王 芳 李詠梅 商麗紅 楊玉娥 陳 華 哈春芳,3*

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院(銀川，750004)；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是育齡期婦女的一種常見且復(fù)雜的慢性炎癥性全身性系統(tǒng)性疾病。據(jù)報(bào)道，其發(fā)病率在育齡女性中占6%～10%，在不孕的婦女中增加到50%，臨床主要表現(xiàn)為盆腔疼痛、痛經(jīng)和不孕[1-2]。EMs發(fā)病機(jī)制目前仍主要基于Sampson最早提出的“經(jīng)血逆流學(xué)說”，但卻無法解釋育齡期女性中僅8%～10%的發(fā)生率，這表明EMs的發(fā)生還與其他因素有關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥、卵巢類固醇激素失調(diào)、增殖侵襲相關(guān)分子及相應(yīng)的信號(hào)通路間復(fù)雜的相互作用可能在EMs的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[5-6]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)可將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，通過整合多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)模塊參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的許多細(xì)胞過程，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移等[7]。核因子κB(NF-κB)是多種信號(hào)通路的中樞元件和重要的轉(zhuǎn)錄因子。在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖、遷移侵襲及多種腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中都起著重要作用，越來越多的證據(jù)顯示NF-κB的異常活化參與了EMs發(fā)生的多種病理生理過程，但促使其活化轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮生物學(xué)作用的具體機(jī)制仍不清楚。有研究報(bào)道，NF-κB在腫瘤中的激活可能是某些環(huán)節(jié)發(fā)生異常導(dǎo)致上游調(diào)節(jié)因子如MAPK/ERK途徑的激活而實(shí)現(xiàn)[8-10]。因此本研究建立EMs大鼠模型，通過免疫組織化學(xué)法及Western blot法檢測EMs大鼠在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織中ERK1/2、NF-κBp65及增殖侵襲相關(guān)蛋白增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá)，探討ERK1/2及NF-κBp65蛋白在EMs發(fā)生發(fā)展中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)健康雌性未孕SD大鼠20只，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。自由光照，常規(guī)飼養(yǎng)。本研究方案得到了寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

兔多克隆抗體ERK1/2(ab17942)購自英國Abcam公司，兔多克隆抗體NF-κBp65(AF0874)購自Affinity公司、兔多克隆抗體PCNA(24036-1-AP)及MMP9(27306-1-AP)均購自武漢三鷹公司。免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒均購置于北京中杉金橋公司，BCA蛋白提取試劑盒和蛋白檢測試劑盒購自凱基公司。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用自體移植法建立EMs大鼠模型[11]。所有大鼠均用1%戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔注射麻醉。腹部備皮常規(guī)消毒，距尿道口上方1cm處縱行開腹，切口長約2cm，逐層分離肌肉、腹膜進(jìn)腹，在膀胱后面提起分離左側(cè)子宮，分別在距離卵巢及宮角分叉處約1cm處結(jié)扎，剪下長約1.5cm的左側(cè)子宮放入生理鹽水中，分離子宮內(nèi)膜組織，將其剪成5mm×5mm大小的4塊，分別用6-0無菌絲線縫合固定于左右側(cè)腹壁血管豐富處，內(nèi)膜面面向腹壁，3-0無菌絲線逐層縫合腹腔關(guān)腹。術(shù)后肌注青霉素3d預(yù)防感染。造模4周后，第2次剖腹檢查異位病灶生長情況。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：見異位病灶呈囊性增大，形成內(nèi)含淡黃色清亮或者咖啡色液體，表面及周圍可見血管形成。分別留取對(duì)照組在位內(nèi)膜組織及EMs模型組大鼠在位及異位病灶組織隨機(jī)分為兩部分，一部分4%多聚甲醛中固定行石蠟包埋切片染色；一部分留置-80℃冰箱保存，用于Western blot蛋白檢測。

1.3.2 HE染色術(shù)后4周第二次剖腹并處死大鼠，取EMs模型組大鼠在位及異位內(nèi)膜組織與對(duì)照組在位內(nèi)膜組織，室溫下置于4%多聚甲醛液中固定48h，并常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋后組織切片(5μm)，經(jīng)脫蠟復(fù)水，蘇木素染核(5min)，分化液分化(10s)，返藍(lán)液返藍(lán)(10s)，伊紅染色(5min)，梯度酒精脫水(70%-80%-90%-100%I-100II酒精各3min)，二甲苯透明(3min)，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察各組內(nèi)膜組織病理學(xué)變化。

1.3.3免疫組織化學(xué)染色將固定包埋好的蠟塊切成5μm的切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水、檸檬酸鈉緩沖液微波抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷滅活(3%過氧化氫溶液室溫避光猝滅15 min)，用山羊血清封閉(室溫封閉60min)，一抗ERK1/2(1:200，ab17942,Abcam)、NF-κBp65(1:100，AF0874，Affnity)、PCNA(1:200, 24036-1-AP, proteintech)、MMP9(1:200,27306-1-AP,proteintech)4℃孵育過夜，第2天室溫孵育45min，PBS洗滌，滴加抗兔二抗覆蓋組織，室溫孵育60min，顯微鏡下觀察DAB染色情況，蘇木素染核，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各因子表達(dá)定位情況。

1.4 Western blot蛋白檢測

取大鼠在位及異位內(nèi)膜組織置于液氮中保存，充分研磨，按照BCA蛋白提取試劑盒和檢測試劑盒說明提取總蛋白并測定蛋白濃度。每個(gè)加樣孔上樣20μg 蛋白，電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜2h，再經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉3～4h，一抗 ERK1/2(1∶1000，ab17942，Abcam)、NF-κBp65(1:1000，AF0874，Affnity)、PCNA(1:1000,24036-1-AP,proteintech)、MMP9(1:500,27306-1-AP,proteintech)、β-actin(1∶5000，AF7018,Affnity)4℃搖床孵育過夜。次日室溫孵育1h，TBST漂洗，加抗兔二抗(1∶10000)，TBST 漂洗，加適量ECL增強(qiáng)液于PVDF膜上放置，在BIO-RAD成像儀中顯影曝光，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描分析，根據(jù)曝光結(jié)果計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA分析，Pearson相關(guān)分析分析各因子間的相關(guān)性，以P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMs模型大鼠組織病理學(xué)鑒定

可見異位病灶組織呈囊狀增大，內(nèi)含淡黃色清亮或者咖啡色液體，表面及周圍可見血管形成；HE染色異位病灶組織見子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈柱狀生長，內(nèi)可見多個(gè)大小不等的腺體及間質(zhì)炎癥反應(yīng)，間質(zhì)內(nèi)可見新生血管形成，即為模型建立成功。見圖1(245頁)。

2.2 ERK1/2及NF-κBp65在內(nèi)膜組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，ERK1/2在EMs在位及異位內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞及腺體胞漿中均有表達(dá)。NF-κBp65在EMs在位及異位內(nèi)膜的腺體、間質(zhì)及腺上皮細(xì)胞的胞漿中均有表達(dá)，胞核中也有少量表達(dá)，見圖2，3(245頁)。 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組在位及異位內(nèi)膜組織中ERK1/2、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平增高，且異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平高于在位內(nèi)膜組織(P<0.05)。見表1，圖4(245頁)。

表1 各組內(nèi)膜中ERK1/2及NF-κBp65蛋白表達(dá)水平的比較

2.3 RK1/2與NF-κBp65表達(dá)水平的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析顯示，EMs在位內(nèi)膜組和異位內(nèi)膜組中，ERK1/2與NF-κBp65的表達(dá)水平均呈正相關(guān)(異位內(nèi)膜組r=0.657，P<0.05；在位內(nèi)膜組r=0.709，P<0.05)，見圖5(245頁)。

2.4 內(nèi)膜組織中PCNA、MMP9蛋白表達(dá)及表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示，PCNA在EMs在位及異位內(nèi)膜的腺體及腺上皮細(xì)胞胞核及胞漿中均有表達(dá)。MMP9在EMs在位及異位內(nèi)膜的腺體、間質(zhì)及腺上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且主要表達(dá)于腺體和間質(zhì)的胞漿中，胞核中也有少量表達(dá)。見圖6，7(246頁)。Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，EMs模型組在位及異位內(nèi)膜組織中PCNA、MMP9蛋白表達(dá)水平增高，且異位內(nèi)膜組織中 PCNA及MMP9蛋白表達(dá)水平高于在位內(nèi)膜組織(P<0.05)。見表2，圖8(246頁)。

表2 各組內(nèi)膜中PCNA及MMP9蛋白表達(dá)水平的比較

3 討論

EMs雖在病理形態(tài)學(xué)上屬于一種良性病變，但其異位內(nèi)膜的種植卻涉及增殖、遷移侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特性。近年來研究表明，多種細(xì)胞因子(增殖、侵襲相關(guān)因子)的活化表達(dá)參與了EMs的發(fā)生發(fā)展。因此本實(shí)驗(yàn)采用自體移植法誘導(dǎo)建立EMs大鼠模型，旨在探討ERK1/2及NF-κBp65蛋白在EMs發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

ERK 作為MAPK傳導(dǎo)途徑中的末端主激酶，包含ERK1和ERK2兩種亞型，受細(xì)胞外炎癥因子刺激并由其上游激酶MEK磷酸化激活，通過磷酸化作用機(jī)制調(diào)節(jié)NF-κB 等多種轉(zhuǎn)錄因子的活性和基因表達(dá)，最終在調(diào)控與細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)中發(fā)揮特定的生物學(xué)效應(yīng)[12-14]。文獻(xiàn)報(bào)道，EMs患者腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中ERK1/2表達(dá)及磷酸化活化程度明顯增高，提示其可能在EMs發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15]。Arosh等[16]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EMs中ERK1/2途徑的抑制降低了體外人子宮內(nèi)膜異位基質(zhì)細(xì)胞的增殖和生存活力以及體內(nèi)EMs小鼠模型中子宮內(nèi)膜異位病變的生長，揭示MAPK / ERK途徑的過度激活對(duì)子宮內(nèi)膜異位病變的增殖、存活和生長的重要性。本研究建立EMs大鼠模型，Western-blot檢測結(jié)果顯示 EMs大鼠在位及異位內(nèi)膜組中ERK1/2蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，且與對(duì)照組相比，EMs大鼠在位及異位內(nèi)膜組中PCNA蛋白表達(dá)水平亦增高。進(jìn)一步揭示ERK1/2途徑的過度激活增加與EMs的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可能通過增強(qiáng)異位內(nèi)膜的增殖能力促進(jìn)EMs的發(fā)生發(fā)展。

NF-κB是由NF-κBRel蛋白家族中的兩個(gè)亞單位P50和p65構(gòu)成的二聚體復(fù)合物。作為備受關(guān)注的多種信號(hào)通路將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄程序的重要樞紐，在正常和病理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)，靜息狀態(tài)下NF-κB多以惰性復(fù)合物的形式與IKBa結(jié)合存在于多種細(xì)胞類型中，當(dāng)細(xì)胞受到各種細(xì)胞外刺激后，活化的NF-κB與其復(fù)合物IKBa解離并進(jìn)入細(xì)胞核，參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖侵襲等多種生物學(xué)效應(yīng)[17-18]。EMs患者異位組織中NF-κB激活的增加表明它可能在EMs的發(fā)病機(jī)制中起作用。據(jù)報(bào)道，NF-κB作為EMs的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NF-κB的過度活化參與了EMs發(fā)生發(fā)展過程中炎癥、免疫等多種病理生理過程[19-20]。研究表明，NF-κBp65在EMs患者的在位及異位內(nèi)膜組織中表達(dá)增高，NF-κBp65 siRNA干擾EMs原代腺上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其侵襲性相應(yīng)減低，揭示NF-κBp65的過度激活可能是介導(dǎo)EMs異位細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)的關(guān)鍵[21-22]。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，EMs大鼠在位及異位內(nèi)膜組織中NF-κBp65蛋白以及MMP9蛋白的表達(dá)水平升高，揭示NF-κBp65在EMs中過度激活增強(qiáng)了異位內(nèi)膜的侵襲能力，可能是EMs發(fā)生及演變過程中的關(guān)鍵基因，但EMs中活化NF-κBp65表達(dá)增強(qiáng)異位細(xì)胞侵襲性的具體上游機(jī)制仍不清楚。

分子生物學(xué)研究顯示，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長過程中NF-κB作為ERK的直接下游靶點(diǎn)發(fā)揮著舉足輕重的作用，它可以引發(fā)一系列的抗凋亡基因，并在多個(gè)水平上阻斷凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[23]。腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在腫瘤中的激活可能是通過炎癥刺激如腫瘤壞死因子α(TNFα)或通過上游調(diào)節(jié)因子如MAPK/ERK途徑激活實(shí)現(xiàn)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲[24-25]。本實(shí)驗(yàn)建立EMs大鼠模型，免疫組化及Western-blot結(jié)果均證實(shí)：與對(duì)照組相比，ERK1/2與NF-κBp65在EMs大鼠在位及異位內(nèi)膜中表達(dá)水平升高，且呈二者表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步檢測增殖、侵襲相關(guān)蛋白(PCNA、MMP9)表達(dá)，結(jié)果亦表明與對(duì)照組相比，EMs模型組異位病灶增殖侵襲性明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者的表達(dá)與EMs的發(fā)病息息相關(guān)，二者表達(dá)水平升高可能通過增強(qiáng)異位病灶組織的增殖侵襲能力，促進(jìn)了EMs的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究表明ERK1/2與NF-κBp65在EMs大鼠內(nèi)膜組織中表達(dá)增高且呈正相關(guān)，揭示二者作為信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)與EMs的發(fā)生緊密相關(guān)，可能是誘導(dǎo)EMs發(fā)生的關(guān)鍵基因，下一步將繼續(xù)利用EMs大鼠為研究模型并靶向抑制ERK1/2蛋白，檢測靶向治療后異位病灶體積變化，通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確ERK1/2與NF-κBp65表達(dá)在EMs發(fā)病中的作用，為EMs的藥物靶向治療提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。