劉廣鑫，董晏君，趙麗娟，鄧益琴，程長洪，馬紅玲，江建軍，馮 娟，郭志勛，林 蠡

1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

2. 肇慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，廣東 肇慶 526040

3. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院/廣東省水環(huán)境與水產(chǎn)品安全工程技術(shù)研究中心/廣州市水產(chǎn)病害與水禽養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225

高密度的養(yǎng)殖模式中，池塘中殘余的飼料蛋白和水生動(dòng)物的排泄物等均含有大量的含氮化合物。這些累積的含氮化合物在養(yǎng)殖水體中被慢慢分解，并產(chǎn)生氨基酸，氨基酸再被微生物脫氨產(chǎn)生氨氮，最終養(yǎng)殖水體的氮源會(huì)以分子氨 (NH3-N)、離子銨、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、氮?dú)?(N2) 及有機(jī)氮化物 (R-NH2) 的形式以動(dòng)態(tài)平衡的方式存在[1-3]。而NH3和之間可相互轉(zhuǎn)化：，當(dāng)水體 pH值和溫度升高時(shí)，水體中NH3的比例增加。NH3和對(duì)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物組織、器官有直接毒害作用，是造成機(jī)體免疫力下降并導(dǎo)致疾病爆發(fā)的關(guān)鍵因素之一[4-5]。通過綠色、高效的生物方式降低水體中無機(jī)氮的濃度達(dá)到水質(zhì)凈化的目的，是提高水生動(dòng)物成活率的主要方法之一。

芽孢桿菌 (Bacillusspp.) 作為異養(yǎng)微生物，是一種廣泛存在于自然界中，并能夠高效利用無機(jī)氮實(shí)現(xiàn)自身生長、增殖的革蘭氏陽性菌，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中研究最多、應(yīng)用最廣泛的菌種之一[6]。隨著研究的深入，芽孢桿菌同化無機(jī)氮的代謝途徑逐漸被挖掘，同化代謝過程中涉及的多種特異性功能蛋白的作用被發(fā)現(xiàn)，例如特異性感應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氧化還原蛋白、同化蛋白等，但其作用機(jī)理尚不清晰[7]。

全基因組測(cè)序 (Complete genome sequence) 是指將生物的基因組進(jìn)行隨機(jī)打斷、測(cè)序和拼接，從而獲得完整基因組序列的技術(shù)，通過序列分析和功能基因注釋 (包括NR、KEGG、eggNOG、GO和CARD等)，以便從基因水平深入了解菌株表型的機(jī)理[8-9]。目前，隨著生物技術(shù)和信息學(xué)的有機(jī)結(jié)合，全基因組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一種高效、準(zhǔn)確的信息獲得手段，在生物研究領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，例如腸道菌群分析、微生態(tài)群系組成、特異性表型分析、功能基因的預(yù)測(cè)及核心基因的挖掘等[10-13]。

利用芽孢桿菌降低水體中無機(jī)氮的濃度具有綠色、持續(xù)、無二次污染等特點(diǎn)，被學(xué)者和養(yǎng)殖戶普遍認(rèn)可[14]。盡管芽孢桿菌同化無機(jī)氮的效果得到了很好驗(yàn)證，但其代謝途徑和特異性功能蛋白等仍有待深入解析和驗(yàn)證。貝萊斯芽孢桿菌 (B. velezensis) LG37篩選于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地養(yǎng)殖池塘中，前期研究發(fā)現(xiàn)LG37可通過無機(jī)氮作為唯一氮源的最小培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并具有高效同化無機(jī)氮的能力[7]?；诖耍狙芯拷Y(jié)合三代PacBio RS II和二代 Illumina HiSeq 2000測(cè)序技術(shù)，對(duì) LG37進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，并對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行NR、KEGG、eggNOG、GO、CARD數(shù)據(jù)庫注釋、分析，旨在深入揭示LG37在無機(jī)氮代謝過程中的關(guān)鍵功能基因和代謝通路信息，為其在無機(jī)氮代謝研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考信息和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

貝萊斯芽孢桿菌LG37為實(shí)驗(yàn)室于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中篩選獲得。

1.1.2 相關(guān)試劑和儀器設(shè)備

LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基；細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒，天根生化科技 (北京) 有限公司。Pac-Bio RS II (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LG37 基因組 DNA 提取

利用LB固體培養(yǎng)基對(duì)LG37進(jìn)行活化培養(yǎng)，挑取長勢(shì)良好的單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，通過離心的方式對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行集菌及DNA提取，DNA 提取的具體操作流程根據(jù)天根生化試劑盒說明書進(jìn)行。利用NanoDrop 2000/2000c (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) 對(duì)提取、純化的LG37基因組質(zhì)量進(jìn)行分析。其DNA(OD260/280) 值在 1.8～2.0，質(zhì)量濃度≥20 ng·μL?1可用于后續(xù)的建庫測(cè)序。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將擴(kuò)增獲得的 LG37 16S rDNA 序列與 NCBI中的芽孢桿菌16S rDNA序列運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析。應(yīng)用MEGA 6.0軟件對(duì)LG37和下載的16S rDNA進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。其中序列比對(duì)采用Clustal W 多重比較法進(jìn)行，基于鄰接法 (Neighbor-joining) 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定菌株的進(jìn)化分類[15]。

1.2.3 文庫構(gòu)建和庫檢

采用三代 PacBio RS II結(jié)合二代 Illumina HiSeq 2000測(cè)序的方法對(duì)LG37進(jìn)行全基因組測(cè)序，其完成單位為上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司[16]。經(jīng)質(zhì)檢合格的 DNA 樣品采用 PacBio RS II single-molecule real-time (SMRT) 測(cè)序技術(shù) (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA) 對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序。然后通過分級(jí)基因組裝配(The hierarchical genome-assembly process, HGAP) 對(duì)隨機(jī)打斷的測(cè)序讀段進(jìn)行裝配，以期獲得超長的測(cè)序讀段。接下來使用二代測(cè)序技術(shù)Illumina HiSeq 2000進(jìn)行測(cè)序[17]，并利用 Bowtie2 (v2.3.0) 將 Illumina 基因片段與組裝的SMRT-contigs進(jìn)行比對(duì)[18]，從而獲得完整的環(huán)狀全基因組序列信息。用Glimmer 3.02進(jìn)行基因預(yù)測(cè)和注釋[19]，用tRNAscan-SE進(jìn)行tRNA genes的預(yù)測(cè)和篩選[20]，用RNAmmer進(jìn)行rRNA 的預(yù)測(cè)分析[21]。

1.2.4 本地 Blast+功能基因比對(duì)

通過NCBI下載本地Blast+，即“基本局部對(duì)比搜索工具”(Basic Local Alignment Search Tool, https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/)。首先對(duì)于基因組測(cè)序獲得的蛋白注釋信息進(jìn)行模型建庫，然后將NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和 UniProt (https://www.uniprot.org/) 數(shù)據(jù)庫相關(guān)信息進(jìn)行下載、比對(duì)、篩選和分析，獲得無機(jī)氮代謝相關(guān)候選基因，并注釋其GO分子功能[22]。

2 結(jié)果

2.1 LG37 基因組組裝

通過三代 PacBio RS II結(jié)合二代 Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)LG37 進(jìn)行全基因組測(cè)序分析(表1)。97 382 個(gè)平均長度 3 016 nt的測(cè)序讀段被最終拼裝成一條重疊基因組序列，長度為3 949 250 bp。通過測(cè)序比對(duì)分析，最終獲得一條 3 929 697 bp的環(huán)狀染色體基因組，GC含量為46.5%，總基因數(shù)3 967 個(gè) (圖1)。其中蛋白編碼基因 3 854 個(gè)，編碼區(qū)域長度為 3 495 864 bp，占總長度的 89.0%，GC含量為47.3%。RNA 基因113個(gè)，其中tRNA基因86個(gè)，rRNA基因27個(gè)?；蜷g隔區(qū)域長度433 833 bp，占總長度的11.0%。該LG37菌株無載體。

表1 貝萊斯芽孢桿菌LG37 基因組特性Table 1 Genome features of B. velezensis LG37 strain

圖1 LG37 環(huán)狀基因組圖譜Fig. 1 Circular genome map of B. velezensis LG37 strain

2.2 LG37 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

經(jīng)全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，其16S rDNA基因序列長度為 1 445 bp。通過 NCBI→Blast→Nucleotide Blast在線分析軟件比對(duì)數(shù)據(jù)庫中已收錄的16S ribosomal RNA sequences，并結(jié)合基因組測(cè)序數(shù)據(jù)匹配分析。結(jié)果表明，篩選的芽孢桿菌菌株為水源貝萊斯芽孢桿菌 (B. velezensis)，菌株命名為LG37。將LG37菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)化關(guān)系較近的芽孢桿菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，并通過MEGA 6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖2)。發(fā)現(xiàn) LG37 與B. velezensisFZB42 親緣關(guān)系最近，16S rDNA序列相識(shí)度高達(dá)100%。

圖2 貝萊斯芽孢桿菌基于16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Neighbor-joining tree of B. velezensis LG37 based on 16S rDNA sequences

2.3 LG37 基因功能注釋

對(duì)全基因組測(cè)序獲得的蛋白編碼基因，通過搜尋 NCBI的 nr庫、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome) 蛋白數(shù)據(jù)庫以及 SEED 蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋分析，利用CDD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 COG (Clusters of Orthologous Groups) 分類，并通過KEGG數(shù)據(jù)庫構(gòu)建代謝通路。全基因組測(cè)序共獲得3 854個(gè)蛋白編碼基因，具有明確生物學(xué)功能的蛋白編碼基因3 057個(gè)，具有KEGG的ortho-log蛋白編碼基因2 108個(gè)，具有COG分類的蛋白編碼基因2 890個(gè)。所有蛋白匹配的同源蛋白來源于 75 個(gè)物種，其中B. velezensisFZB42 比例最高(78.4%)。

2.3.1 COG 功能分類

LG37完整基因組的蛋白編碼基因的氨基酸序列數(shù)據(jù)與測(cè)序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配獲得蛋白序列注釋，并根據(jù)功能進(jìn)行COG class聚合分析。COG分類的蛋白編碼基因共2 890個(gè)，排名前3的分別為：General function prediction only 324個(gè)，Cell motility and secretion 312 個(gè)，Coenzyme metabolism 283 個(gè)，共占比 31.8% (圖3)。

圖3 COG功能分類Fig. 3 COG classification

2.3.2 KEGG 代謝通路分析

LG37全基因組測(cè)序獲得的氨基酸數(shù)據(jù)經(jīng)過蛋白注釋后，與KEGG數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，將目的基因注釋蛋白與想匹配的蛋白功能注釋信息相結(jié)合，獲得目的基因的翻譯蛋白信息。具有KEGG的ortholog蛋白編碼基因2 108個(gè)，共匹配到160個(gè)KEGG代謝通路中。其中排名前6的KEGG通路匹配基因數(shù)分別為：碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism) 和氨基酸代謝 (Amino acid metabolism) 各 157 個(gè)，膜轉(zhuǎn)運(yùn) (Membrane transport) 104個(gè)，輔酶因子和維生素的代謝(Metabolism of cofactors and vitamins) 93 個(gè)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) (Single transduction) 90 個(gè)，核苷酸代謝 (Nucleotide metabolism) 82 個(gè)，共計(jì) 683 個(gè)，占總數(shù)的32.4%。其中涉及到氮代謝相關(guān)的KEGG通路主要集中在GO的Cell Metabolism中，包括：氨基酸代謝，核苷酸代謝，輔酶因子和維生素的代謝，能量代謝 (Energy metabolism)，其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成 (Biosynthesis of other secondary metabolites and amino acid metabolism)，詳見圖4。

圖4 LG37基因功能注釋KEGG代謝通路Fig. 4 Gene KEGG pathway classification map of LG37

LG37同化無機(jī)氮的主要代謝通路為氮代謝(ko00910)，通過基因組測(cè)序分析，共篩選得到18個(gè)基因被匹配至氮代謝通路中 (表2)。其中涉及的Pathway ID及匹配的通路基因分別參考 https://www.genome.jp/pathway/map00910和圖5。

表2 LG37 基因組氮代謝通路及其相關(guān)基因Table 2 Related genes of nitrogen metabolism pathways of LG37

圖5 氮代謝通路(ko00910)Fig. 5 Nitrogen metabolism (ko00910)

2.4 無機(jī)氮代謝相關(guān)候選基因的篩選

測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，共有18個(gè)基因涉及到氨氮代謝通路中。然后利用本地Blast+將測(cè)序獲得的全基因組信息與NCBI和UniProt數(shù)據(jù)庫中無機(jī)氮代謝相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，額外篩選出無機(jī)氮代謝候選基因76個(gè)。其中共篩選出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因7個(gè)，氧化還原蛋白編碼基因13個(gè)，調(diào)節(jié)蛋白編碼基因5個(gè)，結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子編碼基因8個(gè)，同化蛋白編碼基因6個(gè)及其他無機(jī)氮代謝相關(guān)基因 (表3)。

表3 無機(jī)氮代謝候選基因Table 3 Candidate genes of inorganic nitrogen metabolism

續(xù)表3 Ａto be continued

3 討論

近年，隨著高密度養(yǎng)殖等模式的逐步完善，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖單位面積產(chǎn)量呈逐年上升趨勢(shì)，但高產(chǎn)出的同時(shí)也伴隨著飼料營養(yǎng)的大量投入，其每天產(chǎn)生氨氮的量可根據(jù)公式初步計(jì)算[23-25]：Q=F×R×0.144 [Q為氨氮產(chǎn)生的總量；F為配合飼料投喂總量 (kg·d?1)；R為飼料中蛋白質(zhì)所占比例；式中蛋白氮含量約16%，0.144是指90%的被經(jīng)濟(jì)動(dòng)物吸收的氮作為氨和尿素氮排出 ]。養(yǎng)殖水體中由于4種無機(jī)氮之間可相互轉(zhuǎn)化，且因水體中多種理化指標(biāo)及微生物等多重作用因素而處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，因此，雖然水體中NH3和對(duì)水生動(dòng)物有毒害作用，但不能僅降低NH3和的濃度，而應(yīng)在降低NH3或濃度的同時(shí)改良水體中的微生物菌落組成和水體中總無機(jī)氮含量[2-3]，實(shí)現(xiàn)降低無機(jī)氮濃度的目的。

貝萊斯芽孢桿菌不僅可降低無機(jī)氮的濃度，而且對(duì)養(yǎng)殖水體中病原微生物的生長、繁殖起到很好的抑制效果。雷陽等[26]在對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中篩選獲得一株可高效同化氨氮的芽孢桿菌，后經(jīng)鑒定并命名為貝萊斯芽孢桿菌FS017。Zhu等[27]篩選獲得一株貝萊斯芽孢桿菌CPA1-1，可以很好地降低養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝態(tài)氮的濃度。同時(shí)，貝萊斯芽孢桿菌可對(duì)副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)、哈維氏弧菌 (V. harveyi)、嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila) 等常見水生動(dòng)物病原菌起到很好的抑制效果[28]。表明貝萊斯芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值，因此對(duì)其無機(jī)氮同化機(jī)理進(jìn)行研究非常必要。

為從基因水平探討貝萊斯芽孢桿菌同化無機(jī)氮的機(jī)理，本研究對(duì)LG37的基因組進(jìn)行了測(cè)序分析。結(jié)果顯示，該菌株基因組序列全長 3 929 697 bp，經(jīng)過基因功能注釋，共有3 057個(gè)蛋白具有明確的生物學(xué)功能，所有蛋白匹配的同源蛋白來源于75個(gè)物種，其中貝萊斯芽孢桿菌FZB42比例最高(78.4%)[29]。通過基因注釋和本地Blast+的篩選、分析，3 057個(gè)功能蛋白編碼基因中，與NCBI和UniProt數(shù)據(jù)庫中記錄的無機(jī)氮代謝相關(guān)基因相匹配的共有94個(gè)，約占功能基因的3.1%。其中涉及多種特異性無機(jī)氮同化功能蛋白的編碼基因，包括感應(yīng)蛋白 (GlnK)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MnrA、NarT和NrgA)、氧化還原蛋白 (NasABD、NarIGHK)等相應(yīng)編碼基因[7]，其通路下游涉及的同化蛋白和調(diào)節(jié)蛋白等不僅參與無機(jī)氮的同化代謝，同時(shí)也參與有機(jī)氮的同化代謝。本結(jié)果表明LG37同化無機(jī)氮的代謝途徑與有機(jī)氮的代謝途徑之間，僅在通路上游的感應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原至氨的相關(guān)節(jié)點(diǎn)的功能蛋白上具有特異性，而對(duì)氨下游涉及的氮化合物合成代謝相關(guān)途徑中，不論氮源是無機(jī)氮還是有機(jī)氮，其代謝途徑均一致，涉及的蛋白的功能和作用也一致。

氮元素在微生物新陳代謝過程中必不可少[30]，進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境因子的變化和氮源的多樣性，微生物對(duì)氮元素的同化代謝已逐漸發(fā)展成為多元、互補(bǔ)、交叉及全局性的補(bǔ)償性代謝網(wǎng)絡(luò)途徑，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同種類氮源的利用[31-33]。微生物在代謝過程中涉及的相關(guān)功能蛋白，其在基因組上的編碼基因或基因簇往往處于相臨或相近的位置[34-35]，以此提高微生物的代謝效率，實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的高效利用，同時(shí)降低自身的能量損耗[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn)，orf00316—orf00630和orf03597—orf03963兩個(gè)區(qū)段基因翻譯的蛋白功能主要涉及無機(jī)氮的轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化還原，并最終生成NH3或說明該區(qū)段內(nèi)的基因翻譯蛋白主要行使的功能是微生物對(duì)環(huán)境中無機(jī)氮的感知、轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原、吸收同化等；而篩選的其他基因翻譯的蛋白在無機(jī)氮或有機(jī)氮的代謝途徑中均行使相應(yīng)的功能。

綜上，貝萊斯芽孢桿菌LG37基因組序列的解析為深入研究其同化無機(jī)氮的關(guān)鍵功能基因提供了參考依據(jù)，為進(jìn)一步研究其無機(jī)氮的代謝途徑提供了理論數(shù)據(jù)。后續(xù)將聚焦于orf00316—orf00630和orf03593—orf03963基因區(qū)段的研究，即LG37感知、轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原等無機(jī)氮同化途徑。