廖益東,明江,張宇,廖一飛,徐卡婭,△
缺血性腦血管疾病可引起腦血管閉塞缺氧,致神經(jīng)元損害,而原代神經(jīng)元培養(yǎng)是神經(jīng)科學體外研究的重要途徑之一。近年研究表明,原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元可用于腦血管疾病體外模型研究,這種原代神經(jīng)元細胞模型較貼近于人體自身神經(jīng)元的病理生理特點,可模擬出腦卒中后神經(jīng)元缺血再灌注損傷、糖尿病性腦病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型[1-3]。此外,體外培養(yǎng)原代提取的神經(jīng)元有結果分析精確、易觀察以及實驗周期短等優(yōu)勢,已被越來越多地應用于神經(jīng)科學研究[4-5]。此外,由于神經(jīng)元提取細節(jié)繁多,細胞培養(yǎng)難度大,國內(nèi)外相關研究中選取的消化酶及培養(yǎng)基配方亦不統(tǒng)一[1,6]。本研究采用出生24 h內(nèi)的SD 大鼠進行神經(jīng)元提取,選用木瓜蛋白酶與DNA 酶順序消化方案,并對操作細節(jié)及接種后培養(yǎng)基選配進行多項改進,以期尋求一種更加簡便易行的提取方法,為后續(xù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究建立良好的體外細胞模型。
1.1 實驗動物 出生24 h內(nèi)清潔級SD大鼠9只,雌雄不限,體質量20~35 g,購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0001;動物使用許可證號:SYXK(黔)2018-0001;動物質量合格證號:20211012Aazz0619000425。所有大鼠均在自然光照下自由飲食、飲水,溫度25 ℃,動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣,由貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院實驗動物學部飼養(yǎng)繁殖。本實驗經(jīng)貴州醫(yī)科大學動物倫理委員會批準(批準文號:2101450)。
1.2 主要試劑及儀器 DMEM-F12 培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、Neurobasal-A 無血清培養(yǎng)液、B27 購自美國Gibco 公司;馬血清、木瓜蛋白酶粉購自索萊寶公司;L-多聚賴氨酸(1 g/L)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;神經(jīng)元微管相關蛋白2(MAP2)抗體、神經(jīng)元特異性核蛋白(Neun)試劑盒、β-Tubulin 抗 體、Alexa Fluor?488 標 記 的 山 羊 抗 兔IgG 購 自Abcam 公司;DNA 酶粉購自賽國生物科技有限公司;DAB 辣根過氧化物酶(HRP)顯示試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;SABC-Cy3免疫熒光試劑盒購自博士德生物公司;青霉素及鏈霉素購自Hyclone公司。CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、-80 ℃低溫冰箱購自美國Thermo 公司;熒光倒置顯微鏡購自日本Nikon公司,共聚焦顯微鏡購自德國蔡司集團,正置熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。
1.3 方法
1.3.1 配制溶液 5 g/L DNA 酶:稱取5 mg DNA 酶粉,加入1 mL 無菌水溶液,經(jīng)0.22 μm 針式過濾器除菌后備用。將木瓜蛋白酶粉與DMEM-F12 培養(yǎng)基按2∶1 進行配制,經(jīng)0.22 μm 針式過濾器除菌后備用。將1 g/L 的L-多聚賴氨酸用超純水稀釋10 倍,配制成0.1 g/L 的多聚賴氨酸。神經(jīng)元接種液:DMEM-F12基礎培養(yǎng)基+10%FBS+1%青霉素鏈霉素溶液。神經(jīng)元培養(yǎng)液:Neurobasal-A培養(yǎng)基+2%B27+0.5%青霉素鏈霉素+0.5%谷氨酰胺。
1.3.2 包被培養(yǎng)板 使用0.1 g/L 的L-多聚賴氨酸溶液浸泡6孔板和細胞爬片,輕輕搖晃使孔底及爬片全部浸潤,37 ℃溫箱過夜,回收L-多聚賴氨酸溶液后,置超凈臺風干,穩(wěn)定4 h備用。接種時用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min,重復3次。
1.3.3 分離、消化新生SD 大鼠皮層神經(jīng)元 取24 h 內(nèi)新生SD大鼠,放入75%乙醇中浸泡2 min,取出后用預冷PBS沖洗干凈。處死乳鼠,快速使腦組織溫度降到0 ℃后迅速將頭顱離斷,放入盛有預冷DMEM-F12 培養(yǎng)基的燒杯中清洗,隨后轉移至另一盛有預冷10%馬血清和DMEM-F12 培養(yǎng)基的無菌平皿內(nèi)。解剖全程在冰上進行,用彎鑷子、直顯微鑷分層剪開頭皮和顱骨,暴露大腦組織,在顯微鏡下充分除去腦組織表面血管膜與嵌入小血管,分離出乳鼠大腦皮層組織,PBS洗滌2 次,轉移入盛有DMEM-F12 培養(yǎng)基的10 cm 小皿中。將收集到的大腦皮層組織剪碎(大小為1~2 mm),吹打重懸混勻,順序加入無血清培養(yǎng)基配制的適量木瓜蛋白酶及DNA酶(100~300μL),于37 ℃溫箱里消化20 min,間隔5 min搖勻1次,消化完畢后,加入含有10%FBS的DMEM-F12溶液終止消化,并用巴氏吸管輕柔混勻,靜置5 min。見圖1。
Fig.1 The anatomy process of SD rats圖1 SD大鼠解剖過程
1.3.4 純化、培養(yǎng)神經(jīng)元單細胞 取上述消化后的細胞,加入適量DNA 酶,輕柔吹打10 次后靜置2 min;吸取上層單細胞懸液,將上清液轉移至離心管內(nèi)備用,下層沉淀的細胞團塊保留,再加入1~2 mL DMEM-F12 培養(yǎng)液,重復上述操作3次,分層分步吹打,收集細胞。將收集到的所有細胞懸液經(jīng)100 目篩網(wǎng)過濾,1 000 r/min 離心5 min,棄上清液;用含10%FBS 的DMEM-F12 神經(jīng)元接種液重懸細胞,隨后,將細胞懸液接種至內(nèi)含細胞爬片的6 孔板內(nèi),搖勻,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),4 h 后及時更換預熱的含B27 的Neurobasal-A 神經(jīng)元培養(yǎng)液,并在換液前使用DMEM-F12洗去細胞器碎片與雜質;首次換液為24 h 內(nèi)進行全量換液,之后每隔2~3 d 半量換液,培養(yǎng)至7 d 后用于后續(xù)實驗,并鏡下觀察,拍照記錄細胞形態(tài)。
1.3.5 接種不同濃度神經(jīng)元單細胞 將上述純化的單細胞懸液,采用細胞計數(shù)板調整細胞濃度,經(jīng)前期預實驗將神經(jīng)元細胞液分為3 種不同的細胞密度,分別為1×105、5×105、1×106細胞/mL,接種于6孔板內(nèi),每孔2 mL。置于37 ℃、5%CO2原代專用培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),使神經(jīng)元貼壁生長,24 h 后拍照記錄并對比細胞形態(tài),選擇5×105細胞/mL進行后續(xù)實驗。
1.3.6 β-Tubulin免疫熒光法鑒定皮層神經(jīng)元 取培養(yǎng)7 d后的神經(jīng)元單細胞經(jīng)37 ℃復溫后,使用預熱的PBS洗滌5 min。采用4%多聚甲醛固定細胞15 min,PBS 洗滌3 次,每次5 min。0.25%TritonX-100 室溫下處理細胞15 min,PBS 洗滌3次,每次5 min。10%山羊血清封閉30 min,吸去山羊血清,勿洗。滴加β-Tubulin抗體(1∶200)于蓋玻片上,4 ℃孵育過夜,PBS洗滌3次,每次5 min。滴加Alexa Fluor?488標記的山羊抗兔IgG(1∶500)于蓋玻片上,室溫避光孵育2 h,PBS 洗滌3次,每次5 min,滴加適量的內(nèi)含4,6-二氨基-2苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)抗熒光萃滅劑封片。同時設置空白對照,用PBS代替一抗,其余方法同上,使用共聚焦顯微鏡觀察并拍攝。
1.3.7 Neun 抗體免疫組織化學法鑒定皮層神經(jīng)元 取培養(yǎng)7 d 后的神經(jīng)元單細胞,使用預熱的PBS 洗滌5 min,37 ℃溫箱下4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次,每次5 min。5%羊血清室溫封閉45 min,加入Neun一抗(1∶200),4 ℃冰箱過夜,PBS洗3次,每次5 min,加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗,避光孵育1 h,加入DAB反應顯色,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片,鏡下觀察染色部位。
1.3.8 MAP2 免疫熒光法鑒定皮層神經(jīng)元純度 提取培養(yǎng)7 d 后的神經(jīng)元單細胞,使用預熱的PBS 洗滌5 min,采用4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次,每次5 min;室溫下采用0.25%TritonX-100 破膜15 min,PBS 洗滌3 次,每次5 min;采用10%山羊血清室溫封閉30 min,吸去山羊血清,勿洗。加入一抗MAP2(1∶100),4 ℃冰箱中孵育過夜,37 ℃復溫10 min,PBS洗滌3次,每次5 min,加入二抗羊抗兔IgG(1∶100),避光37 ℃孵育30 min,PBS 洗滌3 次,每次5 min,加入SABC-Cy3避光37 ℃孵育45 min,PBS 洗滌3 次,每次5 min。將細胞爬片取出,固定于載玻片,并用含有DAPI 的封片液核染色10 min。用倒置熒光顯微鏡觀察。紅色熒光為神經(jīng)元標志物,藍色為細胞核,分別攝取神經(jīng)元和細胞核的熒光圖像,計算同一視野下神經(jīng)元的數(shù)量占該視野中總細胞數(shù)的百分比,每張玻片隨機讀取3個視野觀察,每次實驗觀察3個樣本,實驗重復3次,取百分比的平均數(shù)為神經(jīng)元的純度。
2.1 不同接種密度對神經(jīng)元生長狀態(tài)的影響 密度為1×105細胞/mL孔內(nèi)的神經(jīng)元密度較小,突觸相隔較遠;5×105細胞/mL孔內(nèi)的神經(jīng)元僅有少數(shù)聚團,但胞體飽滿、胞體間形成交聯(lián),突觸生長均勻;1×106細胞/mL 孔內(nèi)的神經(jīng)元密度過大,神經(jīng)元聚集成團明顯,個別神經(jīng)元出現(xiàn)擠壓情況。見圖2。
2.2 皮層神經(jīng)元的生長形態(tài)學觀察 以密度5×105細胞/mL細胞懸液接種24 h后,細胞部分貼壁,胞體胞核光暈明顯,僅有少數(shù)樹突生長,見圖3A。接種3 d 后,貼壁細胞逐漸增多,神經(jīng)元突觸進一步生長并延長,交聯(lián)成稀疏網(wǎng)絡,見圖3B。接種7 d 后,神經(jīng)元仍大量生長,胞體豐滿,并形成更為緊密的神經(jīng)元網(wǎng)絡系統(tǒng),見圖3C。
2.3 皮層神經(jīng)元β-Tubulin免疫熒光鑒定 共聚焦顯微鏡下可見細胞胞體和突觸均能被β-Tubulin 抗體所標記,證明此細胞為神經(jīng)元,見圖4。
2.4 皮層神經(jīng)元Neun免疫組織化學染色 Neun免疫組化染色結果表明,培養(yǎng)細胞胞體和樹突均顯棕色,染色呈陽性,證明提取培養(yǎng)細胞是神經(jīng)元,見圖5。
2.5 MAP2免疫熒光法鑒定皮層神經(jīng)元純度 免疫熒光染色可見神經(jīng)元胞體及樹突著色,結果顯示,經(jīng)MAP2 鑒 定得到神 經(jīng) 元 純度為(91.06±1.51)%,見圖6。
Fig.2 Growth status of neurons at different inoculation densities(×40)圖2 不同接種密度神經(jīng)元生長狀態(tài)(×40)
Fig.3 Image of SD rat cortical neurons under an inverted microscope(×100)圖3 SD大鼠皮層神經(jīng)元在倒置顯微鏡下圖像(×100)
Fig.4 Cortex neurons identified by β-Tubulin immunofluorescence(×400)圖4 皮層神經(jīng)元β-Tubulin免疫熒光鑒定(×400)
Fig.5 Neun staining of cortical neurons(×400)圖5 皮層神經(jīng)元Neun染色(×400)
Fig.6 MAP2 immunofluorescence identification of cortex neurons圖6 皮層神經(jīng)元的MAP2免疫熒光鑒定
隨著細胞技術的不斷發(fā)展,原代神經(jīng)元模型已被廣泛應用于腦血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的研究中[7]。已有研究證實原代皮層神經(jīng)元可作為體外研究神經(jīng)疾病的模型,如在干細胞治療缺血性腦卒中的研究中,通過缺血缺氧皮層神經(jīng)元與人骨髓間充質干細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)間充質干細胞通過線粒體轉移的方式發(fā)揮對受損神經(jīng)元的修復作用[8-9]。同時根據(jù)原代神經(jīng)元培養(yǎng)情況,可更加直觀地研究每個階段神經(jīng)元的發(fā)育,且能夠單獨觀察局部神經(jīng)元可塑性[10-11]。目前,國內(nèi)外提取神經(jīng)元消化方案及培養(yǎng)步驟繁多復雜,方案也不統(tǒng)一,既往部分研究者選擇胎鼠進行皮層神經(jīng)元提取,但胎鼠的胎齡難以掌握,取材難度大,且增加了操作步驟,極易造成孕鼠死亡[1,12]。在消化酶選擇方面,Brewer[6]比較了多種消化酶,發(fā)現(xiàn)木瓜酶用于原代神經(jīng)元提取時具有保護神經(jīng)細胞活性的顯著優(yōu)勢。
本研究結合國內(nèi)外皮層神經(jīng)元的提取方法及自身的實驗經(jīng)驗并加以改進,總結得到以下幾點:(1)培養(yǎng)基的選擇。可使用無血清培養(yǎng)基Neurobasal-A,同時添加B27和谷氨酰胺為神經(jīng)元供能。此法配制的培養(yǎng)基可最大限度地抑制膠質細胞生長,得到狀態(tài)穩(wěn)定的神經(jīng)元。(2)SD 乳鼠解剖。解剖全程需在冰上進行,處死乳鼠后,需快速使腦組織溫度降到0 ℃,盡可能保證神經(jīng)元的存活率。同時,為保證細胞代謝,解剖過程需浸泡在含有10%馬血清和DMEM-F12 培養(yǎng)基中進行,因為血清可為離體的神經(jīng)元提供代謝能量及營養(yǎng)物質。(3)剝離取材腦皮層段。應盡可能去除腦組織外包裹的血管膜和血管,如果去除不完全,會影響后續(xù)步驟。同時還會影響消化步驟,增加操作難度,降低細胞存活率,無法得到高質量的神經(jīng)元。此外,乳鼠的出生時間越短,腦血管膜越容易剝離,血管膜剝離越干凈,提取的皮層神經(jīng)元純度越高[13-15]。(4)消化步驟。本研究未采用胰酶消化,因為胰酶消化時間難以控制,且濃度過高會導致消化過度,本實驗選取木瓜蛋白酶和適量DNA 酶混合消化,既保證細胞消化完全,又避免過度消化而損失。木瓜蛋白酶較為溫和,消化效果良好,能柔和地處理皮層組織,得到純度更高的神經(jīng)元細胞[12]。(5)分步分層吹打。FBS 終止消化后,本研究對吹打方案進行改進,采用分步分層吹打法,此法的優(yōu)勢在于分步吹打的過程中,盡可能保證收獲更多神經(jīng)元單細胞,避免了細胞被過度吹打、損傷。經(jīng)分層分步操作之后如還有團塊沉淀,應果斷丟棄,造成此原因可能是血管膜未剝離完全,同時為了防止細胞懸液結團和黏稠,還應該在操作前加入適量的DNA酶。(6)純化神經(jīng)元。需使用100目細胞過濾網(wǎng)濾除細胞雜質與未清除完全的血管膜組織,此法可最大限度地濾去剪碎的細胞器碎片,減少影響神經(jīng)元純度的因素[16]。(7)接種細胞密度的選擇。經(jīng)前期實驗經(jīng)驗,采用L-多聚賴氨酸過夜浸泡細胞爬片,PBS 清洗后滴加適合密度的細胞懸液,此方案可有效避免神經(jīng)元后期的聚集現(xiàn)象。細胞密度在實驗中較為重要。首先,種板密度低,神經(jīng)元較難存活和成熟,細胞間難以形成交聯(lián)。其次,膠質細胞及雜細胞會大量分裂,導致神經(jīng)元存活率降低,實驗失敗。本研究發(fā)現(xiàn)每孔為5×105細胞/mL 最為適宜,接種7 d后,得到的神經(jīng)元生長狀態(tài)穩(wěn)定。原代細胞液中混有的細胞器碎片和雜質超過12 h 會貼壁牢固,且在后續(xù)換液中難以清除,細胞器碎片及雜質將直接影響神經(jīng)元存活和正常代謝,因而種板4~6 h后需及時進行換液。種植細胞12 h后,膠質細胞也開始分裂,需及時更換預熱37 ℃的無血清培養(yǎng)基來抑制膠質細胞生長。此外,本研究在操作過程中發(fā)現(xiàn),冰冷的培養(yǎng)基可能會影響皮層神經(jīng)元,導致貼壁神經(jīng)元脫落,因此預熱培養(yǎng)基尤為重要。種植細胞完成后的換液,禁止使用PBS 清洗,需用DMEM 清洗,既能除去雜質和細胞碎片,也可減少細胞脫落,得到貼壁更加牢固的神經(jīng)元。隨后,本研究采用β-Tubulin免疫熒光法和Neun 抗體免疫組化法鑒定細胞為神經(jīng)元且接種7 d,MAP2免疫熒光法鑒定神經(jīng)元純度較高,為(91.06±1.51)%。
綜上所述,采用24 h內(nèi)新生SD大鼠大腦經(jīng)木瓜蛋白酶與DNA 酶順序消化可得到優(yōu)質皮層神經(jīng)元單細胞懸液。以5×105細胞/mL/孔密度接種7 d 后,得到的神經(jīng)元生長狀態(tài)穩(wěn)定、純度高,可作為研究各類神經(jīng)疾病的細胞模型,為神經(jīng)元的提取及原代培養(yǎng)提供了切實可行的方案。