純度比較Fig. 5 Purity comparison of eDNA obtained by combination of membrane and extraction kit

綜上所述，T試劑盒提取的eDNA濃度更高，且提取物的質(zhì)量均位于最佳質(zhì)量范圍內(nèi)，因此選擇T試劑盒提取1.3中的濾膜。

2.2 不同保存方法對 DNA 獲取的影響

eDNA濃度方差分析結(jié)果顯示 (圖6)，使用不同方法保存濾膜，提取的eDNA濃度具有顯著差異(P<0.05)，醋酸膜和硝酸膜的獲取效果表現(xiàn)出高度一致性。用液氮 (LN) 保存的濾膜，提取物的質(zhì)量濃度均為最高[醋酸膜：(293.37±63.47) ng·μL?1，硝酸膜：(241.69±81.25) ng·μL?1]?！耙掖?液氮”(ETOH+LN) 和“乙醇+常溫”(ETOH+RT) 的提取物濃度相差不大，醋酸膜的質(zhì)量濃度介于 (243.09±19.57)～(266.81±10.92) ng·μL?1(圖6-a)，硝酸膜的質(zhì)量濃度介于 (226.45±17.71)～(232.13±3.52) ng·μL?1(圖6-b)。常溫 (RT) 保存濾膜后獲取的 eDNA 濃度較低，與常溫儲存水樣 (3 d+RT) 的提取效果相當(dāng)。

圖6 不同保存方法下提取的eDNA濃度比較Fig. 6 Comparison of eDNA concentrations extracted by different preservation methods

根據(jù)eDNA純度結(jié)果顯示 (圖7)，不同實驗組提取物的A260/A280介于1.78～2.05，且具有顯著性差異 (P<0.05)。其中有3個DNA提取物的A260/A280超出最佳質(zhì)量范圍。從提取物的穩(wěn)定性來看，液氮保存條件下平行樣品間的A260/A280波動較大，與其他方法相比不夠穩(wěn)定。

圖7 不同保存方法下提取的eDNA純度比較Fig. 7 Purity comparison of eDNA extracted by different preservation methods

2.3 不同濾膜的過濾時間比較

不同材質(zhì)濾膜的過濾速度存在極顯著差異(P<0.001) (圖8)。過濾 1 L 水樣時間最快的是玻璃纖維濾膜 [(1.46±0.08) min]，其次是醋酸纖維濾膜[(5.8±0.16) min]和硝酸纖維濾膜 [(6.59±0.27)min]，聚碳酸酯濾膜的過濾時間最長 [(23.84±3.71) min]。

圖8 不同濾膜過濾1 L水樣所需時間比較Fig. 8 Comparison of time used for filtration of 1 L water sample by different membranes

3 討論

eDNA技術(shù)作為一種非入侵的研究手段，越來越多地運用于海洋生態(tài)系統(tǒng)物種多樣性的研究中。然而，河口生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜多變，受洋流、潮汐、鹽度和紫外線等多種因素影響，eDNA的獲取相對于淡水系統(tǒng)更具挑戰(zhàn)。本研究以典型的河口生態(tài)系統(tǒng)(珠江河口) 為研究區(qū)域，評估了不同材質(zhì)濾膜、保存方法和提取策略對eDNA獲取的影響，確定了適用于珠江河口咸淡水海域的eDNA獲取方案。結(jié)果表明，水樣采集后立即使用醋酸纖維濾膜過濾，濾膜用液氮冷凍保存，后用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取的組合方案較適用于珠江河口的水樣研究。

3.1 不同試劑盒對珠江河口 eDNA 提取效果的影響

在eDNA的提取中，目前國外使用頻率最高的試劑盒主要有 DNeasy Blood and Tissue Kit與 Power Water DNA Isolation Kit。絕大多數(shù)學(xué)者認為利用DNeasy Blood and Tissue Kit提取 eDNA 的效果較好且性價比較高[20]。但另一項研究結(jié)果顯示Power Soil試劑盒在6種試劑盒中的提取效率最高，且不存在PCR抑制[16]。由于同一試劑盒在不同目標(biāo)種的研究中具有不同效果[19]，因此需要針對特定研究對象篩選出適合的提取方法。本研究從經(jīng)濟實用的角度出發(fā)，選用一種進口試劑盒 (Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit)，以及一種提取海洋動物組織常用的國產(chǎn)試劑盒 (天根海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒) 進行評估。結(jié)果顯示，在eDNA提取物質(zhì)量相當(dāng)?shù)那闆r下，海洋動物組織基因組 DNA 提取試劑盒比 DNeasy Blood and Tissue Kit能獲得更高的eDNA濃度，高濃度的提取物可能包含更多的物種信息，有利于后續(xù)開展有關(guān)生物多樣性方面的研究。

此外，評價一種提取方法是否有效，除了能夠獲得較高的DNA產(chǎn)量外，最大化的去除PCR抑制劑也是考慮的重要因素[16]。從水生生態(tài)系統(tǒng)采集的eDNA水樣中含有大量的腐殖質(zhì)和其他物質(zhì)，腐殖質(zhì)和酚類化合物是常見的PCR抑制劑，會對PCR過程產(chǎn)生抑制，從而減少PCR產(chǎn)物并影響檢測率[24]。但通常包含去除抑制劑步驟的試劑盒的產(chǎn)率相對較低?？赏ㄟ^改變反應(yīng)混合物體系配比、使用DNA純化試劑盒、稀釋或添加PCR輔助劑等方式緩解PCR 抑制作用[16]。

3.2 濾膜材質(zhì)對 eDNA 提取結(jié)果影響

研究表明濾膜法在富集自然生態(tài)系統(tǒng)中的eDNA時比離心法和過濾法更有效[16,19,25]，且有利于樣品保存，能夠有效防止DNA的降解，獲得更高濃度的 DNA[20]。故本研究僅選擇了濾膜法進行步驟優(yōu)化和對比。目前，用于富集eDNA的濾膜種類較多[26]，影響選擇的主要因素是濾膜的富集量和過濾效率[16]。Eichmiller等[16]采集養(yǎng)殖水箱中的水樣研究不同濾膜對eDNA產(chǎn)量和濃度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玻璃纖維膜的性能優(yōu)于聚碳酸酯膜。Liang和 Keeley[27]利用地表水樣測試了濾膜類型和孔徑對DNA回收的影響，結(jié)果顯示與聚醚砜膜(PES)、聚偏氟乙烯膜 (PVDF) 相比，聚碳酸酯膜的eDNA產(chǎn)量最低，混合纖維濾膜(MCE)的產(chǎn)量最高。本研究選取常用的4種濾膜進行效果評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醋酸纖維膜獲取的eDNA濃度最高，聚碳酸酯膜的濃度最低。從過濾效率來看，玻璃纖維膜的過濾速度最快，聚碳酸酯膜最慢。過濾速度主要與濾膜材質(zhì)、孔徑以及水樣的渾濁度有關(guān)。在某些環(huán)境中，流速快的濾膜可以顯著減少過濾時間和相關(guān)的勞動力成本，此外，長時間的過濾還可能導(dǎo)致eDNA在過濾過程中發(fā)生降解，尤其是高濁度的水樣 (如長江水樣[28])。需要注意的是，濾膜的流速太快或太慢，最終獲得的DNA總量都不理想。

3.3 不同濾膜保存方法對eDNA提取效果的影響

eDNA在水中很容易降解[29]，水樣采集后及時過濾并選擇合適的保存方法對最大化的回收eDNA至關(guān)重要[30]。常用的保存方法一般分為乙醇保存和冷凍保存[2]。本研究選擇4種保存方式進行評估(圖2)，結(jié)果顯示不添加任何試劑，僅在室溫條件下儲存的濾膜獲取的eDNA濃度較低。但添加乙醇固定后再置于室溫條件下獲得的DNA濃度明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)利用乙醇[31-33]或Longmire溶液[25,34]可以成功地將濾膜在室溫下進行儲存，在乙醇中儲存6 d的濾膜所獲取的eDNA拷貝數(shù)未顯著減少[35]。因此，在野外沒有冷藏條件時，可以選擇添加乙醇室溫保存濾膜。但需要注意的是，添加乙醇后會出現(xiàn)富集物滲漏的現(xiàn)象，后續(xù)去除乙醇的過程較繁瑣，容易造成交叉污染，并且乙醇會對DNA提取過程產(chǎn)生影響[36]。

此外，本研究比較了水樣采集后置于室溫條件下3 d的提取效果，從提取濃度和質(zhì)量來看均不理想，因此不推薦這種方法，在采樣點立即過濾更有優(yōu)勢。由于eDNA會隨時間呈指數(shù)級降解[37-38]，為了獲取更多、更長的DNA片段，要盡可能縮短水樣采集與過濾之間的時間。無法現(xiàn)場過濾時，可選擇將水樣冷凍保存，但要避免反復(fù)凍融，否則會影響DNA的檢測[39]。

3.4 不足與展望

本研究為珠江口咸淡水生態(tài)系統(tǒng)eDNA水樣的過濾、保存和提取方法提供了參考?？紤]到珠江河口具有明顯的旱、雨季之分，水體鹽度會根據(jù)徑流量而變化，不同區(qū)域的鹽度也會有所不同，后續(xù)研究應(yīng)擴大采樣范圍，明確實驗策略是否適用于鹽度差異較大區(qū)域的水樣研究。有研究表明濾膜孔徑會影響eDNA的回收效率[19]，本研究僅選擇了文獻中使用最多的濾膜孔徑進行比較，后續(xù)實驗將繼續(xù)探究不同孔徑濾膜的富集效果。由于DNA的提取不一定能夠在水樣過濾后立即開展，因此濾膜的長期保存方法對eDNA提取的影響也是一個值得進一步探討的問題。尤其是在物種密度本身較低的情況下，保存方法不當(dāng)將造成樣品中eDNA降解而無法檢測到目標(biāo)物種。另外，本研究對于不同方法的結(jié)果評價標(biāo)準(zhǔn)較為單一，后期應(yīng)與具體的研究目的相結(jié)合，以便更加全面地評估不同方法的實際效果。