蔡 爽， 陳 濤， 毛宗林， 楊鳳娟， 宋青龍

（1.國(guó)家飼料工程技術(shù)研究中心，北京100193；2.貴州大北農(nóng)牧業(yè)科技有限公司，貴州貴陽(yáng)550025）

仔豬養(yǎng)殖階段的腹瀉率與死亡率高是造成養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要因素之一， 尤其是仔豬斷奶后極易引起動(dòng)物消化道微生態(tài)紊亂， 感染病原微生物，造成仔豬腹瀉、生長(zhǎng)停滯甚至死亡（任曼等，2014）。抗生素在改善畜禽生長(zhǎng)性能以及疾病防治方面具有重要作用， 在世界各國(guó)被廣泛應(yīng)用已有幾十年的歷史， 但長(zhǎng)期在飼料中使用抗生素會(huì)造成畜禽腸道菌群紊亂， 會(huì)加劇耐藥性細(xì)菌或超級(jí)耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散， 導(dǎo)致嚴(yán)重的人和畜禽生物安全、 環(huán)境污染和食品安全等一系列的問(wèn)題（Yi 等，2017；Falagas 等，2012；Cho 等，2012；Larsson 和Wolk，2010）。 因此，我國(guó)決定自2020 年7月全面禁止促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑在飼料中的使用，但這對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)將是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

乳酸菌是人及動(dòng)物腸道中正常菌群的一部

分， 在調(diào)控畜禽腸道健康、 保持胃腸道微生態(tài)平衡、提高畜禽生長(zhǎng)性能等方面發(fā)揮重要作用（Chiquette，2009；Timmerman 等，2006）。但天然乳酸菌的熱穩(wěn)定性較差，在飼料的加工過(guò)程中難以存活。并且天然乳酸菌不耐胃酸及膽鹽， 進(jìn)入動(dòng)物胃部30 min 后存活率極低，最終順利到達(dá)腸道的活菌數(shù)非常少， 難以定植在腸黏膜發(fā)揮作用（郭志杰等，2010；黃滄海等，2004），這些因素限制了乳酸菌在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。 因此，篩選耐酸、耐高溫且有益生特性的乳酸菌，對(duì)解決仔豬腹瀉、飼料中抗生素用量大等問(wèn)題具有重要意義。 本研究以健康無(wú)病仔豬宿主為篩選載體， 從健康仔豬糞便中初步分離出備選菌株， 并進(jìn)行嚴(yán)格篩選和16S rRNA 進(jìn)化分析。 通過(guò)抗逆性和益生特性選育，并系統(tǒng)地研究該菌株生長(zhǎng)曲線和生理生化特性，為其發(fā)酵和應(yīng)用提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 用以分離和篩選菌株的樣品均來(lái)自健康無(wú)病仔豬的糞便。培養(yǎng)基包括MRS 肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、M17 培養(yǎng)基和糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 菌株的分離與鑒定 稱取1 g 健康仔豬的新鮮糞便，加入9 mL 生理鹽水，室溫下振蕩混勻。 對(duì)混合液進(jìn)行梯度稀釋， 均勻涂布于含有10 mg/kg放線菌酮的MRS 瓊脂培養(yǎng)基及M17 瓊脂培養(yǎng)基平板上。 37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h 后，選取生長(zhǎng)良好的特征單菌接入MRS 液體培養(yǎng)基，反復(fù)劃線純化至獲得純菌株。

16S rRNA 基因序列分析： 選用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京，中國(guó)）進(jìn)行細(xì)菌總DNA 的提取，并采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rRNA 擴(kuò)增。 擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）如表1 所示。

表1 PCR 擴(kuò)增體系

擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃5 min；94 ℃1 min；58 ℃1 min；72 ℃2 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。之后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳， 選取片段長(zhǎng)度1500 bp 左右的陽(yáng)性產(chǎn)物純化后測(cè)序 （中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司），在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)， 并通過(guò)MEGA 4.0 與模式菌種進(jìn)行親緣關(guān)系研究，選取同源性大于99%為種的分界閾值。

1.3 革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn) 取少量MRS 肉湯培養(yǎng)物置于載玻片上，烘干固定后，依次用結(jié)晶紫染色液染色1 min， 革蘭氏碘液染色1 min，丙酮乙醇混合液（丙酮：95%乙醇= 3：7）脫色30 s，沙黃染色液復(fù)染1 min， 然后在光學(xué)顯微鏡下觀察。 選取具有革蘭氏陽(yáng)性形態(tài)的桿菌進(jìn)一步進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)，具體步驟為：取0.2 mL 培養(yǎng)物接入MRS 瓊脂培養(yǎng)基斜面，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h 后，滴加3%過(guò)氧化氫溶液于菌落上，觀察是否有氣泡產(chǎn)生，若有則為革蘭氏陽(yáng)性菌，若無(wú)則為革蘭氏陰性菌。

1.4 菌株生長(zhǎng)曲線繪制 按1%（V/V） 將待測(cè)菌株接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（不加待測(cè)菌株）。將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，并每小時(shí)測(cè)定OD600值，進(jìn)行菌株生長(zhǎng)曲線的繪制。

1.5 菌株的抗逆性選育 耐熱試驗(yàn)：將待測(cè)菌株按2%（V/V）接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，分別在不同溫度（60、70、80 ℃）下孵育10 min。 孵育結(jié)束后立即置于室溫下冷卻，進(jìn)行活菌數(shù)的測(cè)定。

耐酸試驗(yàn)： 將待測(cè)菌株按2%（V/V） 接種到pH 3.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，在接種0、1、2 h 和3 h 后吸取菌液涂板。 將平皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算酸處理后的存活率。

耐膽鹽試驗(yàn)：將0.3%（m/V）或1.0%（m/V）牛膽酸鈉加入MRS 培養(yǎng)基并搖勻，制成不同膽鹽濃度的MRS 固體培養(yǎng)基。將待測(cè)菌株倍比稀釋后接入平皿，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不含牛膽酸鈉）。將平皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算膽鹽處理后的存活率。

耐貯藏試驗(yàn)： 將pH 6.7 的MRS 培養(yǎng)基置于Hungates 滾管中， 制成厭氧無(wú)菌肉湯。 每管中加1 mL 待測(cè)菌株，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別于0、24、72、104、128 h 和176 h 吸取菌液，梯度稀釋后均勻涂布于MRS 培養(yǎng)基。將平皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

抗生素抗性試驗(yàn)：將金霉素、磺胺二甲嘧啶、泰樂(lè)菌素、速大肥、乙酰甲喹、阿散酸、桿菌肽鋅、洛克沙砷、牛至油、喹乙醇、三甲氧芐氨嘧啶、抗敵素和吉他霉素13 種抗生素分別加入到滅菌的MRS 培養(yǎng)基中，將待測(cè)菌株按2%（V/V）接種到含不同抗生素的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其菌落生長(zhǎng)情況。

1.6 與致病菌混合培養(yǎng)試驗(yàn) 將待測(cè)菌株接入MRS 肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后， 取5 mL 培養(yǎng)物（8.2×109cfu/mL）分別與5、10、15 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯混合， 制成3 個(gè)含不同菌株培養(yǎng)物濃度的營(yíng)養(yǎng)肉湯，分別接種傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌K88 和O157， 接種量為培養(yǎng)液的10%，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，觀察結(jié)果。

1.7 抑菌試驗(yàn) 以嗜水氣假單胞菌（CVCC519）、綠 膿 桿 菌 （CMCCB10102）、 大 腸 桿 菌（ATCC25922）、雞白痢沙門(mén)（CVCC519）、枯草芽孢桿 菌 （CICC 20076）、 熒 光 假 單 胞 菌（CGMCC 1.1802）、李斯特桿菌（CVCCC53-5）、化膿鏈球菌（ATCC19615）、鼠傷寒沙門(mén)（CVCC2212）、巴氏桿菌（CVCC464）、金黃色葡萄球菌（CVCC1882）為指示菌，測(cè)定待測(cè)菌株的抗菌活性。 取無(wú)菌培養(yǎng)皿，用1.5%滅菌的瓊脂鋪底，然后將滅菌的牛津杯放置在凝固的瓊脂上。 將指示菌接入LB 培養(yǎng)基，原菌液濃度為107cfu/mL，待測(cè)菌株菌液濃度為108cfu/mL，然后將LB 含指示菌一起倒到裝有牛津杯的板上，待LB 凝固后用無(wú)菌鑷子取出牛津杯，試驗(yàn)孔打入待測(cè)菌，然后將培養(yǎng)皿放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 ～24 h，最后記錄抑菌圈大小以檢測(cè)待測(cè)菌株對(duì)各指示菌的抗菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定 試驗(yàn)以健康無(wú)病仔豬為宿主，對(duì)其糞便樣品中的微生物進(jìn)行分離純化，并結(jié)合革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)， 最終獲得5 株乳酸菌， 分別命名為NFER-1、NFER-2、NFER-3、NFER-4 和NFER-5。 將5 株乳酸菌和4 株模式菌株的16S rRNA 基因序列通過(guò)MEGA 4.0 軟件進(jìn)行對(duì)比，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以同源性大于99%為種的分界閾值，對(duì)其進(jìn)行鑒定。 結(jié)果表明，NFER-1和 NFER -4 與Lactobacillus parabuchneriJCM12493 具有高度相似性， 歸屬為L(zhǎng)actobacillus parabuchneri；NFER -2 與Streptococcus thermophilus的同源性為99%， 與Streptococcus thermophilusATCC19258 也處于同一分支， 判定為Streptococcus thermophilus；NFER-3 與Lactobacillus plantarumNCDO1752 處于同一亞群，結(jié)合同源性結(jié)果，判定其為L(zhǎng)actobacillus plantarum；NFER-5 與Enterococcus faeciumLMG11423 處于同一分支，因此被判定為Enterococcus faecium（圖1）。

圖1 菌株的聚類分析圖

2.2 菌株的抗逆性選育

2.2.1 耐熱性能選育 通過(guò)將分離純化出的5 株菌株分別在不同溫度條件下（60、70、80 ℃）處理10 min， 檢測(cè)菌株對(duì)高溫環(huán)境的敏感性。 結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)60 ℃熱處理10 min 后，5 株菌株都可以穩(wěn)定的存在，但是NFER-3 的數(shù)量減少最多。 經(jīng)過(guò)70 ℃熱處理10 min 后，NFER-1 和NFER-3全部死亡， 表明這兩株菌株耐熱性能差；NFER-2、NFER-4 和NFER-5 都 還 存 在 活 菌， 其 中NFER-5 存活的活菌數(shù)最多。 經(jīng)過(guò)80 ℃熱處理10 min 后，NFER-1、NFER-2、NFER-3 和NFER-4 均死亡，僅有NFER-5 仍有較高活菌數(shù)（表2）。因此，通過(guò)對(duì)5 株菌進(jìn)行耐熱性能的選育后，最終選定NFER-2、NFER-4 和NFER-5 進(jìn)行 后續(xù)的抗逆性篩選。

表2 不同溫度條件下處理10 min菌株的存活情況cfu/mL

2.2.2 耐酸性能選育 通過(guò)將候選的NFER-2、NFER-4 和NFER-5 菌株在pH 3.0 的條件下分別處理1、2 h 和3 h，檢測(cè)菌株對(duì)酸性環(huán)境的敏感性。 結(jié)果表明， 酸處理1 h 后，NFER-2、NFER-4和NFER-5 三株菌均能存活， 其中菌株NFER-5的存活數(shù)最多。 酸處理2 h 后，NFER-2、NFER-4和NFER-5 三株菌仍有少量存活。酸處理3 h 后，菌株NFER-2 全部死亡，菌株NFER-4 存活數(shù)極低， 表明NFER-2 和NFER-4 的耐酸能力較弱；但菌株NFER-5 表現(xiàn)出較強(qiáng)的酸耐受性，在酸處理3 h 后，存活率仍達(dá)到80%（表3）。 因此，通過(guò)對(duì)3 株菌進(jìn)行耐酸性能的選育后， 最終選定NFER-5 進(jìn)行后續(xù)的抗逆性篩選。

表3 pH 3.0 條件下菌株的存活率

2.2.3 耐膽鹽性能選育 經(jīng)過(guò)0.3%和1.0%膽鹽濃度處理后，菌株NFER-5 的存活率見(jiàn)表4。結(jié)果表明，NFER-5 在膽鹽濃度為0.3%和1.0%的條件下都表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性， 存活率分別達(dá)到了109.95%和47.39%。

表4 不同膽鹽濃度條件下NFER-5 菌株的存活率

2.2.4 耐貯藏性能選育 NFER-5 在不同貯藏時(shí)間的活菌數(shù)及存活率見(jiàn)表5。 結(jié)果表明，NFER-5在37 ℃恒溫培養(yǎng)的環(huán)境下穩(wěn)定性較好，培養(yǎng)72 h后菌株的存活率仍高達(dá)75%， 培養(yǎng)176 h 后，NFER-5 仍保持較高的活菌數(shù)， 存活率仍有28.33%，數(shù)量為6.8×109cfu/mL。這一結(jié)果說(shuō)明，菌株NFER-5 具有較好的穩(wěn)定性。

表5 NFER-5 菌株在不同貯藏時(shí)間的活菌數(shù)及存活率

2.2.5 抗生素抗性選育 NFER-5 菌株對(duì)多種抗生素抗性結(jié)果如表6。 結(jié)果表明，NFER-5 在含有喹乙醇、牛至油、洛克沙砷、桿菌肽鋅、阿散酸、金霉素和抗敵素的培養(yǎng)基中可以生長(zhǎng)正常， 表明NFER-5 對(duì)這些抗生素具有抗性； 然而，NFER-5在含有乙酰甲喹、速大肥、泰樂(lè)菌素、磺胺二甲嘧啶、 三甲氧芐氨嘧啶和吉他霉素的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，表明NFER-5 對(duì)這些抗生素敏感。

表6 NFER-5 菌株對(duì)各種抗生素的抗性測(cè)定

2.3 屎腸球菌NFER-5 的益生特性選育

2.3.1 屎腸球菌NFER-5 與致病菌混合培養(yǎng)試驗(yàn)將屎腸球菌NFER-5 與各致病菌混合培養(yǎng)，檢測(cè)菌株對(duì)致病菌的抑制效果。結(jié)果如表7 所示，在不同濃度下，屎腸球菌NFER-5 能夠在自身生長(zhǎng)不受影響的情況下， 使培養(yǎng)基中傷寒沙門(mén)氏菌的活菌數(shù)由108減少至102，表明其對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌有較好的抑制效果。 在不同濃度下， 屎腸球菌NFER-5 對(duì)大腸桿菌K88 和O157 也有一定的抑制作用， 能夠使培養(yǎng)基中大腸桿菌K88 和O157的活菌數(shù)由108減少至105，且屎腸球菌NFER-5自身生長(zhǎng)不受影響。 但是，試驗(yàn)結(jié)果表明，屎腸球菌NFER-5 對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑制效果，不同濃度的屎腸球菌NFER-5 均沒(méi)有影響金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

表7 屎腸球菌NFER-5 與致病菌混合培養(yǎng)后的生長(zhǎng)情況cfu/mL

2.3.2 屎腸球菌NFER-5 的抑菌特性 通過(guò)牛津杯試驗(yàn)， 檢測(cè)屎腸球菌NFER-5 對(duì)大腸桿菌、雞白痢沙門(mén)等多種病原菌的抑菌效果。 試驗(yàn)結(jié)果表明，屎腸球菌NFER-5 對(duì)巴氏桿菌（CVCC464）、鼠傷寒沙門(mén)（CVCC2212）、雞白痢沙門(mén)（CVCC519）、大 腸 桿 菌 （ATCC25922） 和 綠 膿 桿 菌（CMCCB10102）都有較強(qiáng)的抑菌作用，能觀察到明顯的抑菌圈。 其中抑菌效果最為明顯的是雞白痢沙門(mén)（CVCC519），抑菌圈直徑達(dá)到20.43 mm（表8）。

表8 屎腸球菌NFER-5 發(fā)酵液上清對(duì)指示菌抑菌直徑測(cè)定mm

2.4 屎腸球菌NFER-5 的生長(zhǎng)曲線 在培養(yǎng)過(guò)程中，每小時(shí)檢測(cè)菌液OD600值，繪制NFER-5 的生長(zhǎng)曲線。 如圖2 所示， 在培養(yǎng)2 h 后，NFER-5進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 培養(yǎng)10 h 后，NFER-5 進(jìn)入穩(wěn)定期。 因此，該菌株的最佳收獲期為培養(yǎng)后10 ～18 h。

圖2 NFER-5 的生長(zhǎng)曲線

2.5 屎腸球菌NFER-5 的生理生化特性NFER-5 的生理生化特性如表9。 結(jié)果表明，NFER-5 發(fā)酵葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、水楊苷、阿拉伯糖、海藻糖、纖維二糖、淀粉、 龍膽二糖等多種糖類產(chǎn)酸不產(chǎn)氣， 判定NFER-5 為腸球菌屬（Enterococcus）。

表9 NFER-5 的生理生化特性

3 討論

屎腸球菌廣泛存在于自然界，屬于兼性厭氧的乳酸菌， 以活菌的形式廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料產(chǎn)品中。 屎腸球菌會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫、有機(jī)酸和細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物一方面可以直接影響宿主的代謝，提高機(jī)體的免疫力，改善畜產(chǎn)品品質(zhì)；另一方面， 也可以通過(guò)調(diào)控宿主的腸道微生物區(qū)系，有效抑制腐敗菌和病原菌的生長(zhǎng)， 促進(jìn)有益菌的繁殖，間接影響宿主的健康（沈中艷等，2007）。

益生菌活菌都有適宜自身生長(zhǎng)的特殊生長(zhǎng)環(huán)境，惡劣的環(huán)境會(huì)使其生長(zhǎng)緩慢、停滯，甚至死亡。在飼料生產(chǎn)過(guò)程中，調(diào)質(zhì)、制粒的溫度和壓力是制約微生態(tài)制劑中活菌數(shù)量的關(guān)鍵因素之一， 也是活菌制劑質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。此外，活菌被動(dòng)物采食后，還要經(jīng)受動(dòng)物消化道中消化液的考驗(yàn)。 因此，本研究在篩選過(guò)程中同時(shí)兼顧了胃酸和膽鹽兩個(gè)影響因素，結(jié)合溫度耐受性試驗(yàn)和耐貯藏性能，使篩選出的目標(biāo)菌株不僅能耐受飼料加工過(guò)程中的惡劣環(huán)境， 對(duì)胃酸和膽鹽等消化道環(huán)境具有較高的耐受性，而且能夠較長(zhǎng)時(shí)間貯藏。一般仔豬飼料的制粒溫度為70 ～85 ℃， 本研究篩選出的屎腸球菌NFER-5 在80 ℃處理10 min 后， 仍有較高的存活率，表明其具有良好的耐熱性，在飼料加工過(guò)程中的損失少。同時(shí)，屎腸球菌NFER-5 在pH 3.0 和膽鹽濃度0.3%或1.0%的環(huán)境下均能夠穩(wěn)定存活， 確保了該菌株進(jìn)入動(dòng)物消化道后能經(jīng)受酸性環(huán)境和膽鹽的刺激， 能夠成功達(dá)到腸道發(fā)揮其益生功能。

大腸桿菌、 傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌是極為常見(jiàn)的條件性致病菌， 也是引起斷奶仔豬死亡的重要原因 （Mirhoseini 等，2018；Fairbrother和Nadeau，2005；Kaper，2005）。 研究證實(shí)，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌在侵入宿主后， 可以通過(guò)自身表達(dá)產(chǎn)生的黏附素黏附到特定的小腸上皮細(xì)胞刷狀緣受體上，之后開(kāi)始快速定植、生長(zhǎng)和繁殖，并分泌腸毒素，釋放脂多糖，從而引發(fā)腹瀉、腸道微生物紊亂、腸炎和腸道屏障損傷。 據(jù)報(bào)道，豬源常見(jiàn)的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌毛基因型是K88（F4）、K99（F5） 和987P （F6）（Zhang 等，2017； 黃滄海等，2005）。 目前普遍認(rèn)為，益生菌改善動(dòng)物健康的主要方式是競(jìng)爭(zhēng)性黏附及分泌殺菌物質(zhì)調(diào)節(jié)宿主微生物區(qū)系， 或通過(guò)表面大分子與宿主腸道黏膜中識(shí)別受體互作，傳遞信號(hào)，從而調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境、宿主免疫、 物質(zhì)代謝及生長(zhǎng)性能 （黃滄海等，2005）。 益生屎腸球菌調(diào)控宿主健康的方式主要有：（1）通過(guò)影響膽汁酸代謝，降低血清膽固醇水平；或通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸及維生素，增強(qiáng)宿主的能量代謝率。（2）以競(jìng)爭(zhēng)性黏附或分泌抑菌物質(zhì)的途徑，干擾腸道中病原微生物的繁殖，改善腸道菌群的微生態(tài)平衡。（3）刺激先天性免疫細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞， 調(diào)控宿主的免疫功能 （Leblanc 等，2017；Ridlon 等，2016；Lebeer 等，2010）。本研究通過(guò)將篩選出的屎腸球菌NFER-5 與大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌等致病菌混合培養(yǎng)，探究了屎腸球菌NFER-5 對(duì)大腸桿菌、雞白痢沙門(mén)等病原菌的抑菌效果， 證實(shí)了候選菌株對(duì)致病性大腸桿菌K88 和O157 以及傷寒沙門(mén)氏菌均有較好的抑制效果， 并且能夠顯著抑制大腸桿菌（ATCC25922）、雞白痢沙門(mén)（CVCC519）、鼠傷寒沙門(mén)（CVCC2212）、巴氏桿菌（CVCC464）和綠膿桿菌（CMCCB10102）的生長(zhǎng)。 這一結(jié)果與目前大多數(shù)關(guān)于屎腸球菌的研究結(jié)果一致。 屎腸球菌的代謝產(chǎn)物細(xì)菌素對(duì)志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、梭狀芽孢桿菌和葡萄球菌都具有較好的抑制作用， 而且屎腸球菌代謝產(chǎn)生的乳酸可以顯著降低動(dòng)物的腸道酸度， 從而抑制病原菌在腸道的生長(zhǎng)（Connell，2007）。針對(duì)健康仔豬和腹瀉仔豬的腸道菌群進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，與健康仔豬相比，腹瀉仔豬腸道中大腸桿菌數(shù)量顯著增加， 而乳酸桿菌的數(shù)量顯著降低（黃滄海等，2003）。 日糧中添加屎腸球菌，斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能得到顯著提升， 仔豬的特異性免疫和非特異免疫功能均得到一定程度的改善，且調(diào)控了仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)（文靜等，2011）。在用大腸桿菌、金黃的葡萄球菌、綠膿桿菌、雞白痢沙門(mén)、 鼠傷寒沙門(mén)、 巴氏桿菌感染所作的試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，都證明了屎腸球菌具有抗感染活性。補(bǔ)充屎腸球菌，可通過(guò)提高緊密連接蛋白Claudin-4 表達(dá)、調(diào)控炎癥反應(yīng)， 從而減輕產(chǎn)腸毒素大腸桿菌對(duì)豬腸道的侵襲（Kern 等，2017）；提高仔豬腸道絨毛高度及絨毛高度和隱窩深度比， 增加腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量（Rieger 等，2015）。這些結(jié)果都證實(shí)了屎腸球菌具有良好的益生性能， 具有較大的發(fā)展空間和應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

通過(guò)本試驗(yàn)的抗逆性選育，確定NFER-5 在耐高溫、耐膽鹽、耐酸、耐貯藏等方面具有較大優(yōu)勢(shì)，是一株可用于微生態(tài)制劑的優(yōu)勢(shì)菌種，并鑒定為屎腸球菌。 本試驗(yàn)篩選出的屎腸球菌對(duì)大腸桿菌（ATCC25922）、綠膿桿菌（CMCCB10102）、雞白痢沙門(mén)（CVCC519）、鼠傷寒沙門(mén)（CVCC2212）和巴氏桿菌（CVCC464）有較強(qiáng)的抑制作用，是一株優(yōu)良的微生態(tài)制劑用菌株。