張喜昌，薛明洋，戚曉舟，冷曉飛，許淑芬 ，王高學(xué)*

(1. 大連海寶漁業(yè)有限公司,遼寧 大連 116045；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

水體富營養(yǎng)化是全球十大環(huán)境問題之一。氮磷尤其是磷的輸入是引起水體富營養(yǎng)化的關(guān)鍵因素。磷不僅為控制水體藻類生長豐度的重要限制因子，而且是水體富營養(yǎng)化的最主要的限制性因素。因此，如何除去水體中過量的磷越來越受到人們的關(guān)注。目前大規(guī)模污水處理采取的方式是化學(xué)除磷，但化學(xué)除磷劑鐵鹽如聚合氯化鋁鐵等會(huì)造成二次污染，而且投加一定量的除磷藥劑之后，污水中所含的聚磷菌除磷效果明顯下降甚至消失，化學(xué)除磷的方法也不適用于養(yǎng)殖水除磷。生物除磷由于不產(chǎn)生二次污染，效率高成為當(dāng)前環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。聚磷菌是一類特殊微生物的統(tǒng)稱，廣泛存在于活性污泥中，是一種非常重要的工程菌。在好氧和厭氧交替的條件下可以吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其自身所能利用的磷，聚磷菌在厭氧條件下分解poly-P (多聚磷酸鹽)，同時(shí)聚集PHB (聚-β-羥基丁酸)；在好氧條件下分解PHB 聚集poly-P, 從而使菌體內(nèi)含有超量的磷, 以降低水體中的磷含量。常見的聚磷微生物菌群主要分布在不動(dòng)桿菌屬()、氣單胞菌屬()、假單胞菌屬()、產(chǎn)堿桿菌屬()和腸桿菌屬()。

近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展取得了令人矚目的成就，養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。在水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖過程中，由于養(yǎng)殖密度和餌料投入量增大，對水體和底泥造成嚴(yán)重污染，使得養(yǎng)殖水體含磷量嚴(yán)重超標(biāo)。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖多采用大引大排的方式，不僅極大的消耗了水資源，對周邊水體生態(tài)環(huán)境也造成了嚴(yán)重的危害。為了降低水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來的環(huán)境污染，確保水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展，迫切需要尋求高效環(huán)保的水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理技術(shù)。本研究從海泥中分離出1株具有良好聚磷效果的細(xì)菌，經(jīng)生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析，鑒定為約氏不動(dòng)桿菌()。為進(jìn)一步開發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物除磷技術(shù)提供了有效菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與培養(yǎng)基

海泥樣本采自大連黑石礁海灘。培養(yǎng)基及配方為YG培養(yǎng)基、牛肉膏固體培養(yǎng)基、聚磷培養(yǎng)液、MOPS培養(yǎng)基。模擬養(yǎng)殖水：葡萄糖0.3 g、蛋白胨 0.1 g、酵母粉 0.01 g、NaCl 0.05 g、 MgSO·2HO 0.15 g、 NHCl 0.18 g、HO 1 000 mL，最后用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH，用KHPO調(diào)整磷濃度，使其磷濃度為1.5 mg/L。

1.2 聚磷菌的篩選

取20 g海泥樣品用40 mL 0.35%的無菌鹽水充分混勻，震蕩，沉淀后取上清；將其作為原液，采用倍比稀釋法將其連續(xù)稀釋9倍，分別在各個(gè)稀釋濃度吸取100 μL到Y(jié)G平板中上，用玻璃涂布棒涂勻、編號，并做3個(gè)重復(fù)，于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)2 d。挑出不同形態(tài)的菌落，在平板上多次劃線純化。挑取單菌落接種到Y(jié)G斜面上，28 ℃培養(yǎng)2 d，4 ℃冰箱保存。將YG平板上分離純化的細(xì)菌接種到MOPS限磷、過磷平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d，觀察藍(lán)白斑生長情況。選取在限磷和過磷平板上都產(chǎn)生藍(lán)斑的菌株劃線純化，最后得到的純化菌即為聚磷菌。

1.3 聚磷培養(yǎng)基驗(yàn)證聚磷效果

將篩選出的聚磷菌接種到不同磷濃度(0.1 mg/L、0.5 mg/L、1mg/L、5 mg/L、10 mg/L)的培養(yǎng)基(250 mL)中，在28 ℃搖床中120 r/min 震蕩培養(yǎng)。分別在24 h，48 h，72 h測定上清液磷濃度。

1.4 磷濃度的測定

磷濃度的測定用鉬酸銨分光光度法。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 菌株的生理生化鑒定 根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《一般細(xì)菌常用鑒定方法》進(jìn)行鑒定。

1.5.2 16SrDNA 序列測定及比較 DNA的提取用OMEGA公司的 Bacterial DNA kit 試劑盒。引物為細(xì)菌 16S rDNA擴(kuò)增通用引物 16SF(27F)：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，16SR(1492R)：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR 擴(kuò)增體系見表1。

表1 PCR 反應(yīng)體系Table 1 Reaction system of PCR

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃下延伸1 min，循環(huán)次數(shù)為30次；72 ℃最終延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增好的16S rDNA序列產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)束后，取出凝膠放入Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增效果。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物(上海)公司進(jìn)行測序，所測序列在NCBI中進(jìn)行同源性比對(Blast),選取同源性較高的細(xì)菌序列，利用MEGA6.0進(jìn)行比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 菌株聚磷特性的研究

聚磷菌的聚磷特性是否穩(wěn)定對其應(yīng)用過程中的聚磷效果有重要影響，本研究考察了溫度、培養(yǎng)基初始pH對該菌聚磷效果的影響。將聚磷菌接種到培養(yǎng)基中分別在溫度為10、15、20、25、30、35、40 ℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)2 d。分別測定上清液磷濃度，磷濃度的測定同1.4中所示。用1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整為5、6、7、8、9，每個(gè)pH設(shè)三個(gè)平行，然后將該菌接入到該培養(yǎng)基中(磷濃度為1.5 mg/L)中，28 ℃搖床中120 r/min 震蕩培養(yǎng)2 d。分別測定上清液磷濃度，磷濃度的測定同1.4中所示方法。

1.7 模擬養(yǎng)殖水中的聚磷效果

在實(shí)驗(yàn)室人工模擬養(yǎng)殖水(磷濃度為1.5 mg/L)，將培養(yǎng)好的聚磷菌菌液濃度調(diào)整為1×10cfu/mL，以體積比1∶50、1∶100、1∶1000、1∶10000的比例接入該聚磷菌菌液，在28 ℃搖床中120 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h和72 h后，檢測上清液中磷濃度。

1.8 菌體含磷量檢測

分別將篩選得到的聚磷菌和枯草芽孢桿菌接種到磷濃度為1.5 mg/L的普通肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃搖床中120 r/min震蕩培養(yǎng)2 d。菌液于9 000 r/min離心10 min，將菌體烘干后稱重，并檢測菌體含磷量，檢測方法同(1.5)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì), 設(shè)置差異顯著性水平=0.05，當(dāng)<0.05 時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基中聚磷效果

由表2可見，24 h時(shí)磷濃度為0.1 mg/L的聚磷培養(yǎng)基中聚磷率達(dá)到74.22%。不同濃度磷濃度中該菌的聚磷效果差異顯著(<0.05)。五種不同濃度的聚磷培養(yǎng)基中，平均聚磷率達(dá)到67.76%。48 h和72 h時(shí)，各濃度下聚磷率都有所增加。72 h時(shí)平均聚磷率達(dá)到73.59%。

2.2 菌種鑒定

該聚磷菌菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上呈乳白色，濕潤，有光澤，邊緣整齊；為革蘭氏陰性菌，菌體桿狀無運(yùn)動(dòng)性，檸檬酸、過氧化氫酶、葡萄糖試驗(yàn)為陽性，氧化酶、尿素酶、乳糖等試驗(yàn)為陰性(表3)。由圖1可見，聚磷菌與(KB849237)的親緣關(guān)系較近，聚為一分支，綜合該聚磷菌的菌落形態(tài)、生理生化性質(zhì)與16S rDNA序列分析結(jié)果，將該聚磷菌鑒定為：約氏不動(dòng)桿菌()。

表2 不同磷濃度下該菌的聚磷效果Table 2 Removal ability of Phosphate under different concentration of this strain bacterium

表3 該菌株生理生化鑒定Table 3 Results of physiology and biochemical tests of the strain

圖1 聚磷菌(GenBank登錄號KU365781)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of the phosphate accumulating strains

2.3 溫度和pH對該菌聚磷效果的影響

2.3.1 溫度對該菌聚磷效果的影響 由圖2可見，當(dāng)溫度在28～33 ℃時(shí)，該菌聚磷效果最好聚磷率達(dá)到70%。當(dāng)溫度高于35 ℃或低于20 ℃時(shí)，聚磷效果較差。

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH對該菌聚磷效果的影響 由圖3可見，當(dāng)培養(yǎng)基pH在7時(shí)，該菌聚磷能力最強(qiáng)，聚磷率達(dá)到70%。當(dāng)pH小于6或者大于8時(shí)，該菌聚磷能力較差。

圖2 溫度對該菌聚磷能力的影響Fig.2 Effect of temperature on strainP accumulation capability

圖3 初始PH對該菌聚磷能力的影響Fig.3 Effect of initial PH on strainP accumulation capability

2.4 模擬養(yǎng)殖水中除磷效果

在實(shí)驗(yàn)室人工模擬養(yǎng)殖水，以1∶50、1∶100、1∶1000、1∶10000的比例接入約氏不動(dòng)桿菌菌液(1×10cfu/mL)，28 ℃培養(yǎng)24 h和72 h后，檢測上清液中磷濃度，磷濃度檢測同(1.5)。其在模擬養(yǎng)殖水中聚磷效果見表4。

模擬養(yǎng)殖水中磷濃度為1.5 mg/L，以不同比例接入約氏不動(dòng)桿菌，在24 h時(shí)，平均聚磷率為60.49%。不同比例加入約氏不動(dòng)桿菌，其聚磷率差異顯著(<0.05)，接種比例越高聚磷率越高。72 h后，各組聚磷率無顯著差異(>0.05)，其平均聚磷率達(dá)到70.75%。

2.5 菌體含磷量

聚磷菌在厭氧條件下分解poly-P (多聚磷酸鹽)，同時(shí)聚集PHB (聚-B-羥基丁酸)；在好氧條件下分解PHB聚集poly-P, 從而使菌體內(nèi)含有超量的磷，達(dá)到聚磷效果。該聚磷菌在含磷培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后菌體的含磷量達(dá)到菌體干重的7.8%，而枯草芽孢桿菌菌體的含磷量為2.2%。

表4 模擬養(yǎng)殖水中該菌聚磷率Table 4 Ability of phosphorus accumulation under simulated fishery water of the strain

3 討 論

本研究從海泥中分離出一株具有較強(qiáng)聚磷作用的細(xì)菌，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定為約氏不動(dòng)桿菌(A. johnsonii)。該菌在0.1 mg/L～10 mg/L磷濃度的培養(yǎng)基中，該菌72 h后平均聚磷率達(dá)到73.59%；當(dāng)pH為6～8、溫度為28～33℃條件下該菌聚磷效果最好，聚磷率能達(dá)到70%以上；在模擬養(yǎng)殖水中，以不同比例加入該菌， 72 h后平均聚磷率達(dá)到70.75%。

近年來，利用微生物除磷得到眾多學(xué)者的關(guān)注，國內(nèi)外也從不同的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了一些聚磷菌，如不動(dòng)桿菌()、假單胞菌()、檸檬酸桿菌()、芽孢桿菌()等。目前，聚磷菌的種類和數(shù)目相對較少，而且生物除磷的機(jī)理研究進(jìn)展也較慢。本研究發(fā)現(xiàn)的約氏不動(dòng)桿菌平均聚磷率達(dá)到73.59%，有較強(qiáng)的聚磷作用。pH對聚磷菌的聚磷效果有較大的影響，一方面可能影響了聚磷菌的生長，另一方面可能抑制了聚磷相關(guān)的代謝活動(dòng)。本研究中聚磷菌在28～33℃、pH6～8條件下具有良好的聚磷效果，當(dāng)pH低于6或高于8時(shí)，聚磷菌的聚磷效果顯著降低，與吳曉娜等研究結(jié)果相似。目前聚磷菌研究大多在生活污水處理上，而本研究中的聚磷菌是為了解決水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化，養(yǎng)殖水體和其他污水在成分有所不同，而且養(yǎng)殖水體由于養(yǎng)殖動(dòng)物的存在更適合使用生物除磷的方式。本研究在實(shí)驗(yàn)室模擬不同磷濃度的養(yǎng)殖水，進(jìn)一步研究該聚磷菌在養(yǎng)殖水中的聚磷作用，在模擬養(yǎng)殖水中，以不同比例加入該菌，72 h后平均聚磷率達(dá)到70.75%，也能夠發(fā)揮較好的聚磷作用。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖池塘和底泥中存在著復(fù)雜的微生物群落，這些微生物是否會(huì)影響聚磷菌的作用還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

從海泥中分離出1株具有良好聚磷能力的細(xì)菌，經(jīng)生理生化特征及16S rDNA鑒定，確定其為約氏不動(dòng)桿菌。

約氏不動(dòng)桿菌具有良好的聚磷能力，在培養(yǎng)基和模擬養(yǎng)殖水中聚磷率都達(dá)到70%以上。