陳麗麗，廖芬芳，陳向潔，劉漫宇，王偉章

（1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦公室，廣東 廣州 510080；2.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性增殖性疾病。盡管酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用使得費(fèi)城染色體陽(yáng)性慢性髓系白血病(Ph+CML)的療效顯著改善，然而，該類靶向治療藥物仍然不能徹底治愈該疾病[1]。因此，探索和開發(fā)新型的Ph+CML 治療藥物和方法仍然十分必要。鬼臼苦素(picropodophyllin,PPP)是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥鬼臼中提取出來(lái)的活性物質(zhì)，具有安全、低毒、高效的體內(nèi)外抗腫瘤活性。以往的研究發(fā)現(xiàn)，PPP 能有效誘導(dǎo)CML 原代細(xì)胞及細(xì)胞系發(fā)生細(xì)胞凋亡，以及抑制細(xì)胞系的克隆形成[2]。最近，Liao 等[3]通過(guò)CML 小鼠模型的研究也發(fā)現(xiàn)，PPP可以通過(guò)激活p53蛋白抑制小鼠CML干細(xì)胞的增殖并顯著延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。這些結(jié)果表明PPP具有應(yīng)用于CML 臨床治療的潛力。細(xì)胞焦亡(pyroto‐sis)作為一種新的促炎程序性細(xì)胞死亡方式，與細(xì)胞凋亡在細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和發(fā)生機(jī)制上都有明顯區(qū)別，在腫瘤化療中發(fā)揮重要作用[4]。然而，迄今尚無(wú)關(guān)于PPP 對(duì)CML 細(xì)胞焦亡作用影響的研究。因此，進(jìn)一步探索PPP的作用機(jī)理將為其在CML臨床治療的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。本研究擬采用PPP 作用于Ph+CML 細(xì)胞系Ku812 和K562，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞死亡，通用Western blot檢測(cè)凋亡、焦亡和壞死性凋亡以及Bcl-2家族相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步探討PPP體外對(duì)Ph+CML細(xì)胞焦亡的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人Ph+CML細(xì)胞系K562 和Ku812均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%（φ）胎牛血清的1640 培養(yǎng)液（含10%青/鏈霉素）中，置于5%（φ）CO2的37 ℃培養(yǎng)箱。

1.1.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司，型號(hào)：FACScalibur）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad，型號(hào)：PowerPac Basic）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo，型號(hào)：3534）。

1.1.3 主要試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、青/鏈霉素混合液（雙抗）、ECL 和蛋白提取試劑盒及蛋白酶抑制劑購(gòu)自Thermofisher 公司；DMSO溶液購(gòu)自Sigma（作為溶劑，終濃度為0.1%）；Annexin V-Alexa 647（640912）/碘化丙啶（421301；Propidium Iodide，PI）購(gòu) 自Biolegend 公 司；PPP（S7668）（溶于DMSO，母液5 mmol/L）和Q-VDOPh（S7311；Quinoline-Val-Asp-Difluoro-phenoxyme‐thylketone，QVO）（溶于DMSO，母液8 mmol/L）購(gòu)自selleck 公司；GAPDH 抗體購(gòu)自Proteintech 公司；Bcl-2（#4223）、Caspase-3（#9662）、Caspase-7（#9492）、Cleaved-Caspase-9（#9505)、MLKL（#14993）和Phospho‐MLKL（S358）（#91689）、Poly（ADP-ribose）polymerase（PARP；#9542）、Bak（#12105）、MCL-1（#5453）、Bcl-2（#15071）、Bcl-xl（#2764）抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)山羊抗兔（#7074）以及羊抗小鼠IgG（#7076）均購(gòu)自CST 公司。DFNA5/GSDME（ab215191）和Noxa（ab13654）抗體購(gòu)自abcam 公司。Bax（PA5-78857）抗體購(gòu)自Thermofisher公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 以終濃度為0.5、1.0、5.0 μmol/L 的PPP 處理K562 和Ku812 細(xì)胞48 h；或者Caspase泛抑制劑QVO（8.0 μmol/L）預(yù)處理Ku812細(xì)胞2 h 后再加PPP 處理48 h。處理完成后收集細(xì)胞，冰浴1×PBS 潤(rùn)洗2 次，離心去上清，加入100 μL 1×binding buffer 重懸，再加入4 μL Alexa Flour 647 Annexin-V 試劑，混勻，室溫避光孵育10 min。再加入7 μL PI，最后加入1× binding buffer 200 μL 調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 Western blotting 分析 以終濃度為0.5 和1.0 μmol/L 的PPP 處理細(xì)胞24 h 后，收集細(xì)胞并提取總蛋白檢測(cè)以下蛋白：Caspase-3、c-Caspase-9、Caspase-7、PARP、DFNA5、MLKL 和p-MLKL。終濃度為0.5、1.0和5.0 μmol/L的PPP處理細(xì)胞不同時(shí)間（6、8、10、12、18 和24 h）后，收集細(xì)胞并提取總蛋白檢測(cè)以下蛋白：Bak、Bax、Noxa、Bcl-2、Bcl-xl 和Mcl-1。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，冰上濕轉(zhuǎn)1.5 h至PVDF膜，室溫條件下5%脫脂奶粉封閉2 h，加入含5% BSA 稀釋液稀釋的相應(yīng)抗體（1∶1000），4 ℃過(guò)夜，加入相應(yīng)的稀釋二抗（1∶5000），室溫孵育1 h。洗膜后用ECL solution顯色，最后進(jìn)行顯影，定影。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用Graph Prism8.0 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPP誘導(dǎo)Caspase依賴性的細(xì)胞死亡

在Ku812 細(xì)胞中，3 種濃度的PPP（0.5、1.0 和5.0 μmol/L）均誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生顯著的死亡（Annexin V+細(xì)胞）；在K562 細(xì)胞中，1.0 和5.0 μmol/L 的PPP誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生明顯的死亡（Annexin V+細(xì)胞），而0.5μmol/L對(duì)細(xì)胞死亡無(wú)明顯影響（圖1）。相同濃度的PPP 作用下，Ku812 細(xì)胞的死亡率顯著高于K562細(xì)胞（圖1）。Caspase泛抑制劑QVO預(yù)處理Ku812細(xì)胞后，明顯地抑制PPP誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生的死亡（圖2）。

圖1 FACS檢測(cè)PPP對(duì)Ku812和K562細(xì)胞死亡的影響Figure 1 Effect of PPP on Ku812 and K562 cell death analyzed by FACS

圖2 FACS 檢測(cè)Caspase 泛抑制劑QVO 對(duì)PPP 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的影響Figure 2 Effect of QVO on PPP-induced cell death analyzed by FACS

2.2 PPP 對(duì)凋亡、焦亡和壞死性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，不同濃度的PPP（0.5 和1.0μmol/L）處理Ku812 細(xì)胞24 h 后，凋亡相關(guān)的活化Caspase 蛋白c-Caspase-3、c-Caspase-7 及其底物c-Caspase-9 和c-PARP 蛋白水平均明顯升高，而焦亡相關(guān)蛋白DFNA5/GSDME 同樣出現(xiàn)活化的N-DFNA5/GSDME 蛋白，但壞死性凋亡蛋白MLKL發(fā)生下調(diào)，其磷酸化蛋白p-MLKL 未發(fā)生變化；K562細(xì)胞在相同劑量PPP的作用后，上述蛋白均未發(fā)生明顯的表達(dá)或活性改變（圖3）。

圖3 Western blot檢測(cè)PPP 對(duì)凋亡、焦亡和壞死性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of PPP on the expression of apoptosis，pyrotosis and necroptosis associated proteins

2.3 PPP對(duì)Bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，不同濃度的PPP（0.5、1.0 和5.0 μmol/L）處理Ku812 細(xì)胞不同時(shí)間后，促凋亡蛋白Bak 蛋白水平在處理6、10 和18 h 后發(fā)生上調(diào)，而在其他時(shí)間點(diǎn)未發(fā)生變化；促凋亡蛋白Bax和Noxa 以及抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-xl 和Bcl-2 在所有處理時(shí)間點(diǎn)均未發(fā)生明顯變化（圖4A）。在K562細(xì)胞中，不同濃度PPP處理18 h和24 h后，抗凋亡蛋白Mcl-1 蛋白水平發(fā)生下調(diào)，在其他時(shí)間點(diǎn)未發(fā)生變化；抗亡蛋白Bcl-2 在PPP 處理24 h 后發(fā)生下調(diào)，在其他時(shí)間點(diǎn)未發(fā)生變化；Bak、Bax和Noxa在所有處理時(shí)間點(diǎn)均未發(fā)生明顯變化（圖4B）。

圖4 Western blot檢測(cè)PPP對(duì)Bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of PPP on the expression of Bcl-2 family proteins assayed by Western blot

3 討論

盡管BCR-ABL 融合基因是Ph+CML 發(fā)病的根源，但CML 異質(zhì)性明顯，基因?qū)W特征復(fù)雜，TKI單藥治療仍無(wú)法治愈該疾病[5]。因此，迫切需要尋找新的治療藥物和策略。以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PPP 在體內(nèi)外均能有效誘導(dǎo)CML 細(xì)胞系及CML 干細(xì)胞凋亡，以及抑制細(xì)胞系的克隆形成。本研究發(fā)現(xiàn)PPP 能通過(guò)DFNA5 介導(dǎo)CML 細(xì)胞發(fā)生焦亡，這表明PPP能夠通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗CML作用，將為其在CML臨床治療中的應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

細(xì)胞死亡途徑多種多樣，包括細(xì)胞壞死、凋亡、壞死性凋亡、自噬、鐵死亡和細(xì)胞焦亡等，它們具有不同的形態(tài)和生化特征相關(guān)[6]。在本研究中，通過(guò)Annexin V/PI 雙染法及FACS 檢測(cè)細(xì)胞死亡的結(jié)果顯示，K562 及Ku812 細(xì)胞在PPP 作用后均出現(xiàn)明顯的Annexin V 單陽(yáng)性及Annexin V/PI 雙陽(yáng)性細(xì)胞群，這表明PPP 能夠有效誘導(dǎo)CML 細(xì)胞發(fā)生死亡。然而，Annxin V 陽(yáng)性細(xì)胞并不是細(xì)胞凋亡所特有的，細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡及焦亡等死亡時(shí)同樣會(huì)出現(xiàn)此情況。因此，進(jìn)一步通過(guò)Western blot的方法檢測(cè)與細(xì)胞凋亡、焦亡及壞死性凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及活性情況。在壞死性凋亡過(guò)程中，RIPK1、RIPK3和MLKL 是參與壞死性凋亡的主要分子。MLKL作為RIPK1 和RIPK3 下游的效應(yīng)蛋白發(fā)揮作用。MLKL 在Ser358 位點(diǎn)被活化的RIPK3 磷酸化會(huì)誘導(dǎo)MLKL 寡聚化并向質(zhì)膜轉(zhuǎn)位，并與磷脂酰肌醇相互作用，誘導(dǎo)膜通透和細(xì)胞破壞而發(fā)生壞死性凋亡[7-8]。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，K562 及Ku812細(xì)胞在PPP 作用后MLKL 磷酸化水平未發(fā)生變化，相反，其總蛋白水平在Ku812 出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，這說(shuō)明PPP 并未通過(guò)MLKL 介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)CML 細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。細(xì)胞焦亡的特征是當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，胞內(nèi)炎性小體激活Caspase 進(jìn)而切割Gasdermin（GSDM）蛋白家族導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生炎癥性死亡[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD 是細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白，該蛋白被活化的Caspaes-3 裂解產(chǎn)生NGSDMD促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡[10]。近期大量研究證明，DFNA5/GSDME同樣可以被活化的Caspase-3切割產(chǎn)生N-DFNA5/GSDME 誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，然而當(dāng)Caspase-3 被活化時(shí)，DFNA5 的表達(dá)水平則決定了細(xì)胞不同的死亡方式。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)DFNA5/GSDME高表達(dá)時(shí)，Caspase-3 切割DFNA5/GSDME 發(fā)生細(xì)胞焦亡現(xiàn)象；當(dāng)DFNA5/GSDME 低表達(dá)或者不表達(dá)時(shí)，則發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，PPP 可引起Ku812 細(xì)胞中Caspase-3 活化及N-DFNA5/GSDME 蛋白水平的提高，表明PPP 的確誘導(dǎo)CML細(xì)胞發(fā)生焦亡。同時(shí)，結(jié)果也顯示凋亡相關(guān)的Caspase-7 同樣發(fā)生活化并作用于底物PARP誘導(dǎo)其發(fā)生切割，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明，PPP在體外能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的方式殺傷CML 細(xì)胞。PPP 在體內(nèi)是否同樣具有誘導(dǎo)CML 細(xì)胞焦亡的作用有待進(jìn)一步的研究。

眾所周知，Bcl-2蛋白家族通過(guò)控制線粒體通透性進(jìn)而影響Caspase 家族蛋白活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[11]。其中，Bak 和Bax 是線粒體膜通透的主要執(zhí)行者。在受到BH3-only 蛋白激活后，Bak 和Bax 能夠形成多聚體，并引起線粒體外膜的穿孔，從而誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 等物質(zhì)的釋放，激活Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的發(fā)生[12-13]。因此，為了進(jìn)一步了解PPP是如何活化Caspase進(jìn)而切割DFNA5誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，本研究通過(guò)Western blot 的方法檢測(cè)了K562 及Ku812 細(xì)胞在PPP 作用后Bcl-2 家族蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在Ku812 細(xì)胞中只有促凋亡蛋白Bak表達(dá)發(fā)生上調(diào)，而K562細(xì)胞中的抗凋亡蛋白Mcl-1 和Bcl-2 表達(dá)發(fā)生下調(diào)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，PPP 誘導(dǎo)p53 基因野生型的結(jié)直腸癌細(xì)胞系發(fā)生凋亡主要是通過(guò)促凋亡蛋白Bad介導(dǎo)的線粒體凋亡通路[14]。由于在相同濃度的PPP 作用下，Ku812 細(xì)胞的細(xì)胞死亡比例明顯高于K562 細(xì)胞，因此，推測(cè)在PPP促發(fā)細(xì)胞死亡的過(guò)程中促凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)可能在介導(dǎo)Caspase 家族活化方面比抗凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)發(fā)揮著更為重要的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PPP 可能通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Bak 表達(dá)，進(jìn)而活化Caspase-3 并誘導(dǎo)焦亡相關(guān)蛋白DFNA5/GSDME 的切割，從而導(dǎo)致CML 細(xì)胞發(fā)生焦亡。該研究進(jìn)一步闡明了PPP 抗CML 的機(jī)理，為將PPP 開發(fā)成為治療Ph+CML 藥物提供了理論依據(jù)。