李春緣，梁克峰，任瑞文，陳迪佳，劉 炅，劉 軍，陳 月，田 靖

（南部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東省蟲媒病毒性傳染疾病應(yīng)急技術(shù)研究中心，廣州 510507）

0 引言

流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）是由流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染導(dǎo)致，據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）估算，全球每年約有6.8 萬臨床病例。我國、東南亞和西太平洋地區(qū)為JE 主要流行區(qū)[1]，全球約一半的JE 病例發(fā)生在我國，除新疆、青海和西藏之外的多數(shù)省市均有分布[2]。JE 發(fā)病急，可表現(xiàn)出不同程度的意識障礙，嚴(yán)重病例可出現(xiàn)中樞性呼吸衰竭，致死率高達30%，存活的患者中30%～50%會留下永久性神經(jīng)損傷或嚴(yán)重精神后遺癥，目前尚無特效治療方法[3]。媒介蚊蟲作為JEV 擴增的中間宿主，是JEV 傳播的重要途徑，我國熱區(qū)氣候炎熱潮濕，媒介蚊蟲滋生迅速，JE 的威脅尤為嚴(yán)重[4]。

大部分JE 患者為非癥狀感染者，僅0.1%～1%的感染者表現(xiàn)為腦炎癥狀，給疾病診斷和監(jiān)測帶來困難[5]。作為JE 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，中和試驗操作煩瑣費時，僅用于實驗室檢測，在臨床中應(yīng)用較少。在臨床診斷中，最常用的血凝抑制實驗操作較為簡單，但該方法靈敏性較低，特異性較差。因此，建立準(zhǔn)確、快速的篩查和診斷方法，對于掌握J(rèn)E 的真實流行病學(xué)數(shù)據(jù)以及制訂疾病防控策略具有重要意義。膠體金法操作簡便，對操作人員要求低，且人體感染JEV 后引起的免疫反應(yīng)可以持續(xù)終生，其IgG 抗體的檢測不受采樣時間的限制，因此，該方法在流行病學(xué)調(diào)查及臨床評估中具有重要的應(yīng)用價值[6]。本研究基于前期篩選鑒定的JEV 特異性原核表達抗原[7]，利用免疫層析技術(shù)制備膠體金快檢試紙條，并對技術(shù)參數(shù)進行系統(tǒng)優(yōu)化與評估，為醫(yī)療條件較差的基層部隊單位提供JE 快速篩查的新手段。

1 膠體金快檢試紙條制備

1.1 實驗菌株

JEV 高特異性原核表達抗原JEVAg45 由本實驗室篩選和鑒定，由基因工程菌株pMAL-JEVAg45表達[7]。

1.2 試劑與耗材

膠體金溶液（粒徑20 nm）購自珠海博美生物有限公司；金黃色葡萄球菌蛋白A（staphylococal protein A，SPA）和膠體金耗材套裝[包括硝酸纖維素膜（NC 膜）、玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙、底襯板等]均購自上海杰一生物技術(shù)公司；人IgG 抗體購自上海羽朵生物科技有限公司；Amylose 樹脂購自NEB公司。

1.3 重組蛋白純化

將基因工程菌株pMAL-JEVAg45 接種于細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（luria broth，LB），當(dāng)OD 值（光密度）為0.6 時，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl beta-D-thio-galactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)表達，之后收集菌體并經(jīng)超聲破碎后，采用NEB 公司的Amylose 樹脂利用親和層析法純化重組蛋白，使用核酸蛋白分析儀測定其濃度，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 膠體金標(biāo)記SPA 制備

1.4.1 最佳pH 值確定

用0.1 mol/L 的碳酸鉀溶液將膠體金溶液的pH值調(diào)整為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，各取100 μL 分別加入3 μg 的SPA，重復(fù)3 次，靜置5 min 后加入20 μL 10%的NaCl 溶液，混勻，在室溫下放置10 min，以溶液能保持紅色的最低pH 值作為最佳pH 值。本研究中，當(dāng)pH≥7.5 時膠體金溶液保持鮮艷紅色，因此確定SPA 標(biāo)記的最佳pH 值為7.5。

1.4.2 最適SPA 標(biāo)記濃度確定

取最佳pH 值的膠體金溶液100 μL，分別加入3～7 μL 的SPA（1 mg/mL），每間隔0.5 μL 為1 個梯度，重復(fù)3 次，混勻后室溫放置15 min，加入20 μL 10%的NaCl 溶液，室溫放置2 h 后，記錄仍保持紅色的最小蛋白用量，在此基礎(chǔ)上增加10%，確定為最適SPA 標(biāo)記濃度。

1.4.3 金標(biāo)SPA 制備

取30 mL 最佳pH 值膠體金溶液，在250 r/min攪拌下，逐滴加入最適標(biāo)記濃度SPA 溶液1 mL，攪拌30 min 后逐滴加入10%的聚乙二醇20000（PEG 20000）溶液至最終濃度為0.25%，室溫3 000 r/min離心15 min，棄沉淀，取紅色上清液；紅色上清液于4 ℃、11 000 r/min 離心35 min，取沉淀，用1%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）將沉淀混懸至原體積，重復(fù)離心2 次，以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)；用含1%的BSA 和0.02 mol/L NaN3的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）重懸沉淀至原體積的1/10，即為金標(biāo)記SPA，于4 ℃保存?zhèn)溆?。最佳pH 值條件下，在SPA 為34.33～65.42 μg/mL 范圍內(nèi)，當(dāng)SPA添加濃度至52.13 μg/mL 時，標(biāo)記溶液仍可保持鮮艷紅色，為保證標(biāo)記反應(yīng)的穩(wěn)定性，最終確定膠體金標(biāo)記的SPA 濃度為60.00 μg/mL。

1.5 固相NC 膜的制備

在NC 膜上，用不同濃度的JEVAg45 蛋白繪制檢測線（T 線），用不同濃度的人IgG 抗體繪制質(zhì)控線（C 線），間距為0.5 cm，自然晾干，切割成5 mm 寬的檢測試紙條，置4～8 ℃干燥保存?zhèn)溆?。包被抗原濃度實驗表明，在過高的蛋白濃度條件下，試紙條的檢測敏感性顯著降低，過高的包被濃度導(dǎo)致較高的假陽性率，最終確定JEVAg45 抗原與人IgG 抗體NC膜最佳使用濃度分別為1.2 與0.9 mg/mL。

1.6 膠體金快檢試紙條組裝

將玻璃纖維素膜用金標(biāo)記SPA 溶液浸泡，真空冷凍干燥后，制備金標(biāo)墊；在底襯板中間固定NC膜，一端貼吸水紙，另一端貼樣品墊，樣品墊下貼金標(biāo)墊，室溫下加干燥劑后密封保存。膠體金快檢試紙條成品如圖1 所示。

圖1 膠體金快檢試紙條成品

2 膠體金試紙條評估

2.1 方法

2.1.1 實驗毒株

JEV、黃熱病毒（yellow fever virus，YFV）、西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）、登革熱病毒1～4 型（Dengue virus type 1～4，DEV1-4）、基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）、辛德畢斯病毒（Sindbis virus，SINV）、蓋塔病毒（Getah virus，GETV）、羅斯河病毒（Ross River virus，RRV）、鷺山病毒（Sagiyama virus，SAGV）、西門利克森林病毒（Semliki Forest virus，SFV）、瑪雅羅病毒（Mayaro virus，MAYV）均由中國藥品生物制品檢定所引進，本研究室傳代保存。

2.1.2 標(biāo)本來源

12 例JE 患者血清標(biāo)本于2007—2009 年期間收集于廣州及周邊地區(qū)；20 例登革熱患者血清標(biāo)本于2014 年7—11 月收集于廣東省武警總隊醫(yī)院、解放軍第458 醫(yī)院（現(xiàn)南部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院）、解放軍第421 醫(yī)院（現(xiàn)陸軍第74 集團軍醫(yī)院）；6 例基孔肯雅熱患者血清標(biāo)本于2010 年收集于廣東省東莞市；1例黃熱病患者血清標(biāo)本收集于新疆地區(qū)。所有標(biāo)本均經(jīng)實驗室反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法確診。20 例陰性血清收集于健康體檢人群，經(jīng)實驗室檢測確診為JEV 抗體陰性。

2.1.3 多克隆抗體（以下簡稱“多抗”）制備

將JEV 及13 種相近蟲媒病毒C6/36 細(xì)胞培養(yǎng)物100 倍稀釋，按200 μL/只分別接種于3 日齡昆明乳鼠，待其規(guī)律發(fā)病后將鼠腦研磨、離心、取上清，分別用0.01 mol/L PBS 進行10 倍稀釋，按常規(guī)程序多點注射給免疫6～8 周齡昆明小鼠（300 μL/只），4 次免疫后在小鼠腹腔注射S180 細(xì)胞，3～5 d 后收集的腹水即為病毒多克隆抗體。利用免疫熒光法測定抗體效價后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 敏感性、特異性、穩(wěn)定性及臨床評估

用含2% BSA 的生理鹽水將JEV 多抗按1∶10～1∶5 120 進行稀釋，測定膠體金快檢試紙條的敏感性及穩(wěn)定性。將13 種相近蟲媒病毒多抗按1∶20 稀釋后作為參考樣品，并設(shè)置陰性血清對照，鑒定試紙條的特異性。采用以上血清標(biāo)本進行試紙條的臨床評估。

2.2 結(jié)果

2.2.1 膠體金快檢試紙條的敏感性及穩(wěn)定性

敏感性實驗表明，所制備試紙條在JEV 多抗1∶10～1∶640 稀釋條件下均能清晰顯示陽性結(jié)果（免疫熒光效價為1∶320），在1∶1 280 稀釋時陽性條帶不明顯（如圖2 所示），表明其具有較高的檢測敏感性與較大的檢測線性范圍。穩(wěn)定性實驗表明，采用3 個不同批次試紙條的檢測結(jié)果一致，表明該試紙條穩(wěn)定性較好。

圖2 膠體金快檢試紙條敏感性實驗結(jié)果

2.2.2 膠體金快檢試紙條的特異性

特異性實驗表明，所制備試紙條僅與JEV 多抗呈陽性反應(yīng)，與黃熱病毒、西尼羅河病毒、基孔肯雅病毒、登革熱病毒1～4 型、辛德畢斯病毒、瑪雅羅病毒、蓋塔病毒、鷺山病毒、羅斯河病毒、西門利克森林病毒等其他13 種相近蟲媒病毒多抗均無交叉反應(yīng)，表明該試紙條具有良好的特異性（如圖3 所示）。

圖3 膠體金快檢試紙條特異性實驗結(jié)果

2.2.3 膠體金快檢試紙條的臨床評估

膠體金快檢試紙條的臨床樣本評估結(jié)果表明，12 例JE 患者血清檢測結(jié)果均為陽性，20 例登革熱、1 例黃熱病、6 例基孔肯雅熱患者血清及20 例健康體檢者血清均為陰性。采用免疫熒光法對上述樣本進行檢測，檢測出陽性樣本12 例，陰性樣本47 例，制備的膠體金快檢試紙條與免疫熒光法的評估結(jié)果符合率為100%，表明所研制的試紙條具備較高的敏感性與特異性（見表1）。

表1 符合性試驗結(jié)果單位：例

3 討論

近年來，研究人員對JEV 檢測方法的研究多偏重于核酸檢測，但JE 患者病毒血癥持續(xù)時間短、病毒在腦脊液中的滴度較低以及病毒RNA 不穩(wěn)定性等因素，給JEV 的核酸檢測帶來困難[8-9]。同時，核酸檢測方法對設(shè)備和人力有較高要求，在基層衛(wèi)生單位實施起來有一定難度。目前，基于血清學(xué)的檢測方法仍是JE 臨床診斷的主要方法，其中，微量中和試驗是公認(rèn)的血清學(xué)檢測金標(biāo)準(zhǔn)，但操作復(fù)雜、耗時，而補體結(jié)合試驗、血凝抑制試驗等的特異性、敏感性較差，在臨床中已較少使用[10]。酶聯(lián)免疫吸附實驗因具有特異性強、敏感性高等優(yōu)勢而被廣泛采用。馬淑娟等[11]評估了3 種豬JEV 商品化IgG 抗體酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，結(jié)果表明其靈敏度介于41.94%～90.32%之間，特異度介于16.95%～79.66%之間，表明檢測質(zhì)量仍有待提高。

膠體金免疫層析技術(shù)操作簡單、快速，對操作人員、設(shè)備要求較低，非常適合基層大批量樣本的現(xiàn)場篩查[12]。田純見等[13]以豬JEV 標(biāo)準(zhǔn)株作為抗原，提出JEV 抗體的膠體金免疫層析檢測方法，經(jīng)評估和豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、Ⅱ型圓環(huán)病毒病等無免疫學(xué)交叉反應(yīng)。但在人群血清學(xué)檢測方面，JEV 隸屬黃病毒屬，該類病毒之間的序列相似度較高，相互之間存在嚴(yán)重的血清學(xué)交叉反應(yīng)，由于混合感染，患者體內(nèi)存在交叉抗體，采用全病毒抗原難以避免與登革熱等相近病毒的免疫學(xué)交叉反應(yīng)[13-14]，對診斷抗原的特異性要求較高，現(xiàn)階段市面上仍無成熟的用于人JE 診斷的膠體金快檢試劑盒銷售。為解決上述問題，本研究對JEV 抗原表位進行了較為系統(tǒng)的分析，在保證其免疫學(xué)反應(yīng)親和力的前提下，盡量縮短診斷用抗原長度，以減少非特異性反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，基于標(biāo)準(zhǔn)毒株、地方流行株及臨床標(biāo)本資源，對試紙條進行了詳細(xì)評估，結(jié)果表明試紙條具有良好的敏感性和特異性，可清晰檢測到按1∶640 稀釋的JEV 抗體，與所試的10 余種相近蟲媒病毒均無交叉反應(yīng)，與歷年來地方流行株抗血清均呈陽性反應(yīng)。本研究臨床評估階段中制備的膠體金試紙條與免疫熒光法檢測結(jié)果的符合率為100%。但收集的樣品數(shù)量較少，考慮到臨床中的大規(guī)模樣品檢測，故在接下來的實驗中應(yīng)增加臨床JEV 陽性樣本數(shù)，加強陽性質(zhì)控，實現(xiàn)試紙條的標(biāo)準(zhǔn)化，為快檢試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)，也為基層衛(wèi)生單位快速篩查診斷JE 提供新的技術(shù)手段。