◎ 王 樂，陳 佳，秦 麗

（1.張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 張家口 075000；2.石家莊學(xué)院 化工學(xué)院，河北 石家莊 050035；3.河北省知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)中心，河北 石家莊 050000）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 屬李斯特氏菌屬，革蘭氏陽性桿菌，是常見的食源性致病菌。該菌廣泛存在于自然界，很容易污染食品[1]。該菌具有嗜冷的特性，可在低氧條件和冷藏環(huán)境溫度下生長，能在加工廠和家庭冰箱內(nèi)長時(shí)間存活[2]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有較強(qiáng)的致病性，是一種人畜共患病的病原菌，感染后可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等癥狀，對于免疫力低下人群感染后病死率可達(dá)20%～30%[3]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織食品安全工作計(jì)劃列為重點(diǎn)監(jiān)測的食源性致病菌之一，也是我國食源性致病菌監(jiān)測網(wǎng)中的常規(guī)檢測項(xiàng)目[4]。各地進(jìn)行的調(diào)查也顯示我國不同地區(qū)的食品存在不同程度的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染情況。廣州市市售食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出率為1.45%[5]，大理州為2.99%[6]，寶雞市為8.49%[7]。該菌公共健康危害極為嚴(yán)重，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中必須加以重視。

目前，對于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測方法應(yīng)用最廣泛的是依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》 （GB 4789.30—2016）的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和免疫金標(biāo)法[8]、生物傳感器法[9]、核酸探針法[10]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）[11]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法[12]以及可視化跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增[13]的快速檢測方法。這些檢驗(yàn)方法都需要使用高選擇性的富集培養(yǎng)基來促進(jìn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在競爭背景菌群中的生長，以得到相對豐度較高的目標(biāo)菌體。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌雖然在自然界中廣泛存在，但食品中該菌一般含量較低，且受到加工損傷，不利于后續(xù)檢驗(yàn)[14]。李氏增菌肉湯（LB1）為選擇性增菌液體培養(yǎng)基，含有萘啶酮酸，廣譜抗菌，尤其對革蘭氏陰性桿菌的抑制生長能力明顯[15]。但單純的選擇性富集培養(yǎng)基可能不利于損傷的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌恢復(fù)。因此，對于受到非致死性損傷的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌需要高營養(yǎng)的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行恢復(fù)。

丙酮酸鈉有助于受損細(xì)胞的修復(fù)[16]。酵母浸膏中富含蛋白質(zhì)、氨基酸類、肽類、核苷酸、B族維生素和微量元素，能夠補(bǔ)充氮源和提供微生物生長的多種維生素、氨基酸及生長因子[17]。本研究的目的是通過優(yōu)化富集培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉和酵母浸膏含量，達(dá)到縮短檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌時(shí)間的目的。這將在保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度的前提下使食品安全預(yù)警時(shí)間點(diǎn)前移，大大提高監(jiān)督工作效率和監(jiān)督力度，切實(shí)保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

本研究中使用的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（CICC21583）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試劑與儀器

酵母浸膏，美國BD公司；磷酸鹽緩沖液、血瓊脂、李氏增菌肉湯（LB1）及平板計(jì)數(shù)瓊脂，北京路橋技術(shù)股份有限公司；丙酮酸鈉（99%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×PCR Master Mix，天根生化科技北京有限公司；引物及探針，生工生物工程上海股份有限公司。

二級生物安全柜，Synergy HTX；多功能酶標(biāo)儀，Synergy HTX；恒溫培養(yǎng)箱，pHCbi；ME4002E電子天 平，梅特勒-托利多；3K15冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；LightCycler 480II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國羅氏診斷有限公司。

1.3 菌懸液的制備

將-80 ℃保存的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CICC21583加入無菌磷酸鹽緩沖液中，挑取菌懸液劃線接種于血瓊脂平板上，36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單個(gè)典型菌落再次接種于血瓊脂平板上進(jìn)行傳代。挑取活化好的單菌落接種于磷酸鹽緩沖液中，振蕩均勻，將菌懸液的麥?zhǔn)蠞岫瓤刂圃?.5～0.6。對上述菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取3個(gè)連續(xù)梯度的100 μL菌懸液接種于平板計(jì)數(shù)瓊脂上，36 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。每個(gè)梯度做3個(gè)平行，取平均值。菌懸液的濃度為 1.5×107CFU·mL-1。

1.4 丙酮酸鈉添加量的優(yōu)化

為探究丙酮酸鈉添加量對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的增菌效果影響，以李氏增菌肉湯（LB1）為基礎(chǔ)，分別添加終濃度為0 g·L-1、1 g·L-1、2 g·L-1和3 g·L-1的丙酮酸鈉，分裝10 mL于滅菌后的試管中。將1 mL 1.3中適宜稀釋倍數(shù)的菌懸液接種至添加不同濃度丙酮酸鈉的李氏增菌肉湯（LB1）培養(yǎng)基?？瞻着囵B(yǎng)基作為對照，和接種后的培養(yǎng)基同時(shí)放入30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 酵母浸膏添加量的優(yōu)化

在得到最優(yōu)丙酮酸鈉添加量后，以添加一定含量丙酮酸鈉的李氏增菌肉湯（LB1）為基礎(chǔ)，分別添加終濃度為0 g·L-1、5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1和20 g·L-1的酵母浸膏，分裝10 mL于滅菌后的試管中。將1 mL 1.3中適宜稀釋倍數(shù)的菌懸液接種至添加不同濃度酵母浸膏的李氏增菌肉湯（LB1）培養(yǎng)基?？瞻着囵B(yǎng)基作為對照，和接種后的培養(yǎng)基同時(shí)放入30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.6 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌OD550值的測定

培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h和24 h后，分別用酶標(biāo)儀測量550 nm波長下空白培養(yǎng)基和菌懸液的OD550值。以O(shè)D550值的大小衡量單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生物量的多少，得到丙酮酸鈉和酵母浸膏的最佳添加量。

1.7 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證

同時(shí)吸取1 mL菌懸液，10倍梯度稀釋后接種在平板計(jì)數(shù)瓊脂上，36 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光PCR法的特異性驗(yàn)證

采用試劑盒法對培養(yǎng)一定時(shí)間后的改良李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液進(jìn)行DNA模板的提取，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法驗(yàn)證其特異性。試驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)置陽性對照（單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌懸液基因組DNA），陰性對照（其他菌菌懸液基因組DNA）和空白對照（無菌水）。

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌所用引物和探針為：上游引物5’-CATGGCACCACCAGCATC-3’；下游引物5’-CATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’；探針5’ -FAM-CCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAECLIPCE-3’；內(nèi)標(biāo)探針5’-HEX-ATAGGAGCACTC GCCGCCCACATC-ECLIPCE-3’。最終反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液2 μL；dNTP Mixture（10 mmol·L-1） 1.6 μL；上下游引物各0.4 μL；探針0.6 μL；內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒探針0.6 μL；Taq DNA聚合酶0.4 μL；DNA模板 1 μL；去離子水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃， 4 min；95 ℃，5 s；65 ℃，20 s；45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酮酸鈉添加量優(yōu)化結(jié)果

在李氏增菌肉湯（LB1）的基礎(chǔ)上添加丙酮酸鈉確實(shí)能夠提升對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的增菌效果，但這種積極影響只停留在添加量為1 g·L-1時(shí)。如圖1所示，當(dāng)丙酮酸鈉的添加量繼續(xù)增加時(shí)，不但沒有促進(jìn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的增加，反而抑制了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長。當(dāng)丙酮酸鈉添加量為1 g·L-1時(shí)，可以觀察到0～2 h的延遲期，這相比于未改良的李氏增菌肉湯（LB1）的4 h延遲期得到了縮短。在2 h之后，開始進(jìn)入對數(shù)生長期，生長曲線的斜率明顯加大，直至20 h。20 h后單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長進(jìn)入靜止期。

2.2 酵母浸膏添加量優(yōu)化結(jié)果

在同一接種水平下，優(yōu)化增菌液成分后的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長情況明顯好于未改良增菌液中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。如圖2所示，在丙酮酸鈉添加量為1 g·L-1的基礎(chǔ)上優(yōu)化酵母浸膏的添加量，隨著酵母浸膏添加量的增大，增菌效果逐漸提升。添加量為20 g·L-1時(shí)增菌效果均優(yōu)于添加量為15 g·L-1，但增菌效果并未得到明顯提升。因此，在增菌效果與成本的綜合考慮下，酵母浸膏的最優(yōu)添加量為15 g·L-1。 最終改良增菌液的優(yōu)化結(jié)果為：在商品化李氏增菌肉湯（LB1）的基礎(chǔ)上，添加1 g·L-1的丙酮酸鈉，15 g·L-1的酵母浸膏。

2.3 平板計(jì)數(shù)測定的驗(yàn)證結(jié)果

不同丙酮酸鈉和酵母浸膏添加量的李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液平板計(jì)數(shù)測定結(jié)果與OD550值的變化趨勢基本相同，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的活菌數(shù)隨時(shí)間增加呈現(xiàn)上升的趨勢。未改良的李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液中，0～4 h處于延遲期，4～20 h進(jìn)入對數(shù)生長期，20 h后進(jìn)入靜止期，24 h內(nèi)未進(jìn)入衰亡期。最終改良李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液，0～2 h為延遲期，2～20 h為對數(shù)生長期，20 h后進(jìn)入靜止期，24 h之前沒有出現(xiàn)衰亡期。不同培養(yǎng)時(shí)間下改良李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液OD550值如表1所示。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間下改良李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液OD550值表

2.4 培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

在李氏增菌肉湯（LB1）的基礎(chǔ)上，添加1 g·L-1丙酮酸鈉時(shí)，培養(yǎng)16 h后即可達(dá)到未改良李氏增菌肉湯（LB1）培養(yǎng)24 h的菌懸液OD550值，培養(yǎng)時(shí)間縮短了8 h。在此基礎(chǔ)上，添加酵母浸膏進(jìn)一步優(yōu)化增菌液成分，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為8 h時(shí)，就已經(jīng)達(dá)到未改良增菌液培養(yǎng)24 h的效果，增菌時(shí)間縮短了2/3。

2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR法的特異性驗(yàn)證結(jié)果

將新鮮培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌使用改良李氏增菌肉湯（LB1）培養(yǎng)8 h后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。如圖3所示，添加1 g·L-1丙酮酸鈉、15 g·L-1酵母浸膏的改良李氏增菌肉湯（LB1）對食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌特異性良好，可以實(shí)現(xiàn)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的特異性增菌。

3 結(jié)論與討論

食品安全一直是事關(guān)民生的國家大事，也是各國普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。其中，食源性致病菌更是食品安全問題的核心。因此，能夠更快速、準(zhǔn)確地檢測出食品中的食源性致病菌就顯得至關(guān)重要。

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在李氏增菌肉湯（LB1）中添加1 g·L-1的丙酮酸鈉和15 g·L-1的酵母浸膏能夠有效提高單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌懸液濃度，縮短前增菌所需時(shí)間。應(yīng)用改良后的前增菌培養(yǎng)液，在培養(yǎng)8 h后即可達(dá)到使用未改良前增菌培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h的效果，檢測時(shí)間大幅度縮短，即縮短了食源性致病菌的檢測周期，為食品安全監(jiān)管部門和重大食品安全事件預(yù)警提供了技術(shù)支撐。