游遨，肖吉，黃冬婷

（1.廣東輕工職業(yè)技術學院，廣東 廣州 510300；2.廣東省科學院生物與醫(yī)學工程研究所，廣東 廣州 510316；3.廣東省綠色制糖工程技術研究中心，廣東 廣州 510316）

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1），廣泛存在于自然界中，對人體、動物、植物、菌類和微生物均有重要的生理作用，主要影響生物體內黑色素的生成[1］。在正常生理作用下，黑色素的沉積對人體皮膚對抗紫外線的傷害具有重要意義，但是黑色素的過量生成將導致皮膚問題，諸如雀斑、黃褐斑、老年斑、黑色素瘤等[2］。由于酪氨酸酶是黑色素生成的關鍵酶，所以它成為了抑制黑色素生成的關鍵靶標，目前大多數(shù)美白化妝品中的關鍵成分均是酪氨酸酶抑制劑，主要分為熊果苷、曲酸、L-抗壞血酸（Vc）以及鞣花酸等（見圖1），熊果苷因其化學上的不穩(wěn)定性易分解為苯系化合物，對人體有潛在危害[3］，曲酸因其對人體有一定的致癌性而影響使用[4］，L-抗壞血酸（Vc）對熱敏感易分解而影響儲存及使用[5］，鞣花酸因其溶解度低而影響生物利用度[6］，國內外科研工作者致力于新型酪氨酸酶抑制劑的研發(fā)工作[7］。

圖1 四種常見的酪氨酸酶抑制劑

酪氨酸酶屬于多基因編碼蛋白，在不同生物體內表現(xiàn)出的化學結構及分子量均有差異，但是其活性中心基本一致，都是由His61、His85、His94、His259、His263、His294與兩個銅離子絡合構成[8］。近年來，酪氨酸酶抑制劑的研發(fā)工作普遍基于抑制劑與酪氨酸酶活性中心雙銅離子的配位作用開展，從而使得酪氨酸酶活性降低，達到抑制效果?；诖耍菊撐暮铣?4種含有氨基硫脲基團化合物，研究其對酪氨酸酶的抑制作用及構效關系。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

核磁共振儀為BrukerAVANCE400，溶劑CDCl3，DMSO-d6，內 標TMS；質 譜 儀 為LCMS-2010A；熔點儀為上海精密科學儀器有限公司W(wǎng)RS-1B數(shù)字熔點儀；旋轉蒸發(fā)儀為EYELA的N-1300V-WB；酶標儀為CMax Plus；磁力攪拌器為IKA的RH basic。

對羥基苯乙酮、乙酰氯丙酰氯、丁酰氯、異丁酰氯、戊酰氯、正己酸、正庚酸等均購置于麥克林試劑公司，氘代試劑（CDCl3，DMSO-d6）購置于阿拉丁試劑，蘑菇酪氨酸酶、L-多巴、測試用DMSO等試劑購置于西格瑪公司，其他常用試劑均購置于廣州試劑廠。

1.2 化合物的合成

化合物的合成路線如圖2所示。實驗采用簡單的酯化反應在對羥基苯乙酮的酚羥基位置引入不同結構、不同長度的親脂性基團，隨后在化合物苯乙酮的羰基位置引入氨基硫脲基團，最終獲得目標化合物。

圖2 目標化合物的合成（a： Et3N， CH2Cl2， RT， 30 min；b： CH3COOH， EtOH，80℃， 30 min）

化合物2a-2n的通用合成路徑：取3-羥基苯甲醛1.22g（10 mmol）于干燥兩口燒瓶中，加入15 mL干燥二氯甲烷作為溶劑，加入三乙胺1.2 g（12 mmol），攪拌使對羥基苯乙酮完全溶解，使用恒壓滴液漏斗滴加溶于10 mL二氯甲烷的乙酰氯（12 mmol），10分鐘左右滴完，反應30分鐘，TLC監(jiān)測，待反應完全，將反應液倒入去離子水中，取有機相分別使用去離子水、碳酸氫鈉溶液以及飽和食鹽水洗滌兩次，有機相使用無水硫酸鈉干燥，柱層析分離得3-乙酰氧基苯甲醛（2a）。同樣的方法獲得化合物2b-2n。

化合物3a-3n的通用合成路徑：取合成的化合物2a（5 mmol）于50 mL圓底燒瓶中，加入研磨成粉末的氨基硫脲（5.5 mmol），加入20 mL 無水乙醇作為溶劑，加入0.5 mL無水乙酸作為催化劑，加熱回流，TLC監(jiān)測，待化合物2a反應完全，將反應液置于冰箱冷藏過夜，過濾得到3-乙酰氧基苯甲醛縮氨基硫脲（3a），用稀鹽酸洗滌產物，用甲醇重結晶得純品?；衔?b-3n用同樣的方法獲得。

1.3 化合物活性測試

所得化合物對酪氨酸酶抑制活性測試：在1.5 mL的離心管中分別加入890 μL磷酸緩沖溶液（pH=6.8），以及不同濃度的20 μL化合物溶液（DMSO配制），最終溶液中DMSO的濃度為2%，然后加入10 μL酪氨酸酶溶液（用pH=6.8的磷酸緩沖溶液配制，0.5 mg/mL），搖勻，25℃恒溫水浴30 min。隨后加入80 μL的L-DOPA溶液（1.5 mg/mL），迅速搖勻，然后在25℃恒溫條件下測試溶液在475 nm下的光密度值（OD值）變化，測試時間1 min，扣除緩沖溶液對本實驗的影響。然后根據(jù)OD值增長直線求出其斜率，即酶活力值[9］。加入化合物后的酶活力值與未加入化合物的酶活力值之比為酶相對活力值，見式（1）：

IC50的計算方法：以不加入化合物的斜率值為100%，以加入化合物之后的酶相對活力值對化合物的濃度作圖，即得到化合物濃度-酶活力曲線，當酶的剩余活力為50%時，所對應的化合物濃度即為該化合物的IC50值。

1.4 化合物毒性測試

選擇對酪氨酸酶抑制活性最好的化合物3a，采用CCK-8方法進行化合物毒性測試。在96孔板中配置100 μL的293T細胞懸液，將96孔板置于37℃、5%二氧化碳條件下的培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24小時；向培養(yǎng)板中加入不同濃度的3a溶液（DMSO配置）10 μL，使化合物終濃度分別為31.25、62.5、125、250、500、1 000 μM，然后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時；向培養(yǎng)板每個孔加入CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱再培養(yǎng)4小時；用酶標儀測試培養(yǎng)板在 450 nm處的吸光度值，做5組平行試驗，進行數(shù)據(jù)處理。

2 數(shù)據(jù)分析

2.1 化合物結構鑒定

對所合成的化合物3a-3n分別進行結構鑒定，測試14種化合物的熔點、核磁氫譜、核磁碳譜以及質譜。結果如下：

化合物3a：3-乙酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，產物為白色固體，產率81%；m.p. 205.0～206.4； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.09 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.71 （s， 1H）， 7.59 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.44 （t， J = 7.8 Hz， 1H）， 7.15 （d， J = 6 Hz 1H）， 2.28 （s， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 169.61， 151.36， 141.57， 136.33， 130.19， 125.83， 123.71， 120.21， 21.30； ESI-MS m/z = 237.5 [M+H］+。

化合物3b：3-丙酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白色固體，產率78%；m.p. 193.3～193.9； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.10 （s， 1H）， 8.04 （s， 1H）， 7.70 （t， J = 1.9 Hz， 1H）， 7.64 - 7.56 （m， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.14 （d， J = 8.0， 1H）， 2.69 - 2.56 （m， 2H）， 1.15 （t， J = 7.5 Hz， 4H）， 13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 172.95， 151.39， 141.63， 136.29， 130.17， 125.75， 123.70， 120.21， 27.39， 9.29； ESI-MS m/z = 251.5 [M+H］+。

化合物3c：3-丁酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白色固體，產率73%；m.p. 165.0～165.5； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.25 （s， 1H）， 8.10 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.68 （t， J = 1.9 Hz， 1H）， 7.60 （d， J = 7.8 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.13 （d， J = 8.0 Hz， 1H）， 2.57 （t， J = 7.3 Hz， 2H）， 1.75 - 1.61 （m， 2H）， 0.98 （t， J = 7.4 Hz， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.55， 172.07， 151.33， 141.59， 136.33， 130.18， 125.80， 123.71， 120.21， 35.76， 18.31， 13.89； ESI-MS m/z = 265.5 [M+H］+。

化合物3d：3-異丁酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白色固體，產率79%；m.p. 181.0～181.8； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.50 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.10 （s， 1H）， 8.06 （s， 1H）， 7.67 （t， J = 1.9 Hz， 1H）， 7.64 - 7.57 （m， 1H）， 7.44 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.17 - 7.19 （m， 1H）， 2.89 - 2.76 （m， 1H）， 1.25 （d， J = 7.0 Hz， 6H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 175.41， 151.44， 141.64， 136.32， 130.19， 125.81， 123.65， 120.13， 33.80， 19.13； ESI-MS m/z = 265.5 [M+H］+。

化合物3e：3-戊酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白色固體，產率69%；m.p. 138.8～139.5； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.50 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.10 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.68 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.44 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.16 - 7.10 （m， 1H）， 2.58 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.69 - 1.59 （m， 2H）， 1.47 - 1.33 （m， 2H）， 0.92 （t， J = 7.3 Hz， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 172.21， 151.35， 141.60， 136.33， 130.19， 125.78， 123.70， 120.21， 33.66， 26.88， 22.08， 14.12； ESI-MS m/z = 279.5 [M+H］+。

化合物3f：3-己酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白 色 固 體，產 率72%；m.p. 133.2～134.5； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.25 （s， 1H）， 8.09 （s， 1H）， 8.05 （d， J = 2.4 Hz， 1H）， 7.68 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.44 （t， J = 7.8 Hz， 1H）， 7.13 （d， J = 7.9Hz， 1H）， 2.64 - 2.53 （m， 2H）， 1.71 - 1.57 （m， 2H）， 1.42 - 1.22 （m， 4H）， 0.97 - 0.78 （m， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 172.22， 151.36， 141.60， 136.34， 130.19， 125.79， 123.70， 120.22， 33.89， 31.09， 24.45， 22.28， 14.29； ESI-MS m/z = 293.3 [M+H］+。

化合物3g：3-庚酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白色固體，產率75%；m.p. 121.1～122.2； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.50 （s， 1H）， 8.27 （s， 1H）， 8.09 （s， 1H）， 8.04 （s， 1H）， 7.68 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.13 （d， J = 8.1， 1H）， 2.58 （t， J = 7.5 Hz， 2H）， 1.71 - 1.50 （p， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.42 - 1.20 （m， 6H）， 0.88 （t， J = 6.7 Hz， 3H）， 13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.55， 172.20， 151.34， 141.57， 136.33， 130.18， 125.77， 123.68， 120.21， 33.92， 31.39， 28.56， 24.73， 22.42， 14.37； ESI-MS m/z = 307.9 [M+H］+。

化合物3h：3-辛酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白 色 固 體，產 率68%；m.p. 141.8～142.8； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.51 （s， 1H）， 8.27 （s， 1H）， 8.09 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.12 （d， J = 8.0Hz， 1H）， 2.56 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.71 - 1.55 （m， 2H）， 1.40 - 1.19 （m， 8H）， 0.86 （t， J = 6.4 Hz， 3H）， 13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.56， 172.17， 151.34， 141.56， 136.33， 130.16， 125.72， 123.65， 120.22， 33.93， 31.59， 28.87， 24.78， 22.53， 14.40； ESI-MS m/z = 322.1 [M+H］+。

化合物3i：3-壬酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白 色 固 體，產 率66%；m.p. 144.2～145.4； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.09 （s， 1H）， 8.04 （s， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.8 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.12 （dd， J = 8.0， 2.3 Hz， 1H）， 2.57 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.70 - 1.57 （m， 2H）， 1.44 - 0.98 （m， 10H）， 0.86 （t， J = 6.6 Hz， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.56， 172.21， 151.34， 141.60， 136.32， 130.19， 125.75， 123.68， 120.21， 33.92， 31.70， 29.13， 29.01， 28.89， 24.76， 22.55， 14.42； ESI-MS m/z = 336.0 [M+H］+。

化合物3j：3-癸酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白色固體，產率68%；m.p. 132.9～134.4； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.50 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.08 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.12 （dd， J = 8.1， 2.2 Hz， 1H）， 2.57 （t， J = 7.5 Hz， 2H）， 1.70 - 1.57 （m， 2H）， 1.44 - 1.16 （m， 12H）， 0.92 - 0.79 （m， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.56， 172.18， 151.34， 141.58， 136.32， 130.16， 125.72， 123.65， 120.22， 33.93， 31.75， 29.32， 29.19， 29.13， 28.89， 24.77， 22.58， 14.41； ESI-MS m/z = 350.1 [M+H］+。

化合物3k：3-十一酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白色固體，產率59%；m.p. 125.3～125.7； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.51 （s， 1H）， 8.27 （s， 1H）， 8.08 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.66 （s， 1H）， 7.61 （d， J = 7.6 Hz， 1H）， 7.42 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.11 （d， J = 8.0 Hz， 1H）， 2.56 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.70 - 1.56 （m， 2H）， 1.42 - 1.13 （m， 15H）， 0.84 （t， J = 6.5 Hz， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 172.11， 151.34， 141.53， 136.34， 130.12， 125.67， 123.60， 120.23， 33.94， 31.81， 29.47， 29.40， 29.22， 28.93， 24.78， 22.60， 14.40； ESI-MS m/z = 364.1 [M+H］+。

化合物3l：3-十二酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白色固體，產率58%；m.p. 126.4～127.7； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.08 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 7.61 （d， J = 7.6 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.17 - 7.09 （m， 1H）， 2.57 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.72 - 1.58 （m， 2H）， 1.46 - 1.15 （m， 16H）， 0.86 （t， J = 6.5 Hz， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 172.18， 151.35， 141.57， 136.35， 130.17， 125.73， 123.65， 120.23， 33.94， 31.79， 29.49， 29.36， 29.20， 28.90， 24.77， 22.58， 14.42； ESI-MS m/z = 377.3 [M+H］+。

化合物3m：3-苯甲酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白色固體，產率88%；m.p. 207.9～209.3； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.53 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.17 （s， 1H）， 8.16 - 8.11 （m， 2H）， 8.10 （s， 1H）， 7.92 （t， J = 1.9 Hz， 1H）， 7.80 - 7.73 （m， 1H）， 7.67 - 7.59 （m， 3H）， 7.50 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.35 - 7.29 （m， 1H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.60， 165.06， 151.54， 141.49， 136.49， 134.58， 130.32， 130.27， 129.46， 129.30， 126.27， 123.80， 120.16； ESI-MS m/z = 299.4 [M+H］+。

化合物3n：3-苯乙酰氧基苯甲醛縮胺基硫脲，白色固體，產率86%；m.p. 131.1～132.0； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.50 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.10 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.69 （t， J = 2.0 Hz， 1H）， 7.63 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.48 - 7.27 （m， 6H）， 7.18 - 7.12 （m， 1H）， 3.99 （s， 2H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 170.53， 151.35， 141.61， 136.38， 134.22， 130.27， 130.02， 128.94， 127.53， 125.86， 123.58， 120.21， 40.55； ESIMS m/z = 313.1 [M+H］+。

2.2 化合物對酪氨酸酶抑制活性

我們分別測試了化合物3a - 3n對蘑菇酪氨酸酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)所合成的14種化合物中有12種對酪氨酸酶表現(xiàn)出較強的抑制效果，測試結果如表1所示。

表1 化合物3a - 3n對酪氨酸酶抑制的IC50值

測試結果顯示，所合成的14種3-酯基苯甲醛縮氨基硫脲衍生物中有12種化合物對酪氨酸酶表現(xiàn)出極強的抑制活性，其中有9種化合物活性優(yōu)于曲酸，8種化合物對酪氨酸酶的IC50值小于10 μM。由表1可以看出，當化合物中的羥基未被取代時，3-羥基苯甲醛縮氨基硫脲對酪氨酸酶的IC50值為3.9 μM[10］，在化合物中3-位引入酯基之后，化合物表現(xiàn)出的酪氨酸酶抑制活性獲得提升，最高達到1.1 μM，但是隨著引入的酯基鏈長逐漸增加，這類化合物對酪氨酸酶的抑制活性逐漸降低，由1.1 μM降低到大于 100 μM，可能是因為隨著化合物碳鏈的增長，化合物在水溶液中的溶解度降低，使得化合物的活性降低；同時碳鏈的增長可能導致整個化合物被碳鏈包裹，導致化合物活性降低。與4-酯基取代苯甲醛縮氨基硫脲衍生物相比較[11］，3-位與4-位取代化合物對酪氨酸酶的抑制活性基本一致。

2.3 化合物3a的細胞毒性

通過CCK-8方法測試了這類化合物中活性最好的化合物3a的細胞毒性，測試結果表明，這一化合物對293T細胞不表現(xiàn)出任何毒性（如圖3），這表明，這類化合物具備良好的應用價值。

圖3 化合物3a對293T細胞毒性測試結果

我們以未加入化合物3a時的細胞增殖數(shù)為1，加入不同濃度的化合物3a，使其終濃度為31.25、62.5、125、250、500、1 000 μM，經過培養(yǎng)之后，我們發(fā)現(xiàn)化合物3a不會殺死293T細胞，同時不會抑制293T細胞的增殖，證明化合物3a對293T細胞不表現(xiàn)出任何毒性，這類化合物擁有一定的應用價值。

3 結論

本論文中，我們設計合成了14種3-酯基苯甲醛縮氨基硫脲衍生物，測試了這些化合物對酪氨酸酶的抑制作用，大多數(shù)這類化合物對酪氨酸酶表現(xiàn)出強烈的抑制效果。同時，縮氨基硫脲基團的存在是這類化合物表現(xiàn)出酪氨酸酶抑制活性的關鍵基團，在這類化合物中引入適當?shù)挠H脂性基團對這類化合物的活性提升具備積極作用。細胞毒性測試實驗結果表明，這類化合物對細胞沒有毒性，表明這類化合物具備了一定的應用價值。