魏 芳，李帥兵，宋蘇堤，苗 健，張國華，盧建雄

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

脂肪細(xì)胞分化是脂肪形成的基礎(chǔ)，影響動(dòng)物胴體品質(zhì)和肉質(zhì)性狀。揭示脂肪細(xì)胞分化機(jī)制，對(duì)于提高畜禽生產(chǎn)效益和改善肉品質(zhì)具有重要意義。機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境多種因素影響脂肪細(xì)胞分化，其中氧化還原平衡是維持細(xì)胞各種生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。體外環(huán)境變化及體內(nèi)物質(zhì)代謝產(chǎn)生的超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和一氧化氮（NO）等各種活性氧（ROS）均可造成機(jī)體及組織細(xì)胞氧化應(yīng)激，影響細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡及代謝。脂肪細(xì)胞攝取能量物質(zhì)后產(chǎn)生活性氧，改變細(xì)胞氧化還原電位，促進(jìn)脂肪生成[1]。脂肪細(xì)胞的氧化應(yīng)激會(huì)影響脂肪細(xì)胞增殖分化、脂肪合成及分解、細(xì)胞因子的分泌以及胰島素敏感性等，進(jìn)而對(duì)脂肪沉積產(chǎn)生影響[2]。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細(xì)胞分化中起著樞紐作用[3]。PPARγ激活后啟動(dòng)脂肪細(xì)胞分化及脂肪生成基因表達(dá)，導(dǎo)致甘油三酯合成與持續(xù)積累，調(diào)控脂肪細(xì)胞從發(fā)育到代謝的各個(gè)生物學(xué)過程[4]，包括脂肪細(xì)胞分化、胰島素敏感性、脂肪生成和細(xì)胞生存[5]。PPARγ編碼基因富含外顯子和內(nèi)含子順式調(diào)控元件，因而可以產(chǎn)生嚴(yán)格的選擇性剪接調(diào)控[6]。研究表明，PPARγ外顯子6中有絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1（serine/arginine-rich splicing factor 1,SRSF1）的結(jié)合位點(diǎn)[7]，SRSF1與PPARγ外顯子6結(jié)合可能有助于跳過外顯子5產(chǎn)生PPARγ選擇性剪接亞型PPARγΔ5[8]。PPARγ外顯子5跳躍是一種自然發(fā)生的選擇性剪接事件，在人類皮下和內(nèi)臟脂肪組織、脂肪細(xì)胞、APCs和HEK239等細(xì)胞均檢測(cè)到PPARγΔ5[9-10]。RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，剪接因子SRSF1與PPARγ的前體及成熟mRNA結(jié)合促進(jìn)外顯子5跳躍。PPARγ外顯子5跳躍導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼框移位，產(chǎn)生缺失配體結(jié)合域的PPARγ亞型PPARγΔ5。PPARγΔ5對(duì)野生型PPARγ活性具有顯性負(fù)性影響[8]，可能通過影響PPARγ的作用調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化。因此，本文就氧化應(yīng)激對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞分化及PPARγ選擇性剪接的影響做了初步研究，為深入了解豬脂肪形成的調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

3～6日齡杜×長×大雜交仔豬由蘭州瑞源農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；DMEM/F12 1:1培養(yǎng)基（HyClone公司）；胎牛血清FBS（浙江天杭生物科技股份有限公司）；注射用青霉素鈉和硫酸鏈霉素、0.25% EDTA胰酶、油紅O和DMSO、I型膠原酶（Solarbio公司）；牛血清白蛋白（Gibco公司）；地塞米松（DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、胰島素（INS）、葡萄糖（Sigma公司）；細(xì)胞總RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，大連）；無水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）、DEPC水（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1原代豬前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 將仔豬麻醉處死、體表消毒后，在無菌狀態(tài)下分離皮下脂肪組織，PBS清洗后剪碎，用0.1% Ⅰ型膠原酶消化液于37 ℃水浴鍋中消化1 h左右，終止消化并過濾，濾液離心10 min，棄上清，加入培養(yǎng)液吹打均勻，然后用含F(xiàn)BS 10%的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，接種于6孔板中，于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液[11-12]。細(xì)胞生長至80%匯合后，用5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化，接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2.2過氧化氫處理12孔板培養(yǎng)的前體脂肪細(xì)胞生長至80%匯合后，用含0.5 mm IBMX、1 μm DEX和5μg/ml胰島素的DMEM/F12誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，然后用DMEM/F12維持培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天換液。分別在誘導(dǎo)分化后2 d、4 d和6 d，用H2O2終濃度為500 μmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，檢測(cè)細(xì)胞分化及提取總RNA。

1.2.3油紅O染色提取法檢測(cè)細(xì)胞分化12孔板培養(yǎng)的細(xì)胞H2O2處理24 h后，按于淇等[13]報(bào)道的油紅O染色提取法檢測(cè)細(xì)胞分化，并在顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.4基因mRNA表達(dá)檢測(cè) 吸出培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞后，提取細(xì)胞R N A。提取的R N A用超微量紫外分光光度計(jì)（Nanodrop One）檢測(cè)R N A純度和濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄合成c D N A。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（10 μl）：5×Primer 2 μl，1～3 μl RNA，ddH2O補(bǔ)至10 μl。反應(yīng)程序：37 ℃、15 min，84 ℃、5 s，4 ℃、30 min。cDNA于-20 ℃冰箱保存。按TaKaRa公司GreenTM Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒使用說明書，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96，BIO-RAD公司，美國）檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量，所用引物（由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成）見表1，反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，上、下游引物（5 μmol/L）各0.4 μl，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (2×) 5 μl，ddH2O 3.2 μl，共10 μl。參考岳小婧等[12-14]反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件統(tǒng)計(jì)處理，用One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，用最小顯著極差法（LSD）進(jìn)行多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激抑制豬脂肪細(xì)胞分化

豬前體脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后，用H2O 2處理24 h造成細(xì)胞氧化應(yīng)激，油紅O染色提取法檢測(cè)誘導(dǎo)后3 d、5 d和7 d細(xì)胞的分化。從圖1可以看出，與對(duì)照組相比，H2O2處理顯著降低成脂誘導(dǎo)第5 d和第7 d前體脂肪細(xì)胞的分化（P＜0.05），成脂誘導(dǎo)第3 d細(xì)胞的分化僅有降低趨勢(shì)（P＞0.05）。圖2顯示成脂誘導(dǎo)后7 d脂肪細(xì)胞油紅O染色結(jié)果。H2O2處理后，油紅O染色細(xì)胞數(shù)減少，脂滴較小?？梢姡琀2O2處理誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化。

圖1 H2O2處理對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞分化的影響

圖2 成脂誘導(dǎo)后7d豬前體脂肪細(xì)胞油紅O染色結(jié)果

2.2 H2O2處理對(duì)豬脂肪細(xì)胞成脂分化基因表達(dá)的影響

成脂誘導(dǎo)6 d的脂肪細(xì)胞用H2O2處理24 h后，提取RNA，檢測(cè)分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比，H2O2處理極顯著降低細(xì)胞FABP4、C/EBPα、SCD和PPARγ mRNA表達(dá)（P<0.01），但Txnip和LPL表達(dá)極顯著提高（P<0.01），表明氧化應(yīng)激通過影響細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因表達(dá)抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化。

圖3 H2O2處理對(duì)豬脂肪細(xì)胞基因表達(dá)的影響

2.3 氧化應(yīng)激抑制脂肪細(xì)胞PPARγ選擇性剪接

如圖4所示，H2O2處理24 h，脂肪細(xì)胞選擇剪接異構(gòu)體PPARγΔ5和剪接因子SRSF1 mRNA表達(dá)均極顯著降低（P<0.01）?？梢姡趸瘧?yīng)激可以抑制PPARγ的選擇性剪接。

圖4 氧化應(yīng)激對(duì)豬脂肪細(xì)胞SRSF1、PPARγΔ5 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

氧化應(yīng)激（Oxidative Stress）是指生物體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)。許多因素如動(dòng)物生理階段改變、環(huán)境變化和外源致病菌及毒素等都會(huì)破壞機(jī)體氧化還原平衡，引發(fā)氧化應(yīng)激。營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)代謝過程中也可以產(chǎn)生大量超氧陰離子、過氧化氫和一氧化氮等活性氧。體內(nèi)積累的過多活性氧破壞組織器官黏膜屏障，導(dǎo)致機(jī)體功能和代謝損傷，引起疾病發(fā)生[15]。機(jī)體超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶及非酶抗氧化系統(tǒng)與氧自由基相互作用，維持機(jī)體適度的氧化還原平衡。研究表明，氧化還原平衡影響脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)代謝。細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位在脂肪細(xì)胞分化過程中經(jīng)歷了顯著變化[16]，細(xì)胞外氧化還原環(huán)境通過影響細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生影響細(xì)胞過程[17]。然而，氧化應(yīng)激對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響還存在爭(zhēng)議。過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞PPARγ表達(dá)及成脂分化[18]，增強(qiáng)機(jī)體脂肪積累[19-20]。在小鼠OP9前體脂肪細(xì)胞分化過程中，隨著細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累，脂滴增加[21]。然而，Pessler等[22]報(bào)道，氧化應(yīng)激通過降低C/EBP的DNA結(jié)合活性抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化。同樣，Nitta等[23]也發(fā)現(xiàn)，H2O2處理誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可下調(diào)3T3-L1細(xì)胞PPARγ表達(dá)，降低C/EBP DNA結(jié)合活性，抑制細(xì)胞分化。與此一致，本研究用H2O2處理原代培養(yǎng)豬前體脂肪細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞分化顯著減弱，成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和PPARγ及其下游生脂基因FABP4和SCD表達(dá)降低，而脂解基因LPL表達(dá)提高。研究證明，氧化還原環(huán)境通過影響細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生影響細(xì)胞過程[17]，C/EBPα和PPARγ是介導(dǎo)活性氧影響脂肪生成的主要因子[24]。由此可見，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過下調(diào)C/EBPα和PPARγ表達(dá)抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化。

作為一種氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，硫氧還蛋白互作蛋白（Txnip）參與許多細(xì)胞生理過程[25]，可通過抑制硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）的還原活性調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)[26]。Txnip是PPARγ的負(fù)調(diào)控因子，過表達(dá)Txnip可抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化、下調(diào)PPARγ表達(dá)[13]；相反，Txnip表達(dá)沉默上調(diào)PPARγ表達(dá)、促進(jìn)分化[12]。本研究用過氧化氫處理豬前體脂肪細(xì)胞，Txnip表達(dá)顯著提高。與此一致，H2O2處理引起細(xì)胞氧化應(yīng)激、生長停滯，Txnip表達(dá)提高[27-28]。這些結(jié)果也支持了氧化應(yīng)激抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化的觀點(diǎn)。

前體mRNA（pre-mRNA）選擇性剪接是真核生物基因表達(dá)的重要調(diào)控方式，95%以上的人類基因存在選擇性剪接[29]。通過選擇性剪接可形成結(jié)構(gòu)與功能多樣的蛋白質(zhì)，精密調(diào)控組織類型和細(xì)胞發(fā)育。PPARγ蛋白含有不依賴配體激活的N-端結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域（DNA binding domain,DBD）和依賴配體激活的C端-配體結(jié)合域（ligand binding domain,LBD）。經(jīng)天然或合成的配體激活后，PPARγ與其分子伴侶RXR形成異二聚體，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，與反應(yīng)元件PPREs序列結(jié)合，以配體應(yīng)答方式依賴LBD反式激活靶基因表達(dá)[8,30]。剪接因子SRSF1是一種非典型的SR蛋白，作為序列依賴性剪接激活因子發(fā)揮作用，是脂肪細(xì)胞分化必需的調(diào)節(jié)因子[31]。PPARγ第6外顯子上有SRSF1的結(jié)合位點(diǎn)，SRSF1與之結(jié)合促進(jìn)外顯子5跳躍，產(chǎn)生缺失配體結(jié)合域的PPARγ亞型PPARγΔ5[8]。用PPARγ和PPARγΔ5過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，配體誘導(dǎo)的PPARγ反式激活活性降低約50%，說明PPARγΔ5對(duì)野生型PPARγ的活性具有抑制作用，是PPARγ的顯性負(fù)性亞型[8]，可能在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝調(diào)控中發(fā)揮作用。用H2O2處理豬前體脂肪細(xì)胞后，剪接因子SRSF1與剪接異構(gòu)體PPARγΔ5的表達(dá)水平均顯著降低，即PPARγΔ5的表達(dá)可能因氧化應(yīng)激抑制SRSF1表達(dá)而降低。因此，PPARγΔ5也可能參與了氧化應(yīng)激對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞分化的影響，但其功能作用有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

氧化應(yīng)激可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和PPARγ表達(dá)及促進(jìn)Txnip表達(dá)減弱豬前體脂肪細(xì)胞分化，并抑制PPARγ基因選擇性剪接。研究結(jié)果為進(jìn)一步探討豬脂肪形成的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。