賀清輝，羅進(jìn)，杜軍，羅艷萍，王紅剛，周靜儀，楊嘉文

［1.安利（中國(guó)）研發(fā)中心有限公司，廣東 廣州 510730；2.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006］

隨著社會(huì)的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，女性健康越來(lái)越受到社會(huì)的關(guān)注。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣、血均為人體生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，為人之本源[1]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》載有“人之所有者，血與氣耳”，充分說(shuō)明了氣、血對(duì)于人體的重要性[2]。中醫(yī)學(xué)上對(duì)女性病理的研究均統(tǒng)一認(rèn)為“女子以氣為用，以血為本”的觀點(diǎn)[3]。由于腎氣漸衰，天癸將絕，沖任虧虛，氣血暗耗，故導(dǎo)致了陰陽(yáng)氣血失衡[4]，從而引發(fā)女性疾病。

人參黃精膏由人參、玉竹、黃精、枸杞、玫瑰花等5 種藥食同源原料及新食品原料丹鳳牡丹花組成。處方中的人參具有大補(bǔ)元?dú)狻⒀a(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血等功效；黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾，潤(rùn)肺，益腎；枸杞滋補(bǔ)肝腎，益精明目；玉竹養(yǎng)陰潤(rùn)燥，生津止渴；玫瑰花行氣解郁[5]；丹鳳牡丹花是2013 年國(guó)家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)的新食品原料，富含多酚、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等功能營(yíng)養(yǎng)成分[6]；全方滋陰補(bǔ)氣，補(bǔ)而不膩。人參黃精膏作為一款功能食品，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 31326《植物飲料》，包括感官、理化、污染物限量及微生物限量等指標(biāo)。但本品中的人參、玉竹、黃精、枸杞、玫瑰花、丹鳳牡丹花等富含皂苷、黃酮和多糖等活性成分，現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法體現(xiàn)配方中化學(xué)成分的多樣性和復(fù)雜性。本研究旨在建立人參、枸杞、玫瑰花、丹鳳牡丹花的薄層鑒別方法，并建立粗多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法，為提升人參黃精膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-500DE 超聲波處理器（昆明市超聲儀器有限公司）；ATS4薄層點(diǎn)樣機(jī)（瑞士卡瑪公司）；Visual‐izer 薄層呈像儀（瑞士卡瑪公司）；ME-203 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TC-15 電熱套（海寧市新華醫(yī)療器械廠）；RE-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；UV-2450 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津儀器有限公司）。

1.2 試藥

人參黃精膏（批號(hào)S2202003、S2202004、S2202005、S2202006、S2202007，廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)）；人參皂苷Rg1（110703-201832）、人參皂苷Re（110754-202028）、人參對(duì)照藥材（120917-201401B）、枸杞對(duì)照藥材（121072-201412B）、玫瑰花對(duì)照藥材（121508-201607B）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；人參皂苷Rb1（S299-D25,成都曼斯特生物科技有限公司）；丹鳳牡丹花對(duì)照藥材（DZ12012051，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為丹鳳牡丹Paeonia ostiiT.Hong et J.X.Zhang的干燥花朵）；無(wú)水葡萄糖（天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心）、苯酚（廣州化學(xué)試劑廠）、濃硫酸（廣州化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 人參薄層鑒別 參考《中國(guó)藥典》人參藥材鑒別方法，取本品約5.0 g，加三氯甲烷30 mL，加熱回流1 h，棄去三氯甲烷，殘?jiān)鼡]干溶劑，加水1.0 mL攪拌溶解，加水飽和的正丁醇20 mL，超聲處理30 min，吸取上清液，加3 倍量氨試液，搖勻，放置分層。取上層溶液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為人參黃精膏供試品溶液。另取人參對(duì)照藥材0.5 g，同法制成人參對(duì)照藥材溶液。分別取人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1 對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按人參黃精膏處方比例，去掉人參后，依法制成人參黃精膏缺人參的陰性供試品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一默克高效板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比15∶40∶22∶10）10 ℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）和日光下檢視，在供試品、對(duì)照藥材和對(duì)照品薄層色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，缺人參陰性樣品則無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 人參對(duì)照品、人參對(duì)照藥材及人參黃精膏樣品薄層色譜圖Figure 1 TLC identification of Ginseng Radix et Rhizome in Renshen Huangjing ointment samples

2.1.2 枸杞薄層鑒別[7]取本品約5.0 g，加乙酸乙酯20 mL 振搖提取，分取乙酸乙酯液，濃縮至約1 mL，作為人參黃精膏供試品溶液。另取枸杞對(duì)照藥材1.0 g，加水50 mL，煮沸15 min，濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯20 mL 振搖提取，同法制成對(duì)照藥材溶液。按人參黃精膏處方比例，去掉枸杞，依法制成人參黃精膏缺枸杞陰性供試品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（體積比6∶3∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在供試品與對(duì)照藥材薄層色譜相應(yīng)的位置上，顯相同亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，缺枸杞陰性樣品無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 枸杞對(duì)照藥材與人參黃金膏樣品薄層色譜圖Figure 2 TLC identification of Lycii Fructus in Renshen Huangjing ointment samples

2.1.3 丹鳳牡丹花薄層鑒別[8]取本品約5.0 g，加水50 mL，溶解離心，取上清液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL，溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取丹鳳牡丹花對(duì)照藥材1.0 g，加水50 mL，煮沸30 min，離心，取上清液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材溶液。按人參黃精膏處方比例，去掉丹鳳牡丹花后，依法制成人參黃精膏缺丹鳳牡丹花陰性樣品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液、對(duì)照藥材溶液各2μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（體積比5∶3∶1）溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，供試品與對(duì)照藥材色譜相同位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺丹鳳牡丹花陰性樣品則無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 丹鳳牡丹花對(duì)照藥材和人參黃精膏樣品薄層色譜圖Figure 3 TLC identification of Paeonia ostii Flos in Renshen Huangjing ointment samples

2.1.4 玫瑰花的薄層鑒別[8]取本品約2.0 g，加甲醇20 mL，超聲過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取玫瑰花對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材溶液。按人參黃精膏處方比例，去掉玫瑰花后，依法制成人參黃精膏缺玫瑰花陰性樣品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取陰性樣品溶液、對(duì)照藥材溶液、供試品溶液各5μL分別點(diǎn)于同一GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（體積比5∶5∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品與對(duì)照藥材色譜相同的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，缺玫瑰花陰性樣品則無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 玫瑰花對(duì)照藥材與人參黃金膏樣品薄層色譜圖Figure 4 TLC identification of Rosae Rugosae Flos in Renshen Huangjing ointment samples

2.2 紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定粗多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[9-10]

2.2.1 葡萄糖對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取0.100 g 葡萄糖于量瓶中，加水溶解，定容至1000 mL，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取樣品0.500 g，置于50 mL具塞離心管內(nèi)。用5 mL水浸潤(rùn)樣品，緩慢加入20 mL無(wú)水乙醇，搖勻，超聲提取30 min。提取液于4000 r/min 離心10 min，棄去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗滌、離心。用水將上述不溶物轉(zhuǎn)移入圓底燒瓶，加入50 mL 水，超聲提取30 min。冷卻，過(guò)濾，重復(fù)提取2 次。將濾液轉(zhuǎn)移至200 mL 容量瓶中，殘?jiān)礈?～3 次，洗滌液轉(zhuǎn)移至量瓶，加水定容，即得。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取葡萄糖對(duì)照品溶液、樣品溶液各1 mL 于具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，然后迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻。靜置10 min，充分混勻并于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，于400～600 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 葡萄糖對(duì)照品溶液與供試品溶液紫外可見(jiàn)光譜圖Figure 5 UV-Vis spectra of glucose solution and sample solution

可見(jiàn)，葡萄糖對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)為490 nm，人參黃精膏供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)為487 nm，兩組最大吸收波長(zhǎng)接近。結(jié)合參考文獻(xiàn)，選擇490 nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，再迅速加入濃硫酸5.0 mL。靜置10 min，充分混勻并于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.0088x+0.0283，R2=0.9995，表明葡萄糖質(zhì)量濃度在19.62～98.1 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)人參黃精膏樣品（批號(hào)S2201012），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，分別取1 mL 于具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，然后迅速加入濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，充分混勻并于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其RSD 值。結(jié)果顯示，該批次人參黃精膏樣品的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.74%～1.81%范圍內(nèi)，6 次的測(cè)定平均值為1.77%，RSD 值為1.24%，表明方法重復(fù)性較好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)人參黃精膏樣品（批號(hào)S2202003），按“2.2.5”項(xiàng)方法進(jìn)行粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，每天測(cè)定1 次，連續(xù)測(cè)定3 d，結(jié)果計(jì)算得日間精密度RSD值為2.65%。由兩名操作員獨(dú)立對(duì)同一批號(hào)人參黃精膏樣品（批號(hào)S2202003）按“2.2.5”項(xiàng)方法進(jìn)行粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，結(jié)果計(jì)算得RSD值為0.8%。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)人參黃精膏樣品（批號(hào)S2202003），按“2.2.2”項(xiàng)方法平行制備9 份供試品溶液，分別取供試品溶液各0.5 mL 于具塞試管中，分別加入0.5 mL 相當(dāng)于樣品含量25%、50%、100%的葡萄糖對(duì)照品溶液各3 份，按“2.2.5”項(xiàng)方法進(jìn)行粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，加樣回收率在96.19%～98.29%之間，平均回收率為97.45%，RSD 值為0.74%，表明方法回收率較好。

表1 人參黃精膏中葡萄糖的回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery test of glucose in Renshen Huangjing ointment

2.2.8 耐用性試驗(yàn) 取同一批號(hào)人參黃精膏樣品（批號(hào)S2202003），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，考察超聲時(shí)間分別為25、30、35 min 時(shí)粗多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并計(jì)算其RSD值。結(jié)果顯示，超聲25、30、35 min 時(shí)粗多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.71%、1.76%、1.72%，RSD值為1.53%，表明方法耐用性良好。

2.2.9 粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 取5批人參黃精膏，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備成供試品溶液，再按“2.2.5”項(xiàng)方法進(jìn)行粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定。結(jié)果顯示，批號(hào)S2202003、S2202004、S2202005、S2202006、S2202007的人參黃精膏中粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.71%、1.74%、1.63%、1.54%、1.63%。表明采用該方法測(cè)定人參黃精膏中的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，可有效控制人參黃精膏的質(zhì)量。

3 討論

本研究以對(duì)照藥材及特征成分為對(duì)照進(jìn)行人參黃精膏中人參、枸杞等藥材的薄層色譜鑒別研究，通過(guò)對(duì)供試品溶液的制備方法、展開(kāi)溶劑的種類(lèi)與比例、點(diǎn)樣量等因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了人參、枸杞、丹鳳牡丹花、玫瑰花4種藥材的薄層色譜鑒別條件，結(jié)果顯示薄層色譜斑點(diǎn)清晰、分離明顯，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專(zhuān)屬性好，可用于人參黃精膏的質(zhì)量控制。人參的薄層鑒別中，由于供試品溶液的萃取步驟較多，人參皂苷等特征成分提取不完全，導(dǎo)致斑點(diǎn)不清晰，因此溶劑萃取時(shí)需充分振搖，確保提取完全。枸杞薄層鑒別中的展開(kāi)劑比例會(huì)影響鑒別結(jié)果，因此需要充分優(yōu)化，以達(dá)到更好的分離效果。丹鳳牡丹花的供試品溶液制備方法簡(jiǎn)單，但需控制好溶液濃度和點(diǎn)樣量，濃度過(guò)高或點(diǎn)樣量大，均會(huì)導(dǎo)致斑點(diǎn)分離效果差。

另外，在對(duì)黃精、玉竹進(jìn)行薄層鑒別的研究中發(fā)現(xiàn)，黃精、玉竹富含多糖成分易與配方中人參、枸杞中的多糖產(chǎn)生干擾。本研究多次分別對(duì)多糖、黃酮類(lèi)等成分進(jìn)行薄層鑒別試驗(yàn)，均發(fā)現(xiàn)陰性樣品干擾較大，且無(wú)專(zhuān)屬性，薄層的斑點(diǎn)不清晰，故認(rèn)為薄層法不適用黃精和玉竹的薄層鑒別。后期考慮采用HPLC 法對(duì)其質(zhì)量控制進(jìn)行研究，以完善人參黃精膏的質(zhì)量控制體系。

人參黃精膏中含有人參、玉竹、黃精、枸杞等富含多糖的中藥，而多糖類(lèi)成分具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，因此，本研究采用紫外-可見(jiàn)分光光度法建立了人參黃精膏中的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法，方法學(xué)考察結(jié)果表明該方法重復(fù)性好、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可用于控制人參黃精膏質(zhì)量。《中國(guó)藥典》中黃精多糖含量采用蒽酮-硫酸法，而玉竹和枸杞的多糖采用苯酚-硫酸法。本研究對(duì)比2 個(gè)多糖檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定人參黃精膏中的多糖，干擾較少，方法簡(jiǎn)單易操作，重現(xiàn)性好，可用于大規(guī)模的連續(xù)生產(chǎn)檢測(cè)。