曾銀萍，牟忠林，丁 順，羅志飛

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1.耳鼻咽喉頭頸外科，2.病理科，海南 ?？?570102）

難治性鼻竇炎（refractory rhinosinusitis，RRS）臨床治療效果難以令人滿意，根本原因還在于發(fā)病機(jī)制不明確，不能對因治療。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為免疫功能缺陷是難治性鼻竇炎患者手術(shù)療效不佳及導(dǎo)致難治的潛在原因之一［1］，樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是目前已知功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動者，尤其在鼻息肉發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中的作用成為近年來的研究熱點(diǎn)。樹突狀細(xì)胞可通過一系列的細(xì)胞及體液免疫機(jī)制導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，EOS）的浸潤增多［2］，而EOS也 可 以 誘 導(dǎo) 樹 突 狀 細(xì) 胞 的 成 熟［3］，目 前，CD83、CD11c、S100 與CD1a 一起被認(rèn)為是成熟DC 的膜標(biāo)記分子［4-6］，也是鑒定DC 的主要的標(biāo)記物。難治性鼻竇炎的特征之一是EOS 浸潤增多［7］。筆者應(yīng)用免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)記法，通過檢測難治性鼻竇炎患者鼻竇黏膜中成熟樹突狀細(xì)胞CD83 和CD11c 表達(dá)情況，分析其與EOS 浸潤增多的相關(guān)性，對難治性鼻竇炎發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018 年1 月～ 2019 年12 月在我院耳鼻咽喉-頭頸外科住院行鼻內(nèi)窺鏡手術(shù)治療的慢性鼻竇炎患者，共90 例，入組患者術(shù)前均完善鼻內(nèi)窺鏡和鼻竇三維CT 檢查，排除哮喘、結(jié)核、肝炎、高血壓及糖尿病等內(nèi)外科嚴(yán)重疾病或惡性腫瘤疾病，術(shù)前1個月內(nèi)未使用過抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑藥物治療，手術(shù)統(tǒng)一由我科具有豐富鼻內(nèi)鏡技術(shù)經(jīng)驗的高級職稱醫(yī)師完成。按如下標(biāo)準(zhǔn)篩選符合本實驗標(biāo)準(zhǔn)的患者，并分組登記。難治組：RRS 患者要求：（1）合理的藥物治療未獲得理想療效，同時接受過1 次或1 次以上的鼻內(nèi)鏡手術(shù)；（2）在手術(shù)前后接受了規(guī)范的圍手術(shù)期治療與鼻腔護(hù)理；（3）接受了3 個月及以上的術(shù)后規(guī)范性藥物治療；（4）半年及以上的隨訪結(jié)果顯示上述體征與癥狀仍遷延不愈者，共30 例，男性12 例，女性18 例，年齡34～57歲，平均年齡（42.17±5.75）歲。初治組：慢性鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）患者要求：（1）通過藥物及手術(shù)綜合治療后患者臨床癥狀明顯改善或痊愈；（2）術(shù)后的患者復(fù)查VAS 評分不得大于3 分；（3）術(shù)后單側(cè)鼻腔鼻內(nèi)鏡Lund-Kennedey 評分不得大于3 分；（4）手術(shù)復(fù)查者鼻腔通暢，鼻竇開放良好，鼻腔黏膜無水腫，鼻腔無或僅有少量異常分泌物，共30 例，男性17 例，女性13 例，年齡18～63 歲，平均年齡（40.03±9.81）歲。對照組：無明顯鼻部炎癥癥狀，鼻內(nèi)鏡及CT 檢查均未發(fā)現(xiàn)鼻息肉或炎癥病變的單純性鼻中隔偏曲病人，共30 例，男性21 例，女性9 例，年齡16～54 歲，平均年齡（39.50±7.18）歲。經(jīng)檢驗各組間男女比例及年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 難治組和初治組取患者的病變鼻竇黏膜組織，對照組則取患者的鼻中隔黏膜組織。每份組織標(biāo)本均放入10%多聚甲醛溶液中固定，然后再石蠟包埋保存，用于進(jìn)一步的蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，H-E）染色、免疫組化（Immu‐nohistochemistry，IHC）、免疫熒光雙標(biāo)記實驗。

1.2.2 免疫組化檢測各組CD83 和CD11c 表達(dá)步驟 以同一標(biāo)本兩張連續(xù)切片，分別監(jiān)測；各組切片常規(guī)脫蠟，熱修復(fù)抗原，滴加5%BSA 封閉液，分別加入適當(dāng)稀釋的一抗，分別為CD83（1∶200）和CD11c（1∶250），于4 ℃孵育過夜，加生物素化山羊抗兔IgG（稀釋濃度：1∶100）及SABC 試劑（稀釋濃度：1∶100），行DAB 顯色，接著蘇木素輕度復(fù)染，然后酒精逐級梯度脫水，使用二甲苯進(jìn)行透明，迅速滴加中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察。采用LEICA成像系統(tǒng)對CD83 和CD11c 的免疫組化結(jié)果進(jìn)行定位、定量觀察，對比各組患者鼻竇或鼻黏膜組織中成熟DC 細(xì)胞標(biāo)志物CD83 和CD11c 的表達(dá)情況。

1.2.3 H-E 染色檢測各組EOS 浸潤步驟 固定后的各組切片組織行常規(guī)H-E 染色，先行二甲苯脫蠟，使用梯度乙醇固定，蘇木素著色大約5～10 min，稀氨水（1%）返藍(lán)，伊紅著色1～5min，各梯度乙醇脫水，予以二甲苯透明，迅速滴加中性樹膠，加蓋玻片封片，在顯微鏡下觀察并拍照。采用LEICA 成像系統(tǒng)對EOS 的H-E 染色結(jié)果進(jìn)行定位、定量觀察，對比各組患者鼻竇或鼻黏膜組織中EOS 的浸潤情況。

1.2.4 免疫熒光雙標(biāo)記檢測步驟 石蠟切片脫蠟至水，使用梯度乙醇固定，再將切片放入盛滿EDTA 抗原修復(fù)緩沖液（pH 8.0）的修復(fù)盒中，在微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，畫圈自發(fā)熒光淬滅，在圈內(nèi)滴加BSA 孵育30 min，然后血清封閉，加一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 °C 孵育過夜后，再將玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3 次，每次5 min，在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。玻片再次PBS 洗滌3 次后，在圈內(nèi)滴加DAPI 染液復(fù)染細(xì)胞核，避光室溫孵育10 min，再次脫色洗滌，用抗熒光淬滅封片劑封片，切片在熒光顯微鏡下反復(fù)觀察，最后采集圖像。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 CD83 和CD11c 的免疫組化表達(dá)判定 組織切片先于低倍鏡視野（×100）下確定5 個陽性細(xì)胞表達(dá)多的區(qū)域，陽性細(xì)胞的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)是棕黃色或黃色細(xì)胞，藍(lán)色細(xì)胞核為總細(xì)胞，然后在高倍鏡視野（×400）下拍照，應(yīng)用Image-proplus 6.0 軟件對每張照片進(jìn)行分析得出陽性細(xì)胞百分比即為陽性率（%）。

1.3.2 EOS 細(xì)胞計數(shù) 先于低倍鏡視野（×100）下確定5 個陽性細(xì)胞表達(dá)多的區(qū)域，再在高倍鏡視野（×400）下計數(shù)。

1.3.3 免疫熒光共表達(dá)測定判定 在低倍鏡視野（×100）確定出5 個CD11c 及CD83 共標(biāo)記高表達(dá)部位，接著借助高倍鏡視野（×400）采集圖像，再借助圖像分析軟件Image-proplus 6.0，對每張照片進(jìn)行分析得出陽性細(xì)胞百分比即為陽性率（%），多個視野均值作為該切片的終值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)值變量均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，計量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，以單因素方差分析進(jìn)行多組間差異統(tǒng)計，采用Pearson 相關(guān)性檢驗測各組CD83 和CD11c 共表達(dá)與EOS 細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，均以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD83 及CD11c 表達(dá)情況及各組間差異統(tǒng)計學(xué)分析

經(jīng)過免疫組化處理，CD83 及CD11c 標(biāo)記陽性的細(xì)胞多為黃色、棕色或棕黃色，呈圓形或者橢圓形，對照組鼻中隔黏膜組織中僅可見少量的CD83和CD11c 陽性細(xì)胞，難治組中CD83 及CD11c 陽性細(xì)胞主要位于上皮層和固有層，并呈散在分布，數(shù)目明顯多于初治組和對照組，見圖1、圖2、表1。將表1 中難治組、初治組和對照組免疫組化標(biāo)記CD83及CD11c 陽性的表達(dá)情況進(jìn)行單因素方差分析比較，據(jù)統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示難治組、初治組較對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；難治組和初治組兩組間CD83 及CD11c 的表達(dá)陽性率占比差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這說明難治性鼻竇炎患者較非難治性鼻竇炎患者中鼻黏膜的樹突狀細(xì)胞數(shù)目是存在差異的。

表1 各組CD83 和CD11c 的表達(dá)情況（n=30，%，xˉ±s）Tab 1 Expression of CD83 and CD11c in each group（n=30，%，xˉ±s）

圖1 各組CD83 免疫組化圖像（標(biāo)尺為50 μm）Fig 1 Immunohistochemical images of CD83 in each group（The scale is 50 μm）

圖2 各組CD11c 免疫組化圖像（標(biāo)尺為50 μm）Fig 2 Immunohistochemical images of CD11c in each group（The scale is 50 μm）

2.2 免疫熒光下各組CD83 和CD11c 在成熟DC 上共表達(dá)及各組間差異分析

CD83 和CD11c 均可作為成熟DC 表面標(biāo)記分子，兩者共定位更能說明成熟DC 在RRS 中高表達(dá)。因此，本研究將CD83 和CD11c 共同標(biāo)記，探究CD83 和CD11c 共 定 位 的DC 在RRS 中 的 表 達(dá) 情況。紅色代表CD83，綠色代表CD11c，核染呈藍(lán)色，共同標(biāo)記DC 時疊加為橘紅色。發(fā)現(xiàn)初治組、對照組、難治組中CD83 及CD11c 共定位的DC 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。各組的免疫熒光圖像，見圖3。

圖3 各組免疫熒光圖像（標(biāo)尺為50 μm）Fig 3 Immunofluorescence images in each group（The scale is 50 μm）

表2 各組CD83 和CD11c 的共表達(dá)情況（n=30，%，xˉ±s）Tab 2 Co-expression of CD83 and CD11c in each group（n=30，%，xˉ±s）

2.3 EOS 浸潤情況及各組間差異統(tǒng)計學(xué)分析

顯微鏡下可見EOS 主要以細(xì)胞核2～3 分葉，其特征可見胞漿為鮮紅色顆粒。主要存在于上皮層及間質(zhì)層中，難治組和初治組的組織切片內(nèi)EOS 浸潤數(shù)較對照組均明顯增多。對照組正常的鼻中隔黏膜上皮細(xì)胞整齊，基膜無明顯增厚，間質(zhì)無水腫，EOS 浸潤較少；初治組上皮下為水腫的疏松結(jié)締組織，腺體增生，間質(zhì)內(nèi)有浸潤的炎癥細(xì)胞，可見些許EOS；而難治組上皮細(xì)胞排列紊亂、脫落、斷裂，腺體較多增生，基膜明顯增厚，EOS 浸潤明顯增多，見圖4。將表3 中各組結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，難治組、初治組兩組患者的鼻黏膜組織EOS 浸潤數(shù)高于對照組，3 組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；難治組中的鼻黏膜組織EOS 計數(shù)高于初治組。

圖4 各組EOS 浸潤圖像（標(biāo)尺為50 μm）Fig 4 EOS infiltrating images in each group（The scale is 50 μm）

表3 各組EOS 的浸潤情況（n=30，xˉ±s）Tab 3 EOS infiltration in each group（n=30，xˉ±s）

2.4 各組CD83 及CD11c 共表達(dá)與EOS 浸潤的相關(guān)性分析

經(jīng)免疫熒光檢測CD83 及CD11c 在各組鼻黏膜組織共表達(dá)水平，與各組中EOS 浸潤情況，對各組樣本檢測指標(biāo)進(jìn)行散點(diǎn)圖預(yù)測分析呈線性趨勢，通過Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見表4，各組CD83 及CD11c 共表達(dá)與EOS 浸潤間均呈正相關(guān)關(guān)系。

表4 CD83 及CD11c 共表達(dá)與EOS 表達(dá)的相關(guān)性（n=30）Tab 4 Correlation between CD83 and CD11c co-expres?sion and EOS expression（n=30）

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，絕大多數(shù)CRS 患者經(jīng)過系統(tǒng)的藥物和手術(shù)治療后，均能得到較好的預(yù)后，然而有資料表明超過15%的CRS 患者經(jīng)綜合治療后仍會有持續(xù)不愈的臨床癥狀以及術(shù)后復(fù)發(fā)等問題，稱為難治性鼻竇炎［8］。早在2001 年Wrees‐mann 等［9］首次提出RRS 是繼發(fā)于藥物和手術(shù)治療之后，炎癥仍然長期遷延存在持續(xù)不愈的鼻竇炎，并 闡 述 了 可 能 的 發(fā) 病 機(jī) 制，并 由Desrosiers［10］在2004 年從病理生理學(xué)的角度進(jìn)行了闡述，2012 年歐洲鼻-鼻竇炎鼻息肉診療指南又將RRS 正式定義為Difficult-to-treat rhinosinusitis，簡 稱 為DTRS［11］。2013 年韓德民［12］結(jié)合前人的治療經(jīng)驗，首次在我國闡述RRS 的相關(guān)內(nèi)容，對其定義、可能的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療理念做了系統(tǒng)的研究論述。2018 年中國慢性鼻竇炎診斷和治療指南肯定了RRS 與DTRS 兩種描述，但也指出其臨床定義及診斷標(biāo)準(zhǔn)尚未達(dá)成共識。然而由于RRS 的病因和發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明，臨床治療一直缺乏針對性，治療效果仍難令人滿意。

RRS 是一種復(fù)雜的、多因素作用引起的炎性疾病，目前研究表明EOS 的浸潤參與了難治性鼻竇炎的發(fā)病機(jī)制中，是多因素共同作用的其中重要一環(huán)［13］。EOS 具有致炎和細(xì)胞毒作用，是變應(yīng)性鼻炎的一個重要臨床指標(biāo)，多見于變態(tài)反應(yīng)性疾病［14］，且在鼻息肉形成和生長過程中起重要作用［15，16］。在鼻竇炎患者中，EOS 的局部活化和脫顆粒，一方面釋放二磷酸亞甲基和嗜酸細(xì)胞陽離子蛋白等堿性蛋白，導(dǎo)致局部上皮的損傷；另一方面產(chǎn)生如血小板活化因子等炎癥介質(zhì)，作用于血管的介質(zhì)，導(dǎo)致黏膜水腫；此外它還可以使細(xì)胞因子活化，刺激上皮增生和化生，新生血管形成從而導(dǎo)致息肉的發(fā)生和發(fā)展。難治性鼻竇炎患者，術(shù)后鼻竇內(nèi)可見黏膜水腫、黏液膿性分泌物、囊泡、息肉及遷延不愈的慢性炎性持續(xù)存在，與EOS 浸潤的增多密切相關(guān)［17-19］。本研究結(jié)果難治組中病變黏膜內(nèi)EOS 數(shù)目較初治組和對照組明顯浸潤增多，與前述研究結(jié)果相同，再次驗證了EOS 浸潤參與了難治性鼻竇炎發(fā)生、發(fā)展過程。

日本學(xué)者Yoshimi 發(fā)現(xiàn)鼻腔正常黏膜中存在少量朗格罕細(xì)胞，絕大部分為樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC），其在鼻炎患者的鼻黏膜中發(fā)現(xiàn)朗格罕細(xì)胞的數(shù)量明顯增多［20］。這一發(fā)現(xiàn)足以證明DC 為主的朗格罕細(xì)胞參與了鼻腔炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展。DC 的特點(diǎn)是能夠刺激初始型T 細(xì)胞（naive T cell）增殖，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動者，在調(diào)節(jié)T 細(xì)胞分化方向中起主要作用，為目前發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞。DC 誘導(dǎo)的免疫耐受與其未成熟或半成熟狀態(tài)密切相關(guān)，成熟的DC 主要誘導(dǎo)免疫激活，正常情況下體內(nèi)大多數(shù)DC 處于非成熟狀態(tài)，當(dāng)成熟DC 缺乏時，非成熟DC 可導(dǎo)致T 細(xì)胞陰性選擇，從而誘導(dǎo)抗原特異性耐受［21］。所以，DC 成熟狀態(tài)不同與免疫反應(yīng)類型和程度有密切關(guān)系，既能誘導(dǎo)免疫激活反應(yīng)，又能誘導(dǎo)免疫耐受，在炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要的作用。成熟DC 表面可高表達(dá)CD83、CD11c、S100 與CD1a 等識別標(biāo)志分子［4-6］，成熟DC 在體外培養(yǎng)時會高表達(dá)CD83，通過CD83 分子的表達(dá)量來研究DC 的成熟程度［22，23］。DC 另外一種特征標(biāo)記物是CD11c，在細(xì)胞內(nèi)吞中起重要作用，通過CD11c 捕捉抗原，將其遞呈給CD4+和CD8+T 細(xì)胞，產(chǎn)生免疫應(yīng)答［24］。亦可同時攜帶抗原定向遷移到淋巴結(jié)邊緣CD11c 細(xì)胞區(qū)，靶 向 呈 遞 給CD4+和CD8+T 細(xì) 胞［25］。因 此，CD11c 亦是細(xì)胞免疫的正向調(diào)控因子［26］。因此，本研究首先運(yùn)用免疫組化分別標(biāo)記DC 表明的CD83、CD11c 分子，檢測其表達(dá)量來確定DC 的成熟程度。通過免疫熒光共定位，確定CD83 及CD11c 共表達(dá)的DC 在各組間的陽性表達(dá)率，研究發(fā)現(xiàn)，RRS 中CD83 及CD11c 共表達(dá)陽性率明顯高于另外兩組（P<0.05），存在高表達(dá)。表明了成熟DC 參與了RRS的發(fā)病過程，為深入探究成熟DC 在RRS 中的作用機(jī)制提供了新的思路。

本研究難治組DC 和EOS 浸潤存在正相關(guān)關(guān)系，提示EOS 與樹突狀細(xì)胞在難治性鼻竇炎的發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在相互促進(jìn)作用，具體如何相關(guān)在以往研究中可初步了解。Lotfi 等［3］通過實驗研究發(fā)現(xiàn)病原體相關(guān)分子模式的非甲基化寡核苷酸DNA 可 刺 激EOS 誘 導(dǎo)DC 成 熟，DC 細(xì) 胞 的 比 率證明了DC 的成熟與EOS 直接相關(guān)；楊繼紅等［2］對正常鼻黏膜和鼻息肉組織均分別行免疫組化染色和邁格吉（may-grunwald giemsa，MGG）染色實驗，得出了鼻息肉組織中巨噬細(xì)胞即抗原呈遞細(xì)胞和EOS 表達(dá)明顯增高。由于Th1/Th2 比例平衡在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用，有學(xué)者認(rèn)為DC 通過一系列細(xì)胞及體液免疫導(dǎo)致其平衡失調(diào)，抑制T 細(xì)胞分化為Th1，促進(jìn)Th2 極化，使Th2 分泌的細(xì)胞因子占優(yōu)勢，主要是IL-4、IL-5、IL-6、IL-10［27］。IL-5已被證實在鼻息肉組織中表達(dá)明顯升高，參與了鼻息肉發(fā)生、發(fā)展，并且其抑制EOS 的凋亡，延長EOS 存活時間，同時在炎癥反應(yīng)中也促發(fā)EOS浸潤［28］。

本 研 究 結(jié) 果，DC 的 標(biāo) 志 物CD83 和CD11c 在 難治性鼻竇炎患者鼻竇黏膜中的高表達(dá)趨勢，而且其與EOS 浸潤程度呈正相關(guān)，表明了DC 和EOS 在RRS 發(fā)生及發(fā)展中起著相互促進(jìn)作用，證實DC 參與了難治性鼻竇炎發(fā)生、發(fā)展過程，為研究難治性鼻竇炎發(fā)病機(jī)制提供新思路，為其治療提供新的靶點(diǎn)，本研究尚存在一定的局限性，首先樣本量較小，缺少多中心、大樣本、隨機(jī)對照實驗，而DC 是否通過調(diào)控EOS 導(dǎo)致RRS，具體如何相互作用，是否可作為評估RRS 嚴(yán)重程度及預(yù)后的一個重要參考指標(biāo)，還有待進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)度說明

曾銀萍：實驗設(shè)計及病例資料收集、實驗操作、數(shù)據(jù)分析、撰寫論文。牟忠林：指導(dǎo)實驗設(shè)計及幫助修改論文。丁順：參與實驗病例收集、數(shù)據(jù)整理等。羅志飛：參與病理資料收集、指導(dǎo)實驗操作等。