孫星，趙得堡，劉越，劉揚(yáng)帆，盛晶，劉麗娜，屈中玉，萬里新，李剛

（1.南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 南陽 473000；2.南陽市第二人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 南陽 473009）

乳腺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)基因的臨床分型包括多種亞型，其中多數(shù)是雌激素受體陽性患者[1]。內(nèi)分泌治療是激素依賴性乳腺癌的重要治療手段，他莫西芬（tamxifen,TAM）是一種雌激素受體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，常用于乳腺癌內(nèi)分泌治療，它可通過與雌激素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體，阻礙雌激素的生物學(xué)活性，對(duì)雌激素受體陽性乳腺癌患者具有療效，但癌細(xì)胞獲得耐藥性常導(dǎo)致治療效果欠佳，因此解決內(nèi)分泌耐藥是治療乳腺癌的關(guān)鍵[2]。蘆薈大黃素是一種提取于蘆薈的蒽醌類化合物，具有抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，降低癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[3]。此外，蘆薈大黃素通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞具有放射增敏作用[4]。表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor,EGF）與其特異性受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）結(jié)合激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)細(xì)胞增殖和分化起到重要作用。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）在正常組織中表達(dá)較低，其與EGF 受體家族的成員結(jié)合及配體形成復(fù)合物后參與細(xì)胞增殖信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。本研究以耐藥細(xì)胞MCF-7/TAM 為研究對(duì)象，探討蘆薈大黃素是否能通過EGF/EGFR/HER2 信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)MCF-7/TAM耐藥性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2 試劑和儀器

蘆薈大黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥80%）購(gòu)自南京澤朗生物科技有限公司（批號(hào)：481-72-1）；TAM購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（批號(hào)：T5648-5G）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司（批號(hào)：556507）；兔抗人HER2、EGF、p-EGFR、EGFR、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lym‐phoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司（批號(hào)分別為ab134182、ab206106、ab97613、ab52894、ab32124、ab243140）；胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司（批號(hào)：16000-044、25200-056）；山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司（批號(hào)：ab97051）；SynergyHTX 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek 公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3 建立TAM耐藥細(xì)胞株[6]（MCF-7/TAMR）

將MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%（φ）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿，更換為含1×10-6mol/L的TAM、5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d，收集細(xì)胞，將細(xì)胞在無TAM 的培養(yǎng)基中擴(kuò)增7 d，之后將細(xì)胞培養(yǎng)在含1×10-7mol/L 的TAM 培養(yǎng)液中維持其耐藥性。

MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各200 u/mL的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%（φ）CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換1 次培養(yǎng)基，細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT 法檢測(cè)MCF-7 和MCF-7/TAMR 細(xì)胞的增殖活性

離心收集MCF-7 和MCF-7/TAMR 細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以6×103個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，分別用含0、0.1、1、10、20 和50 μmol/L 的TAM 的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，之后每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A 值/對(duì)照組A 值）×100%]，求出半數(shù)抑制濃度（IC50），計(jì)算耐藥指數(shù)（RI）（RI=耐藥細(xì)胞IC50/誘導(dǎo)前細(xì)胞IC50）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞分組與培養(yǎng)

將MCF-7/TAMR 細(xì)胞用濃度為0、10、20、40 和60 mol/L 蘆薈大黃素處理細(xì)胞24 h，選擇細(xì)胞毒性較小的40 mol/L蘆薈大黃素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7/TAMR細(xì)胞分為對(duì)照組和EGF組，對(duì)照組細(xì)胞不做處理，EGF 組細(xì)胞用10 nmol/L EGF 處理24 h，蘆薈大黃素組細(xì)胞用40 mol/L 蘆薈大黃素處理24 h，蘆薈大黃素+EGF 組細(xì)胞先加入10 nmol/L EGF 處理24 h 后再加入40 mol/L 蘆薈大黃素處理24 h。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法“1.3”測(cè)定各組細(xì)胞吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%）。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

預(yù)冷PBS 清洗細(xì)胞2 次，胰蛋白酶消化，PBS 將細(xì)胞重懸，離心后加入Binding buffer 500 μL將細(xì)胞重懸，分別加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，振蕩混勻，避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 蛋白印跡法檢測(cè)各蛋白表達(dá)情況

預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次，裂解液裂解，離心取上清液，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，煮沸變性。電泳2 h，濕轉(zhuǎn)2 h，TBST 洗膜3 次，室溫封閉1 h，Bax、Bcl-2、Ki67、EGF、p-EGFR、EGFR、HER2 和GAPDH 抗體（1∶1000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，ECL 法顯色，Image J 分析灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7/TAMR耐藥細(xì)胞株建立

給予MCF-7 和MCF-7/TAMR 細(xì)胞不同濃度TAM 處理后，細(xì)胞增殖抑制率隨TAM 濃度的升高而上升，等濃度TAM 下MCF-7 細(xì)胞增殖抑制率明顯高于MCF-7/TAMR 細(xì)胞。MCF-7/TAMR 細(xì)胞的IC50為（36.29±2.04）μmol/L，高于MCF-7 細(xì)胞的IC50（11.37±1.74）μmol/L，MCF-7/TAMR 的耐藥指數(shù)為（3.76±0.27）。提示成功建立MCF-7/TAMR 細(xì)胞株。見表1。

表1 MCF-7細(xì)胞和MCF-7/TAMR細(xì)胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of the proliferation inhibition rates between MCF-7 cells and MCF-7/TAMR cells(±s,n=3)

表1 MCF-7細(xì)胞和MCF-7/TAMR細(xì)胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of the proliferation inhibition rates between MCF-7 cells and MCF-7/TAMR cells(±s,n=3)

與0.1 μmol/L組比較：*P<0.05；與1 μmol/L組比較：#P<0.05；與10 μmol/L組比較：@P<0.05；與20 μmol/L組比較：&P<0.05。

細(xì)胞類型MCF-7細(xì)胞MCF-7/TAMR細(xì)胞c(TAM)/(μmol/L-1)0--0.115.52±0.993.28±0.88139.42±1.02*9.12±0.52*1048.21±0.69#17.92±0.34#2064.10±0.88@28.64±1.20@5082.95±0.61&36.28±0.76&

2.2 不同濃度蘆薈大黃素對(duì)MCF-7/TAMR 細(xì)胞增殖活性的影響

MCF-7/TAMR 細(xì)胞存活率和Ki67 蛋白相對(duì)表達(dá)量隨蘆薈大黃素濃度的升高而降低，且具有濃度依賴性。提示蘆薈大黃素能抑制MCF-7/TAMR 細(xì)胞增殖活性。見表2，圖1。

圖1 蛋白印跡法檢測(cè)不同濃度蘆薈大黃素對(duì)Ki67 蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effects of aloe emodin on Ki67 protein expression detected by Western blot

表2 不同濃度蘆薈大黃素對(duì)細(xì)胞存活率和Ki67表達(dá)的影響Table 2 Effects of different concentrations of aloe emodin on the cell viability and Ki67 expression(±s,n=3)

表2 不同濃度蘆薈大黃素對(duì)細(xì)胞存活率和Ki67表達(dá)的影響Table 2 Effects of different concentrations of aloe emodin on the cell viability and Ki67 expression(±s,n=3)

與0 mol/L 比較：*P<0.05；與10 mol/L 比較：#P<0.05；與20 mol/L 比較：@P<0.05；與40 mol/L比較：&P<0.05。

c（蘆薈大黃素)/(mol·L-1）010204060細(xì)胞存活率/%10092.13±1.13*82.71±1.98*#70.26±1.27*#@61.50±0.75*#@&Ki671.08±0.030.99±0.02*0.75±0.02*#0.48±0.02*#@0.10±0.02*#@&

2.3 EGF對(duì)MCF-7/TAMR耐藥細(xì)胞株的影響

2.3.1 EGF 對(duì)MCF-7/TAMR 細(xì)胞增殖的影響 EGF組細(xì)胞存活率和Ki67 蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。EGF 組EGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3，圖2。

圖2 蛋白印跡法檢測(cè)Ki67和EGF蛋白表達(dá)情況Figure 2 Expression of Ki67 and EGF protein detected by Western blot

表3 EGF對(duì)細(xì)胞存活率、Ki67和EGF表達(dá)的影響Table 3 Effects of EGF on the cell viability, Ki67 and EGF expression(±s,n=3)

表3 EGF對(duì)細(xì)胞存活率、Ki67和EGF表達(dá)的影響Table 3 Effects of EGF on the cell viability, Ki67 and EGF expression(±s,n=3)

與對(duì)照組比較：*P<0.05。

組別對(duì)照組EGF組細(xì)胞存活率/%100.0097.96±1.15 Ki670.88±0.050.82±0.03 EGF 0.35±0.020.72±0.03*

2.3.2 EGF 對(duì)MCF-7/TAMR 細(xì)胞凋亡的影響 EGF組細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，EGF 和Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P<0.05），提示EGF 能抑制MCF-7/TAMR 細(xì)胞凋亡。見表4，圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況以及蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和EGFFigure 3 Detection of cell apoptosis by flow cytometry and apoptosis related proteins and EGF by Western blot

表4 EGF對(duì)細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白和EGF表達(dá)的影響Table 4 Effects of EGF on the apoptosis rate and expressionof apoptosis-related proteins and EGF(±s,n=3)

表4 EGF對(duì)細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白和EGF表達(dá)的影響Table 4 Effects of EGF on the apoptosis rate and expressionof apoptosis-related proteins and EGF(±s,n=3)

與對(duì)照組比較：*P<0.05。

組別對(duì)照組EGF組細(xì)胞凋亡率/%5.63±0.491.57±0.24*Bax 0.72±0.050.36±0.06*Bcl-20.15±0.040.70±0.04*EGF 0.10±0.030.90±0.04*

2.3.3 EGF對(duì)MCF-7/TAMR細(xì)胞中蛋白的影響 EGF組p-EGFR、HER2和EGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P<0.05），而總EGFR 蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)山M間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表5，圖4。

圖4 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中p-EGFR、EGFR、HER2 和EGF蛋白表達(dá)情況Figure 4 Expression of p-EGFR,EGFR,HER2 and EGF pro‐teins measured by Western blot

表5 EGF對(duì)p-EGFR和HER2蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Table 5 Effects of EGF on relative expression levels of p-EGFR and HER2 proteins(±s,n=3)

表5 EGF對(duì)p-EGFR和HER2蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Table 5 Effects of EGF on relative expression levels of p-EGFR and HER2 proteins(±s,n=3)

與對(duì)照組比較：*P<0.05。

組別對(duì)照組EGF組p-EGFR 0.38±0.030.59±0.03*EGFR 0.89±0.040.87±0.05 HER20.48±0.040.64±0.04*EGF 0.24±0.060.50±0.05*

2.4 EGF 逆轉(zhuǎn)蘆薈大黃素對(duì)MCF-7/TAMR 耐藥細(xì)胞株的影響

2.4.1 EGF逆轉(zhuǎn)蘆薈大黃素對(duì)MCF-7/TAMR細(xì)胞增殖活性的影響 細(xì)胞存活率、Ki67 和EGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，蘆薈大黃素組細(xì)胞存活率、Ki67和EGF蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05）；與蘆薈大黃素組比較，蘆薈大黃素+EGF組細(xì)胞存活率、Ki67和EGF蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.05）。提示EGF可降低蘆薈大黃素對(duì)細(xì)胞增殖活性的抑制作用。見表6，圖5。

表6 各組細(xì)胞存活率、Ki67和EGF蛋白表達(dá)比較Table 6 Comparison of the cell survival rate, Ki67 and EGF protein expression in each group（±s,n=3）

表6 各組細(xì)胞存活率、Ki67和EGF蛋白表達(dá)比較Table 6 Comparison of the cell survival rate, Ki67 and EGF protein expression in each group（±s,n=3）

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與蘆薈大黃素組比較：#P<0.05。

組別對(duì)照組蘆薈大黃素組蘆薈大黃素+EGF組細(xì)胞存活率/%100.0073.51±3.73*87.52±2.46*#Ki670.87±0.030.18±0.02*0.37±0.04*#EGF 0.77±0.030.10±0.04*0.23±0.02*#

圖5 蛋白印跡法檢測(cè)Ki67和EGF蛋白表達(dá)Figure 5 Expression of Ki67 and EGF protein measured by Western blot

2.4.2 EGF 逆轉(zhuǎn)蘆薈大黃素對(duì)MCF-7/TAMR 細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡率以及EGF、Bax 和Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，蘆薈大黃素組細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，EGF 和Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05）；與蘆薈大黃素組比較，蘆薈大黃素+EGF 組細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，EGF 和Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.05）。提示EGF 可降低蘆薈大黃素對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。見表7，圖6。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況及蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2和EGF蛋白表達(dá)水平Figure 6 Detection of cell apoptosis by flow cytometry and the expression of Bax,Bcl-2 and EGF proteins by Western blot

表7 各組細(xì)胞凋亡率、Bax、Bcl-2和EGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 7 Comparison of the cell apoptosis rate and relative expres‐sion of Bax,Bcl-2 and EGF proteins in each group（±s,n=3）

表7 各組細(xì)胞凋亡率、Bax、Bcl-2和EGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 7 Comparison of the cell apoptosis rate and relative expres‐sion of Bax,Bcl-2 and EGF proteins in each group（±s,n=3）

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與蘆薈大黃素組比較：#P<0.05。

組別對(duì)照組蘆薈大黃素組蘆薈大黃素+EGF組細(xì)胞凋亡率/%1.36±0.2513.46±0.46*6.94±0.45*#Bax 0.88±0.051.13±0.02*1.01±0.03*#Bcl-21.04±0.020.40±0.04*0.53±0.04*#EGF 1.12±0.030.12±0.03*0.43±0.04*#

2.4.3 EGF 逆轉(zhuǎn)蘆薈大黃素對(duì)EGF/EGFR/HER2 信號(hào)通路的影響 EGF、p-EGFR 和HER2 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，蘆薈大黃素組EGF、p-EGFR 和HER2 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05）；與蘆薈大黃素組比較，蘆薈大黃素+EGF組EGF、p-EGFR和HER2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.05）。EGFR 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示EGF可降低蘆薈大黃素對(duì)EGF/EGFR/HER2 信號(hào)通路的抑制作用。見表8，圖7。

表8 各組p-EGFR、EGFR、EGF和HER2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 8 Comparison of the relative expression of p-EGFR,EGFR,EGF and HER2 proteins in each group（±s,n=3）

表8 各組p-EGFR、EGFR、EGF和HER2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 8 Comparison of the relative expression of p-EGFR,EGFR,EGF and HER2 proteins in each group（±s,n=3）

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與蘆薈大黃素組比較：#P<0.05。

組別對(duì)照組蘆薈大黃素組蘆薈大黃素+EGF組p-EGFR 0.97±0.040.31±0.03*0.73±0.02*#EGFR 0.99±0.031.01±0.020.98±0.03 HER20.99±0.040.37±0.03*0.82±0.05*#EGF 0.87±0.030.35±0.02*0.64±0.03*#

圖7 各組細(xì)胞中各蛋白表達(dá)情況Figure 7 Protein expression in cells of each group

3 討論

內(nèi)分泌治療因其低毒性以及耐受性好等特點(diǎn)，能顯著改善激素受體陽性乳腺癌患者預(yù)后，但是長(zhǎng)期治療部分患者易出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致患者生存率降低，因此尋找癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的具體機(jī)制對(duì)于提高乳腺癌患者生存率至關(guān)重要。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞具有抑制作用，但是對(duì)其耐藥性的影響未進(jìn)行探討，因此本研究主要探討蘆薈大黃素是否能逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性及其具體機(jī)制。

近些年，蘆薈大黃素在抗腫瘤方面的作用受到廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，降低癌細(xì)胞增殖能力[7]。董錦忠等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可抑制肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。杜學(xué)峰等[9]研究表明蘆薈大黃素通過抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，從而發(fā)揮抗肝癌作用。為研究蘆薈大黃素對(duì)MCF-7 耐藥性的影響，本研究首先建立MCF-7/TAM 耐藥細(xì)胞株，通過檢測(cè)MCF-7/TAM 細(xì)胞的增殖抑制率和耐藥指數(shù)，確定成功誘導(dǎo)出MCF-7/TAM 耐藥細(xì)胞。給予MCF-7/TAM 細(xì)胞不同濃度蘆薈大黃素處理，結(jié)果顯示：隨著蘆薈大黃素濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，且具有濃度依賴性，而且Ki67 蛋白表達(dá)量隨蘆薈大黃素濃度的升高逐漸降低。結(jié)果表明，蘆薈大黃素可降低MCF-7/TAM細(xì)胞增殖活性。

腫瘤細(xì)胞通過自分泌可產(chǎn)生大量生長(zhǎng)因子，其中EGF 是促進(jìn)上皮增生的重要因子，通過與其受體EGFR 結(jié)合，活化EGFR，激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，EGF 通過激活EGFR/ROS 信號(hào)通路可增強(qiáng)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多形性細(xì)胞的侵襲潛能[10]。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)EGF 可誘導(dǎo)肝癌HepG2 細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而丹參酮降低EGF 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。Zhao 等[12]研究表明EGF 通過活化STAT3 誘導(dǎo)HIF-1 表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究用10 nmol/L EGF處理細(xì)胞，對(duì)MCF-7/TAM 細(xì)胞存活率和Ki67 蛋白表達(dá)量無顯著影響，而顯著降低細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)量升高。結(jié)果表明，EGF 可促進(jìn)MCF-7/TAM 細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。為進(jìn)一步研究蘆薈大黃素是否是通過調(diào)節(jié)EGF發(fā)揮抗癌作用，本研究先用10 nmol/L EGF 處理細(xì)胞后，再用蘆薈大黃素處理細(xì)胞，結(jié)果顯示，與蘆薈大黃素組比較，蘆薈大黃素+EGF 組細(xì)胞存活率和Ki67蛋白表達(dá)量升高，而細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)升高。結(jié)果表明，EGF 可降低蘆薈大黃素對(duì)MCF-7/TAM 細(xì)胞的促凋亡作用。

表皮生長(zhǎng)因子系統(tǒng)（EGFs）由EGF 和EGFR 組成，EGFR 家族是跨膜受體酪氨酸激酶的一種，包括EGFR、HER2、HER3 和HER44 個(gè)成員，該家族通過調(diào)控多種與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的基因從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期影響細(xì)胞增殖、遷移和分化。EGFR 存在于所有細(xì)胞表面，對(duì)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有調(diào)控作用。Dong 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR 在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)升高，circMYBL2 通過上調(diào)EGFR 可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性，降低其敏感性，促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性生物行為學(xué)。沉默非小細(xì)胞肺癌中CD44的表達(dá)可使EGFR 信號(hào)失活，從而降低癌細(xì)胞的增殖活性，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[14]。HER2 上調(diào)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡[15]。PROM2 通過激活HER2 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和增殖[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，EGF處理細(xì)胞后，p-EGFR 和HER2表達(dá)上調(diào)，蘆薈大黃素處理細(xì)胞可降低p-EGFR和HER2表達(dá)；而與蘆薈大黃素組比較，蘆薈大黃素+EGF 組p-EGFR和HER2 表達(dá)升高，結(jié)果提示蘆薈大黃素可抑制EGF/EGFR/HER2 信號(hào)通路，降低乳腺癌內(nèi)分泌耐藥性。

綜上所述，蘆薈大黃素可降低乳腺癌內(nèi)分泌耐藥性，其可能是通過抑制EGF/EGFR/HER2信號(hào)通路發(fā)揮作用，此機(jī)制為臨床治療乳腺癌提供了理論依據(jù)。