王煒，蔣雪松，張岱，呂瑩

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所，北京 100176）

結(jié)核分枝桿菌引起的感染性疾病仍然是全球關(guān)注的焦點(diǎn)。開發(fā)新型抗結(jié)核藥物也愈加迫切[1]。目前研究已經(jīng)在部分領(lǐng)域獲得成果，如ATP 轉(zhuǎn)運(yùn)通道[2]及氨酰tRNA 合成酶（aminoacyl-tRNA synthe‐tase,aaRS）[3]抑制劑領(lǐng)域。由于aaRS 在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，抑制這個(gè)酶家族的成員可導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成終止，達(dá)到抗菌和抗寄生蟲的目的[4-7]，抑制tRNA 氨酰化是一種有效的抗結(jié)核分枝桿菌策略[8]。甲硫氨酰tRNA 合成酶（methionyltRNA synthetase,MetRS）與其他aaRS最大的區(qū)別是不同物種的MetRS 顯示了結(jié)構(gòu)的多樣性[9]，適合特異性抑制劑的篩選，已被證明是理想的抗生素作用靶點(diǎn)。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（computer-aided drug design,CADD）是目前臨床前藥物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)關(guān)鍵方法[10-11]。獲得結(jié)核分枝桿菌MetRS（Mycobacterium tuberculosisMethionyl-tRNA synthetase,MtMetRS）的晶體可以加快MtMetRS抑制劑的篩選。在本研究中探索無(wú)配體MtMetRS 的結(jié)晶條件和方法，旨在為基于MtMetRS結(jié)構(gòu)的抑制劑篩選提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pQE60 質(zhì)粒、M15 大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)室保存。高保真DNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切、T4 DNA 連接酶、DNA marker購(gòu)自Takara公司。質(zhì)粒提取、凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。引物及基因合成、測(cè)序在瑞博興科完成。青霉素、鏈霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自索萊寶公司。Milipure超濾管、PEG 8000、NaCl、醋酸鈣等購(gòu)自默克公司。HisPur Ni-NTA 樹脂、蛋白質(zhì)Marker 購(gòu)自Thermo Scientific。ATP、精氨酸、寶石橙蛋白染色試劑（Sypro Orange）購(gòu)自Merck公司。Sodium cacodylate和結(jié)晶篩選試劑盒購(gòu)自Hampton Research公司。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)晶蛋白的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 登錄號(hào)CP003248.2 核酸序列，由公司合成結(jié)核分枝桿菌MetRS（MtMetRS）基因。本研究設(shè)計(jì)了4 種重組蛋白 序 列：（1）在MtMetRS 氨 基 端 加 上6×His 序 列（nHisMtMetRS）；（2）在MtMetRS 羧基端加上6×His序列（cHisMtMetRS）；（3）在MtMetRS 氨基端加上6×His 序列和thrombin 酶識(shí)別序列（MtMetRS）；（4）在MtMetRS 氨基端和羧基端分別加上6×His 序列（dMtMetRS）。圖1 為重組蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖，在MtMetRS 序列中引入thrombin 酶識(shí)別序列，在重組蛋白純化時(shí)通過(guò)thrombin 切除6×His 序列，獲得天然長(zhǎng)度的MtMetRS 蛋白。使用PCR 在MtMetRS 基因兩端引入各種結(jié)構(gòu)序列后連接入pQE60 的多克隆位點(diǎn)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。使用菌落PCR 鑒定陽(yáng)性克隆后送公司測(cè)序，確認(rèn)插入基因開放讀碼框是否正確。

圖1 重組蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic diagram of the primary structure of recombinant protein

1.2.2 重組MtMetRS的制備 pQE60-MtMetRS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化M15 大腸桿菌。挑取pQE60-MtMetRS/M15 單菌落接種到50 mL LB 培養(yǎng)基中37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。第2 天將培養(yǎng)物以1∶50 接種到4 L LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。菌液濃度為A6000.8 時(shí)加入終濃度1 mmol/L IPTG，18 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)MtMetRS 表達(dá)。誘導(dǎo)后的菌液高速離心收集菌液重懸于含有500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L PMSF 的裂解緩沖液中，超聲裂解后15000g離心45 min 去除未破碎的細(xì)菌及不溶性顆粒，可溶性部分用Ni-NTA 樹脂結(jié)合。依次使用含有100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L PMSF緩沖液洗滌樹脂，20 mL 含20 mmol/L 咪唑的相同緩沖液洗滌。無(wú)標(biāo)簽蛋白使用thrombin 酶切掉6×His 序列。含有6×His 結(jié)構(gòu)的重組蛋白使用20 mL 含300 mmol/L 咪唑的緩沖液從樹脂上洗脫結(jié)合的重組蛋白。截留相對(duì)分子質(zhì)量為30000 的超濾管濃縮洗脫液到1.5 mL。濃縮液注入?kta 層析儀中，100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0緩沖液進(jìn)行色譜分離。SDS-PAGE蛋白電泳分析蛋白純度和蛋白分子量。超濾管濃縮重組蛋白，Nanodrop 調(diào)整蛋白濃度到10 mg/mL。重組蛋白50 μL 分裝后液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 不同序列MtMetRS 活性驗(yàn)證 100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0 緩 沖 液 稀 釋SYPRO Day 到10×。將純化的不同序列的MtMetRS 重組蛋白稀釋到20 μmol/L，與5 mol/L 的ATP、甲硫氨酸按照1∶1（體積比）混合，在冰上孵育15 min，然后與10×SYPRO Day 按照1∶1（體積比）混合后冰上孵育15 min。MtMetRS 終濃度為5 μmol/L，SYPRO Day終濃度為5×Bio-Rad 的CFX 實(shí)時(shí)定量PCR 儀設(shè)置加熱程序，加熱溫度范圍10～90 ℃。從20 ℃起始，每次加熱時(shí)間為1 min，加熱后溫度升高0.5 ℃。使用CFX qPCR 儀的Cal Gold540 通道檢測(cè)SYPRO Day熒光信號(hào)。

1.2.4 晶體初步篩選 從-80 ℃冰箱取出保存的重組蛋白，于手中融化后放到冰上備用，結(jié)晶時(shí)蛋白質(zhì)濃度調(diào)整為7.5 mg/mL。采用坐滴氣相擴(kuò)散法篩選MtMetRS結(jié)晶條件。具體操作如下：在96孔結(jié)晶板的池液孔中加入80 μL 結(jié)晶液，在座滴孔中使用分配器加入0.8 μL 蛋白溶液，使用多通道移液器從池液孔中吸取0.8 μL池液加入座滴孔中。結(jié)晶蛋白與池液以1∶1 混合。加樣完的96 孔板放置20 ℃恒溫室進(jìn)行晶體生長(zhǎng)。

1.2.5 晶體優(yōu)化 蛋白質(zhì)晶體優(yōu)化與生產(chǎn)過(guò)程采用懸滴法。依據(jù)初篩結(jié)晶條件，分別調(diào)整沉淀劑濃度、緩沖液pH 值、鹽濃度，配置結(jié)晶緩沖液1 mL。蛋白點(diǎn)樣時(shí)，在池液孔中加入250 μL 結(jié)晶緩沖液。在硅化玻片上以1 μL 重組蛋白，并加入1 μL 池液，混勻后覆蓋在池液孔上，并密封好。放入20 ℃恒溫室進(jìn)行晶體生長(zhǎng)。根據(jù)晶體生長(zhǎng)情況選擇結(jié)晶條件，在新的結(jié)晶條件下加入20%Hampton Research的Additive Screen試劑進(jìn)一步進(jìn)行篩選。

1.2.6 晶體衍射實(shí)驗(yàn) 定期觀察晶體生長(zhǎng)，選擇體積較大的晶體，用針剝離片狀晶體后，使用loop 環(huán)從液滴中撈取單晶，并迅速放入液氮中冷凍。冷凍好的晶體一直在液氮中保存。數(shù)據(jù)的采集在同步輻射光源進(jìn)行。晶體采集策略為，每旋轉(zhuǎn)0.5 度采集一張衍射圖，收集360度以上的數(shù)據(jù)，直到晶體被X射線損壞。晶體被X射線損壞的特點(diǎn)是晶體的分辨率降低。使用open-source pymol 2.5 分析MtMetRS分子間的作用。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的制備

不同序列的重組蛋白純化結(jié)果如圖2所示。設(shè)計(jì)的不同序列重組蛋白均以可溶形式存在。尺寸排阻色譜的洗脫峰成高斯分布，提示重組蛋白分子均一。圖中標(biāo)準(zhǔn)品曲線的洗脫峰的相對(duì)分子質(zhì)量依次是670000、158000、44000、17000、1.35000。單6×His 序列和雙6×His 序列對(duì)獲得均一可溶的MtMetRS重組蛋白沒有影響。

圖2 使用分子篩純化不同序列的重組蛋白Figure 2 Purification of recombinant proteins with different sequences using size exclusion chromatography

2.2 不同序列蛋白活性TSA分析

為了驗(yàn)證制備的重組MtMetRS 活性，使用Thermal Shift Assay（TSA）分析重組蛋白與天然底物及類似物的結(jié)合能力，結(jié)果如圖3 所示。各種序列MtMetRS 與天然底物ATP、Met 混合后可以使重組蛋白的熱變性溫度升高3 ℃。這提示各種序列的MtMetRS均可以催化天然底物生成AMP-Met，而增加蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。在羧基端和氨基端添加的6×His氨基酸序列不影響蛋白質(zhì)的天然催化能力。

圖3 使用TSA分析重組蛋白質(zhì)的活性Figure 3 Activity of recombinant protein analyzed by TSA

2.3 不同構(gòu)建蛋白晶體初篩結(jié)果

不同構(gòu)建重組蛋白生長(zhǎng)出晶體的時(shí)間不同、結(jié)晶條件也不同。不含6×His結(jié)構(gòu)的重組蛋白沒有篩選到結(jié)晶條件。氨基端6×His 結(jié)構(gòu)的重組蛋白、羧基端6×His 結(jié)構(gòu)的重組蛋白及雙6×His 結(jié)構(gòu)的重組蛋白均篩選到結(jié)晶條件。不同構(gòu)建篩選到的晶型在100 倍鏡下的形態(tài)如圖4 所示。圖4A 顯示的為羧基端6×His 結(jié)構(gòu)的重組蛋白的晶體類型。圖4B顯示的為氨基端6×His 結(jié)構(gòu)的重組蛋白的晶體類型。單6×His 結(jié)構(gòu)的重組蛋白晶體以絨球、針狀及微晶形式存在。氨基端的6×His 結(jié)構(gòu)可以幫助MtMetRS 分子形成較好的晶型。圖4C 顯示的為兩端均標(biāo)記6×His 的MtMetRS 的晶型。雙6×His 結(jié)構(gòu)的重組蛋白篩選到結(jié)晶條件最多，可以看到有折光性晶體，外形好于其他結(jié)構(gòu)的晶體。

圖4 不同重組蛋白晶體初篩結(jié)果Figure 4 Preliminary screening results of different recombi‐nant protein crystals（100×）

2.4 蛋白晶體優(yōu)化結(jié)果

從初篩結(jié)果中挑選晶型較好的結(jié)晶條件進(jìn)行優(yōu)化。單6×His結(jié)構(gòu)的重組蛋白在優(yōu)化的結(jié)晶條件下沒有發(fā)現(xiàn)晶型的變化，雙6×His 結(jié)構(gòu)的重組蛋白優(yōu)化晶型發(fā)生明顯變化。在低濃度沉淀劑的條件下，晶體的生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，晶體的外形銳利。初次優(yōu)化后由于晶體成片簇狀，為了進(jìn)一步調(diào)整晶型本研究使用Hampton Research 公司的Additive Screen試劑進(jìn)行再次優(yōu)化，最終的優(yōu)化結(jié)果如圖5所示，晶體成片狀疊加，體積較之前增大。

圖5 優(yōu)化后的dHisMtMetRS晶體Figure 5 Optimized dHisMtMetRS crystal（400×）

2.5 晶體的衍射試驗(yàn)結(jié)果

晶體衍射實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示，衍射實(shí)驗(yàn)的光源波長(zhǎng)為1?，MtMetRS 的衍射點(diǎn)清晰，晶體的分辨率為1.95?，總共收集到900張衍射圖。該晶體屬于P1 群，每一個(gè)晶胞內(nèi)有2 個(gè)分子。使用open-source pymol展示了MtMetRS氨基端和羧基端柔性鏈在晶體內(nèi)的作用。圖7A 展示的是dHisMtMetRS 羧基末端柔性鏈在晶體的位置，黃色MtMetRS 分子的羧基端鏈為橘紅色，位于周圍綠色分子堆積形成的孔洞中，這一端鏈缺少6×His 序列的電子密度信息。圖7B 展示的是MtMetRS 分子氨基端鏈在晶體分子間的作用。黃色分子的氨基端6×His鏈搭在鄰近綠色分子的α4 與α5 螺旋上，并形成鹽橋，對(duì)固定分子起到幫助作用。

圖6 dHisMtMetRS晶體衍射圖Figure 6 Diffraction pattern of dHisMtMetRS crystal

圖7 6×His結(jié)構(gòu)在分子堆積中的作用Figure 7 Role of 6×His sequences in molecular stacking

3 討論

MtMetRS 是很好的抗結(jié)核藥物設(shè)計(jì)的靶分子。一系列病原生物的MetRS 抑制劑已經(jīng)研究出來(lái)，并顯示出良好的體外抑制效果。獲得MtMetRS 的晶體結(jié)構(gòu)是快速、準(zhǔn)確的篩選抑制物的前提，也是基于分子結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(jì)的前提。華盛頓大學(xué)經(jīng)過(guò)多年的努力突破重組蛋白的制備問題并獲得MtMetRS 與天然底物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，但最終并沒有獲得無(wú)配體MtMetRS 的晶體結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)一種借助蛋白質(zhì)兩端His 標(biāo)簽進(jìn)行結(jié)晶的方法，最終獲得MtMetRS無(wú)配體晶體。

蛋白質(zhì)結(jié)晶是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，每種蛋白質(zhì)的電荷、親疏水特性均不相同?，F(xiàn)在還沒有一個(gè)統(tǒng)一的結(jié)晶方法。通常使用商業(yè)的試劑盒篩選結(jié)晶溶液條件。但是傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶手段對(duì)獲得無(wú)配體MtMetRS結(jié)晶不起作用。沒有6×His結(jié)構(gòu)的天然MtMetRS 分子無(wú)法結(jié)晶，而含有6×His 結(jié)構(gòu)的重組蛋白均篩選到結(jié)晶條件，這一現(xiàn)象提示6×His 結(jié)構(gòu)是獲得無(wú)配體蛋白晶體的關(guān)鍵。盡管有報(bào)道6×His結(jié)構(gòu)影響蛋白質(zhì)結(jié)晶[12]，但在無(wú)配體MtMetRS 結(jié)晶過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。

通常破壞蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜，使分子在疏水作用下有序堆積，是形成晶體的主要原因。分析無(wú)配體MtMetRS 晶體晶胞內(nèi)分子之間的作用，可以看出氨基端6×His 作為柔性鏈，可以和另一分子的α4與α5結(jié)構(gòu)形成鹽橋，在2個(gè)蛋白質(zhì)分子間形成作用力。這種分子間作用力可以破壞分子表面的水化膜，從而促使分子堆積在一起形成晶體。羧基端6×His缺少電子密度圖不能明確其具體的空間位置。但從目前的電子密度圖信息提示可能與鄰近晶胞分子有相互作用。氨基端6×His重組蛋白產(chǎn)生的晶體質(zhì)量比羧基端6×His 重組蛋白好，提示氨基端6×His形成的晶胞內(nèi)作用力是產(chǎn)生晶體的主要因素，羧基端6×His 與不同晶胞分子的作用力也是結(jié)晶的必要條件。x 射線衍射實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地顯示出衍射點(diǎn)，這提示以這種方式進(jìn)行的分子堆積是有序的，不是分子間的雜亂堆積。

在蛋白質(zhì)晶體學(xué)領(lǐng)域中沒有適用于所有蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法學(xué)，每一種蛋白質(zhì)均需要尋找結(jié)晶方法。本文詳細(xì)介紹了MtMetRS 的結(jié)晶方法，為基于晶體結(jié)構(gòu)篩選、設(shè)計(jì)MtMetRS 抑制劑提供了方法及數(shù)據(jù)支持，將加快MtMetRS的研究進(jìn)程。