何 敏，楊景龍，史瑞明，黃燕萍

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安 710061)

大葉性肺炎是兒童下呼吸道感染性疾病中較常見的一種，臨床起病急，病情重，病程長，易發(fā)生肺外并發(fā)癥，近幾年來發(fā)病呈逐漸增多的趨勢[1]。肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌是其感染的主要病原。傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法，例如咽拭子、痰培養(yǎng)、血清病原抗體檢測、血培養(yǎng)等，尚不能滿足臨床快速、精準(zhǔn)治療的需求。宏基因二代測序(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)可及時(shí)、準(zhǔn)確地進(jìn)行病原學(xué)檢測，對指導(dǎo)臨床診斷、治療具有重要作用[2]。本研究應(yīng)用電子纖維支氣管鏡對一組大葉性肺炎患兒行支氣管肺泡灌洗，檢測肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的病原情況，并對病原學(xué)和臨床特征進(jìn)行回顧性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年8月至2020年2月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院治療的24例學(xué)齡期大葉性肺炎患兒為研究對象，按照是否采用肺泡灌洗液二代基因測序檢測病原分為研究組和對照組各12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①大葉性肺炎患兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考諸福棠《實(shí)用兒科學(xué)》及兒童社區(qū)獲得性肺炎診療規(guī)范[3-4]，患兒具有發(fā)熱、咳嗽等表現(xiàn)，經(jīng)聽診、胸片或CT、血常規(guī)檢查確診為大葉性肺炎；②本研究獲得患兒家長的知情同意、我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有凝血功能疾病、貧血；②伴有腫瘤疾?。虎壑夤芑?；④氣管異物；⑤長期應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素的患兒；⑥因各種原因無法接受支氣管肺泡灌洗。

1.2 研究方法

研究組采用傳統(tǒng)方法及肺泡灌洗液二代基因測序檢測病原，對照組只采用傳統(tǒng)方法檢測病原。具體為兩組行支氣管鏡后采集肺泡灌洗液送檢一般細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)核桿菌、真菌、細(xì)菌涂片，研究組在此基礎(chǔ)上送檢肺泡灌洗液mNGS。

支氣管肺泡灌洗方法：參考國內(nèi)兒科纖維支氣管鏡指南[5]，術(shù)前6 h禁食，選用Olympus BF260電子支氣管鏡，予以靜脈鎮(zhèn)靜加局部麻醉的方法，采用2%利多卡因咽喉部局麻，纖維支氣管鏡經(jīng)鼻、咽喉、聲門進(jìn)入氣道，觀察支氣管形態(tài)，37℃生理鹽水灌洗至炎癥嚴(yán)重的肺段，1.0mL/kg至少灌洗3次，隨即負(fù)壓吸引以獲取BALF，標(biāo)本置一次性無菌硅化收集器中，緩慢拔出纖維支氣管鏡。操作過程中予以吸氧，常規(guī)監(jiān)測血氧飽和度、血壓和心率等，密切觀察患兒呼吸、唇色、面色等情況。

研究組肺泡灌洗液mNGS檢測方法：BALF外送至深圳華大基因股份有限公司，提取核酸后行PMseq病原微生物DNA高通量測序，測序所得的病原序列與病原庫進(jìn)行對比得到最終結(jié)果。報(bào)告致病菌的標(biāo)準(zhǔn)參考已有文獻(xiàn)[6]。

此外，收集兩組熱程(發(fā)病至入院前)、影像學(xué)檢查中肺炎病變部位等臨床資料；收集兩組紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)、凝血功能、肺炎支原體抗體及病毒抗體檢測等指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料及臨床特征比較

兩組患兒年齡、性別、肺炎范圍比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組熱程較長，累及肺葉較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2/t值分別為5.716、6.972，P<0.05)，見表1。

表1 研究組與對照組一般資料及臨床特征比較Table 1 Comparison of general data and clinical features of the children between the two

2.2 血清病原學(xué)檢測

24例標(biāo)本中血清肺炎支原體抗體(mycoplasma pneumonia，Mp)21例(87.5%)陽性，嗜肺軍團(tuán)菌抗體陽性5例(20.8%)，流感B型抗體陽性2例(8.3%)，合胞病毒抗體陽性1例(4.2%)，研究組與對照組的病原檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 研究組與對照組血清病原抗體檢出率[n(%)]Table 2 Comparison of detection rates of pathogen antibodies in serum of the children between the two groups [n(%)]

2.3 肺泡灌洗液涂片及培養(yǎng)

24例患兒BALF細(xì)菌、結(jié)核、真菌涂片均陰性；對照組菌培養(yǎng)均陰性，研究組菌培養(yǎng)陽性2例(16.7%)，其中1例BALF培養(yǎng)為肺炎鏈球菌，1例痰培養(yǎng)及BALF培養(yǎng)均為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSR)。

2.4 肺泡灌洗液mNGS

2.4.1 病原學(xué)分析

研究組肺泡灌洗液mNGS分析顯示，5例單一肺炎支原體拷貝數(shù)陽性，其拷貝數(shù)為19 101～139 304，其余均為混合性感染，具體為EB病毒+肺炎支原體2例(16.7%)，格雷文尼放線菌+肺炎支原體2例(16.7%)，金黃色葡萄球菌+流感嗜血桿菌1例(8.3%)，微小微單胞菌+侵肺戴李斯特菌1例(8.3%)，細(xì)環(huán)病毒16型+肺炎支原體1例(8.3%)；1例金黃色葡萄球菌拷貝數(shù)519，肺泡灌洗液培養(yǎng)為MRSR；另有1例，肺泡灌洗液mNGS肺炎支原體陽性但肺泡灌洗液培養(yǎng)為肺炎鏈球菌，見表3。

2.4.2 肺炎支原體檢出結(jié)果

研究組中1例患兒血清嗜肺軍團(tuán)菌IgM陽性，肺炎支原體抗體陰性而肺泡灌洗液mNGS顯示肺炎支原體序列數(shù)陽性(37 769)；2例入院時(shí)肺炎支原體IgM、IgG定量正常(參考值分別為IgM<1.1，IgG<3.6)，同期肺泡灌洗液mNGS肺炎支原體序列數(shù)分別為120 363、20 276，治療1周后復(fù)查肺炎支原體IgM、IgG定量均升高，IgM分別為3.6、5.1，IgG分別為145、320，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 研究組檢出病原類型Table 3 Pathogen types detected in the study group

2.4.3 病原序列數(shù)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

10例肺炎支原體感染患兒的序列數(shù)與CRP、ESR、住院時(shí)長有強(qiáng)正相關(guān)性(r值分別為0.891、0.861、0.814，P<0.05)，其中序列數(shù)最高的2例患兒臨床診斷均為重癥難治性支原體肺炎，故在一定程度上表明肺炎支原體載量越大，肺部病變越重，住院時(shí)間越長。

表4 10例肺泡灌洗液肺炎支原體序列數(shù)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 4 Correlations of sequence number of Mycoplasma pneumoniae in BALF with serological indexes and hospital stay in 10 children

3 討論

3.1 微生物二代測序指導(dǎo)兒童肺炎病原學(xué)精準(zhǔn)診治

肺炎是兒童期常見的感染性疾病，在全球5歲以下導(dǎo)致兒童死亡的疾病中仍排第1位[7]。早期和快速精準(zhǔn)判斷病原微生物，針對性使用抗生素治療，對于有效預(yù)防控制、臨床診治及改善預(yù)后具有十分重要的作用。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)陽性率低，培養(yǎng)周期較長，而抗原/抗體的免疫學(xué)方法、病原體特異核酸序列PCR方法等，僅針對于已知病原，無法檢測未知的病原。本研究病原血清學(xué)抗體檢測僅提示肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、流感病毒、合胞病毒感染，肺泡灌洗液病原學(xué)涂片均陰性，菌培養(yǎng)僅2例陽性，靈敏度較低。在熱程及累及肺炎范圍方面，研究組與對照組存在差異，原因可能與患兒發(fā)熱時(shí)間越長、累及肺葉范圍越廣、病情越重，患兒家屬對mNGS的接受程度越高，此外也與家庭經(jīng)濟(jì)狀況、文化程度等社會(huì)因素有關(guān)，因此存在一定選擇偏倚。

微生物宏基因二代測序技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、通量高的特點(diǎn)，無需微生物培養(yǎng)，直接提取標(biāo)本核算測序，可檢測樣本中所有微生物信息，24～36 h即可判斷病原，在敏感性及準(zhǔn)確性方面與傳統(tǒng)的病原檢測技術(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在臨床醫(yī)療中發(fā)揮重要的作用[8-9]。有學(xué)者使用肺泡灌洗液二代基因測序34例兒童重癥肺炎，檢出病原32例，陽性率高達(dá)94.1%[10]。另有學(xué)者通過二代測序檢測76例重癥肺炎肺泡灌洗液，其靈敏度達(dá)86.84%，顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)、免疫熒光、定量PCR等傳統(tǒng)檢測技術(shù)[11]。Takeuchi等[12]研究也表明mNGS可用于呼吸道感染患者BALF中病原體的分子診斷和監(jiān)測?？聞?chuàng)宏等[13]通過高通量測序檢測43例嬰幼兒重癥或疑難細(xì)菌性肺炎的病原體靈敏度較高，并檢測出經(jīng)普通培養(yǎng)難以獲得的鮑特菌，與本研究結(jié)果一致。

3.2 二代測序病原序列數(shù)與預(yù)后相關(guān)

近年來Mp感染發(fā)生率呈逐漸增高的趨勢，本研究12例大葉性肺炎患兒mNGS檢測BALF中也發(fā)現(xiàn)Mp為主要病原。自2012年全球多地區(qū)發(fā)生Mp暴發(fā)流行，日本、英國的感染病例也顯著升高[14]。Mp是兒童社區(qū)獲得性肺炎(communityacquired pneumonia，CAP)的重要病原體，可占CAP的10%～30%，Mp流行時(shí)可增加3～5倍[15]。由于Mp對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥等一系列復(fù)雜的機(jī)制使得難治性肺炎支原體肺炎的發(fā)病率增高，常引起肺不張、肺壞死、支氣管擴(kuò)張及閉塞性細(xì)支氣管炎等不良預(yù)后和后遺癥，因此，早診斷、早治療是Mp感染診治的關(guān)鍵。本研究2例入院時(shí)肺炎支原體抗體IgM、IgG均正常，而肺泡灌洗液Mp序列數(shù)均升高，治療1周后復(fù)測肺炎支原體IgM、IgG陽性，表明mNGS可以更早的發(fā)現(xiàn)Mp。另外，10例支原體肺炎患兒的Mp序列數(shù)與CRP、ESR、住院時(shí)長有強(qiáng)相關(guān)性，其中序列數(shù)最高的2例患兒臨床診斷均為重癥難治性支原體肺炎，肺部實(shí)變范圍廣，臨床癥狀重，住院時(shí)間明顯延長。

3.3 病原微生物二代測序的局限性

眾多研究證明mNGS能夠快速、準(zhǔn)確地檢測和鑒定病原體[16-17]，但是仍然存在一些局限性。首先，由于病變的位置和患者的耐受性，通過支氣管鏡檢查獲得的標(biāo)本可能不含有價(jià)值的病原體DNA，繼而會(huì)導(dǎo)致結(jié)果假陰性。在以后的研究中應(yīng)開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化程序以進(jìn)一步提高mNGS的檢測產(chǎn)出率。其次，由于真菌和細(xì)菌的細(xì)胞壁較厚，在DNA提取過程中采用了破壁處理，這可能會(huì)影響RNA病毒的檢測。因此，如果懷疑RNA病毒感染，應(yīng)采用RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄程序。此外，mNGS無法區(qū)分定植和致病菌株，檢測結(jié)果需結(jié)合患兒臨床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)結(jié)果綜合分析。最后，經(jīng)濟(jì)成本也是限制二代測序技術(shù)推廣的重要因素。mNGS的平均成本為每份標(biāo)本3 000元左右，與傳統(tǒng)的病原體檢測相比經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較大，相信隨著科技的發(fā)展，未來二代測序檢測病原體的成本將很快逼近甚至低于血培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢測技術(shù)，推動(dòng)其臨床應(yīng)用。

綜上，mNGS可提高兒童大葉性肺炎的病原診斷準(zhǔn)確率，對臨床治療有指導(dǎo)作用。但本研究是單中心回顧性研究，仍需要更多前瞻性和多中心數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證mNGS分析的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診療。