劉辰，梁倩雯，趙濟(jì)全

2型糖尿病的主要特征為胰島β細(xì)胞數(shù)量減少、胰島素分泌減少以及胰島淀粉樣多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP）蛋白沉積［1-2］。人源胰島淀粉樣多肽（human IAPP，hIAPP）是由胰島β細(xì)胞合成的具有37 個氨基酸殘基的短肽，與胰島素協(xié)同分泌［3］。hIAPP 的過度沉積不僅影響胰島素的正常分泌，而且能夠促進(jìn)胰島β 細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致2 型糖尿病的發(fā)生［4］。研究表明，細(xì)胞膜功能紊亂、線粒體氧化應(yīng)激參與了hIAPP誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡過程［5］。Exendin-4 是一種發(fā)現(xiàn)于希臘毒蜥毒液的短腸促胰島素多肽，含有39 個氨基酸殘基，與胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）在結(jié)構(gòu)上具有53%的同源性，屬于GLP-1 受體長效激動劑［6］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Exendin-4 可以通過多種途徑改善胰島β 細(xì)胞的功能，起到治療糖尿病的作用［7-8］。本研究旨在探討Exendin-4 在體外對hIAPP 誘導(dǎo)的胰島β 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠胰島β細(xì)胞INS-1E由本實驗室保存；hIAPP購自南京肽谷生物科技有限公司；Exendin-4 購自MedChemExpress 公司；胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素購自美國HyClone公司；CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒、BCA 定量試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒、腺苷三磷酸（ATP）檢測試劑盒、JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒購自北京碧云天公司；鼠源Bcl-2、Bax、Bad、Tubulin 一抗及二抗購自武漢Proteintech 公司；PVDF 膜、ECL 發(fā)光液購自美國Millipore 公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自青島海爾公司；電泳、轉(zhuǎn)膜裝置購自美國Bio-Rad 公司，多功能酶標(biāo)儀購自英國PerkinElmer公司，全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自上海天能公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制 將INS-1E細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。稱量hIAPP和Exendin-4粉末，加適量超純水，配制成1 mol/L母液，分裝保存。實驗前，取一定量母液用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成實驗所需濃度的工作液，冷藏保存。

1.2.2 CCK-8法分析hIAPP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及Exendin-4的保護(hù)作用 取對數(shù)生長期的INS-1E細(xì)胞，按照4×103個/孔接種于96 孔板，培養(yǎng)過夜后棄掉培養(yǎng)基，加入含有2.5、5、10、20 μmol/L hIAPP 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，建立hIAPP 誘導(dǎo)INS-1E 細(xì) 胞 凋 亡 模 型。之 后 用20、50、100 nmol/L 的Exendin-4預(yù)處理細(xì)胞24 h篩選Exendin-4的有效濃度，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定各組光密度（OD）值。實驗重復(fù)3 次，取3 孔平均值。按照公式計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=［（對照組平均OD值-實驗組平均OD值）/空白組平均OD值］×100%。

1.2.3 細(xì)胞LDH釋放檢測 將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，分 為 空 白 組、Exendin-4 組、hIAPP 模 型 組、hIAPP+Exendin-4 組以及陽性對照組（LDH 釋放試劑）。Exendin-4預(yù)處理24 h后加入hIAPP處理48 h。將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機300×g離心5 min。分別取各孔的上清液120μL，加入到新的96 孔板中，每孔加入60 μL 的LDH 檢測工作液，在490 nm處測定OD值。實驗重復(fù)3次，取3孔平均值。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ATP 檢測 細(xì)胞接種于6孔板，實驗分為空白組、Exendin-4 組、hIAPP 模 型 組、hIAPP+Exendin-4 組。Exendin-4預(yù)處理24 h后加入hIAPP處理48 h。去除培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS 清洗，加入200 μL 裂解液，裂解細(xì)胞。裂解后4 ℃、12 000×g離心5 min，取適量上清液加入到新的檢測板內(nèi)，隨后立即加入ATP檢測工作液，震蕩混勻，用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測。實驗重復(fù)3 次，取3 孔平均值。根據(jù)ATP 標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算ATP的濃度。

1.2.5 JC-1 熒光探針法檢測線粒體膜電位 細(xì)胞分組處理同1.2.4，處理48 h 后，消化細(xì)胞并重懸于1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入1 mL JC-1 染色工作液，顛倒混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結(jié)束后，500×g、4 ℃離心3 min收集細(xì)胞。用JC-1染色緩沖液洗滌2次，沉淀細(xì)胞，棄上清液，再用適量的JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機檢測。根據(jù)紅綠色熒光的比例分析線粒體膜電位的變化。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 分組同1.2.4，各組相應(yīng)處理48 h后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液后煮沸5 min。應(yīng)用SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分離，半干法電轉(zhuǎn)運至PVDF膜，室溫封閉1 h，分別加入一抗抗體Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bad（1∶2 000），Tubulin（1∶10 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后，二抗室溫孵育1 h，加入ECL 發(fā)光液，使用天能成像系統(tǒng)檢測發(fā)光情況。用Image J 軟件對目的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，計算相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用軟件GraphPad 7.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey’s 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Exendin-4 抑制hIAPP 誘導(dǎo)的INS-1E 細(xì)胞凋亡 終濃度為5、10、20μmol/L的hIAPP作用于INS-1E細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的增殖率分別下降了23%、50%和67%（P＜0.05），見圖1。選擇20μmol/L作為凋亡誘導(dǎo)的實驗濃度。終濃度為20、50 和100 nmol/L 的Exendin-4 預(yù)處理24 h 后加入hIAPP，結(jié)果顯示，50和100 nmol/L 的Exendin-4 可有效緩解由hIAPP 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡（P＜0.01），見圖2，后續(xù)采用50 nmol/L的Exendin-4為實驗濃度。

Fig.1 Effects of different concentrations of hIAPP on apoptosis of INS-1E cells圖1 不同濃度hIAPP對INS-1E細(xì)胞凋亡的影響

2.2 Exendin-4 抑制hIAPP 誘導(dǎo)的INS-1E 細(xì)胞內(nèi)LDH 釋放 與空白組比較，hIAPP 模型組顯著增加細(xì)胞LDH 的釋放（P＜0.05），而Exendin-4 預(yù)處理后能夠明顯降低細(xì)胞外LDH 的水平（P＜0.05），Exendin-4組對LDH釋放無影響，見圖3。

Fig.2 The effects of Exendin-4 on hIAPP induced apoptosis ofINS-1E cells圖2 不同濃度Exendin-4對hIAPP誘導(dǎo)的INS-1E細(xì)胞凋亡的影響

Fig.3 Changes of LDH release level of INS-1E cells in each group圖3 各組INS-1E細(xì)胞LDH釋放水平變化

2.3 Exendin-4 減少hIAPP 導(dǎo)致的INS-1E 細(xì)胞 內(nèi)ATP 消耗 與空白組比較，hIAPP 模型組明顯增加細(xì)胞內(nèi)ATP 的消耗（P＜0.01），而Exendin-4 預(yù)處理后能夠緩解由hIAPP 導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ATP 的消耗，Exendin-4組對ATP的生成無影響，見圖4。

Fig.4 Comparison of the ATP consumption in INS-1E cells in each group圖4 各組INS-1E細(xì)胞內(nèi)ATP消耗情況比較

2.4 Exendin-4阻止hIAPP誘導(dǎo)的INS-1E細(xì)胞線粒體膜電位丟失 結(jié)果顯示，hIAPP處理后，去極化線粒體的比例明顯高于空白組，hIAPP 導(dǎo)致了線粒體膜電位的丟失，而Exendin-4預(yù)處理后能夠顯著降低去極化線粒體的比例，抵抗細(xì)胞凋亡，Exendin-4 組對線粒體膜電位無明顯影響，見圖5、表1。

Fig.5 Comparison of mitochondrial membrane potential loss between four groups of INS-1E cells圖5 各組INS-1E細(xì)胞線粒體膜電位丟失情況比較

Tab.1 Comparison of apoptosis related protein expression levels between the four groups of INS-1E cells表1 各組INS-1E細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of apoptosis related protein expression levels between the four groups of INS-1E cells表1 各組INS-1E細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化比較（n=3，±s）

**P＜0.01；a與空白組比較，b與hIAPP模型組比較，P＜0.05。

組別空白組Exendin-4組hIAPP模型組hIAPP+Exendin-4組F去極化線粒體比例（%）9.86±0.77 12.20±1.10 41.30±8.06a 23.20±4.43b 28.570**Bcl-2 1.00±0.05 1.16±0.21 0.39±0.08a 0.83±0.11b 136.400**Bax 1.00±0.21 0.93±0.04 2.09±0.26a 1.51±0.13b 91.880**Bad 1.00±0.11 1.05±0.19 1.96±0.26a 1.35±0.18b 66.580**

2.5 Exendin-4調(diào)控線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá) 與空白組相比，hIAPP模型組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平下降，促凋亡蛋白Bax和Bad的表達(dá)水平升高，Exendin-4預(yù)處理后能顯著上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，同時下調(diào)Bax和Bad的表達(dá)，見表1、圖6。

Fig.6 The apoptosis-related protein expression levels of INS-1E cells in each group圖6 各組INS-1E細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討論

胰島素在糖尿病的治療過程中起著至關(guān)重要的作用。胰島β 細(xì)胞是內(nèi)源性胰島素產(chǎn)生的唯一來源，其功能正常是維持體內(nèi)血糖和代謝平衡的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)約40%的2型糖尿病患者胰島中有大量的淀粉樣蛋白沉積［9］，經(jīng)鑒定其主要成分是IAPP［10］。目前IAPP 被認(rèn)為是聚集性較強的多肽之一，當(dāng)血糖升高時，IAPP 濃度成倍增加，由于hIAPP是由胰島β 細(xì)胞分泌，其在胰島周圍的濃度要顯著高于血液中的濃度［11］。研究發(fā)現(xiàn)，胰島周圍高濃度的hIAPP 通過形成大量淀粉樣沉積進(jìn)而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的凋亡以及功能紊亂［12］。對于由hIAPP沉積引起的細(xì)胞凋亡的具體機制尚不明確。目前研究認(rèn)為其可能通過激活c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13-14］。本研究結(jié)果顯示，隨著hIAPP濃度的增加，INS-1E 細(xì)胞增殖活性明顯降低，表明hIAPP 的聚集可以抑制INS-1E 細(xì)胞增殖。LDH 是存在于細(xì)胞中的一種穩(wěn)定酶，當(dāng)質(zhì)膜損傷后迅速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中，是反映細(xì)胞毒性的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)hIAPP可以加速INS-1E細(xì)胞中LDH的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究表明，胰腺中GLP-1及其類似物Exendin-4能夠促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖，抑制β細(xì)胞凋亡，刺激胰島素的合成以及分泌；而在肝臟、肌肉及脂肪組織中，GLP-1則能夠促進(jìn)葡萄糖的吸收，并增加肝臟的胰島敏感性；此外，GLP-1還通過抑制胃排空來增加飽腹感［7］。但是對于Exendin-4能否改善由IAPP 聚集引起的β細(xì)胞凋亡及其機制還缺乏研究。本研究發(fā)現(xiàn)，Exendin-4可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖并且明顯減少由IAPP 導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)LDH 釋放，提示Exendin-4具有改善IAPP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。

根據(jù)激活方式和信號分子通路的不同，細(xì)胞凋亡可分為外源性途徑的細(xì)胞凋亡和內(nèi)源性途徑的細(xì)胞凋亡（也稱為線粒體途徑的細(xì)胞凋亡）［15］。內(nèi)源性途徑的細(xì)胞凋亡是糖尿病胰島β細(xì)胞死亡的一種主要方式［16］。線粒體膜電位丟失是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的重要特征，會影響線粒體ATP 的產(chǎn)生以及誘導(dǎo)促凋亡因子的釋放［17］。在本研究中，INS-1E 細(xì)胞接觸hIAPP后會損傷線粒體功能，抑制ATP的產(chǎn)生，并導(dǎo)致線粒體膜電位嚴(yán)重丟失，去極化比例增加。而Exendin-4可以有效增加ATP的含量，并且恢復(fù)線粒體膜電位至正常水平。

Bcl-2蛋白家族由抗凋亡和促凋亡成員構(gòu)成，這些家族蛋白彼此間相互作用維持平衡來共同調(diào)控線粒體功能，在線粒體途徑的凋亡發(fā)生過程中具有關(guān)鍵作用［18-19］。促凋亡蛋白Bax 和Bad 能通過增加線粒體膜的通透性加速細(xì)胞凋亡。而抗凋亡蛋白成員Bcl-2 可以維持線粒體外膜的完整性?？沟蛲龅鞍缀痛俚蛲龅鞍妆磉_(dá)水平的平衡是維持線粒體膜電位的重要因素［20］。已有研究結(jié)果顯示，Exendin-4可以通過調(diào)節(jié)ERK1/2 通路保護(hù)棕櫚酸酯毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［21］。本實驗中，Exendin-4 能夠明顯抑制hIAPP導(dǎo)致的Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)以及Bax和Bad蛋白表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，Exendin-4可以通過線粒體途徑改善由hIAPP 聚集導(dǎo)致的胰島β 細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與Exendin-4 調(diào)控線粒體膜電位和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為Exendin-4 的臨床應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。