閆春霞，趙 曼，寶音陶格濤，趙一安，祁 智

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/牧草與特色作物生物學(xué)教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；3.張家口市農(nóng)村合作經(jīng)濟經(jīng)營管理站，河北張家口 075000）

刈割是通過人為干擾對草地進行利用和管理的方式之一。相對于放牧，刈割可以選擇性地移除植物地上部分或全部生物量，適度刈割能夠緩解枯草在草地上的積累效應(yīng)，同時也能抑制草地群落中優(yōu)勢物種的競爭性生長，使得競爭能力差的物種有機會進行繁殖和生長，從而提高草原生態(tài)的植物多樣性與物種豐富度[1-5]。有學(xué)者研究表明，連續(xù)刈割群落的多度高于隔年刈割，但群落平均高度、蓋度以及地上生物量等都低于隔年刈割[5]。肖紅等[6]研究表明，刈割顯著降低了羊草和無芒雀麥的地上現(xiàn)存量，在生長季降水少的干旱年份，第2 次刈割會嚴重抑制羊草和無芒雀麥的再生和碳水化合物的貯藏，建議1年刈割1 次[6]。

羊草（Leymus chinensis）是內(nèi)蒙古草原廣泛分布的優(yōu)質(zhì)禾本科牧草，作為一種重要的牧草資源，其富含維生素、礦物質(zhì)，粗蛋白含量高，適口性良好，產(chǎn)量高，耐踐踏，對發(fā)展草原畜牧業(yè)具有重要的經(jīng)濟和社會意義[7-8]。除作飼草外，羊草根莖穿透侵占能力很強，能形成強大的根網(wǎng)，盤結(jié)固持土壤作用很大，是很好的水土保持植物[9]。天然羊草草原是內(nèi)蒙古的主要草原類型，也是我國北方的天然生態(tài)屏障和重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地。在內(nèi)蒙古的廣大牧區(qū)，為使牲畜安全過冬，每年都要從天然草原割取大量的牧草以備冬春補飼。由于長期刈割和放牧利用，羊草草原生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分大量輸出，群落結(jié)構(gòu)嚴重失調(diào)，草地逐年退化沙化，水土流失加劇，生態(tài)環(huán)境日益惡化，對我國生態(tài)安全造成了嚴重的威脅[10]。因此，探索更加科學(xué)合理的刈割與放牧方式，是解決我國天然羊草草原當前生態(tài)環(huán)境惡化問題的關(guān)鍵。

Ca、Fe、Zn 是植物生長發(fā)育必需的礦物質(zhì)元素，Ca2+參與維持細胞壁、細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，同時是細胞內(nèi)重要的第二信使，被鈣調(diào)素感受并形成復(fù)合物后，會結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子，進而調(diào)控下游靶基因，響應(yīng)各種非生物和生物脅迫的信號傳導(dǎo)以及參與調(diào)控生物體的生長發(fā)育過程[11-12]。Fe2+/Fe3+能夠參與DNA復(fù)制[13]、葉綠素生物合成、呼吸、光合作用等過程，同時也是電子傳遞鏈等多種酶促反應(yīng)中的輔助因子[14-15]。Zn2+是RNA 聚合酶、超氧化物歧化酶、乙醇脫氫酶和碳酸酐酶等多種酶的活化劑，參與碳水化合物、脂肪、核酸和蛋白質(zhì)的合成與代謝[16]。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，在植物體內(nèi)主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)存在，結(jié)合態(tài)指多肽和蛋白質(zhì)。植物組織中游離氨基酸僅占氨基酸總量的2%左右，但對植物的生長至關(guān)重要。游離氨基酸不僅是植物重要的氮源，而且可以維持植物的代謝平衡，能夠在干旱、冷害、重金屬污染等逆境脅迫下靈敏地響應(yīng)環(huán)境壓力，從而保證植物的正常生長[17-18]。

本研究通過對不同刈割頻率下天然羊草草原羊草葉中Ca、Fe、Zn 及氨基酸含量的測定與分析，確定刈割是否會對草地內(nèi)羊草的Ca、Fe、Zn 以及氨基酸含量產(chǎn)生影響，探索天然羊草草原最適合的刈割頻率，從而為遏制草原生態(tài)環(huán)境惡化、保護草原生態(tài)安全提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗樣地

試驗樣地位于內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟白音錫勒牧場的中國科學(xué)院內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)定位研究站，地理坐標為43°30′～48°30′N，113°30′～116°42′E。該地區(qū)屬于溫帶草原氣候，羊草為主要優(yōu)勢種，群落組成為“羊草+大針茅+糙隱子草”[19-21]。

1.2 刈割試驗設(shè)計

刈割試驗于2001年開始，2019年結(jié)束，連續(xù)19年對樣地草原羊草進行不同頻率的刈割。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，5 個處理：“000”不刈割（CK）、“101”刈割1年休1年、“110”刈割2年休1年、“111”1年刈割1 次、“222”1年刈割2 次。每個處理4 次重復(fù)，重復(fù)數(shù)分別歸類為Block 1、Block 2、Block 3、Block 4，小區(qū)面積為10 m×10 m。不同刈割頻率試驗設(shè)計見圖1a，試驗區(qū)實際情況見圖1b。不同刈割頻率的時間設(shè)定和刈割后留茬高度參考鮑雅靜等[22]的方法，“101”“110”“111”的刈割時間為每年的8月16日，“222”的刈割時間為每年的6月23日和9月12日，刈割后羊草的留茬高度為6 cm。

圖1 刈割試驗設(shè)計及試驗區(qū)情況

1.3 取樣

2019年7月在干燥無雨天氣，6 h 內(nèi)對不同刈割頻率試驗小區(qū)內(nèi)的羊草進行集中取樣。取樣時在每個小區(qū)內(nèi)設(shè)置5 個1 m×1 m 的樣方，選取株高一致的羊草，齊地面剪取全部地上生長部分。

1.4 Ca、Fe、Zn 含量測定

Ca、Fe、Zn 含量的測定方法參照WANG 等[23]的方法。具體步驟為：（1）如1.3 中所述，將收集到的羊草成苗，每株作為1 個樣本。（2）每個樣本先用0.5 mmol/L CuSO4·5H2O 清洗3 次，然后用去離子水漂洗3 次。105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重。（3）將樣品研磨成粉末并充分混勻，用分析天平稱取10 mg（精確到0.000 1 g），記錄數(shù)據(jù)。（4）將樣品粉末放入5 mL 離心管，加入3 mL 5% HNO3，渦旋混勻。（5）將樣品置于37 ℃搖床內(nèi)，250 r/min 處理48 h。4 ℃，2 200g，離心30 min，取上清液到2 mL 的離心管中。4 ℃，15 000g，離心30 min，再提取上清液至2 mL 的離心管中，作為待測液備用。（6）利用電感耦合等離子體發(fā)射儀（ICP-OES，德國耶拿PQ9000），對待測樣品中的Ca、Fe、Zn 含量進行測定。

1.5 氨基酸種類及其含量測定

1.5.1 氨基酸種類

試驗測定了不同刈割頻率下羊草葉中14 種氨基酸的含量，其名稱及縮寫見表1。

表1 14 種氨基酸的名稱及縮寫

為了便于比較及直觀分析，按照“000”條件下測定的羊草葉中氨基酸含量的高低，將羊草干物質(zhì)中氨基酸含量≥0.3 μg/mg 劃分為大量氨基酸，含量在0.1～0.3 μg/mg 劃分為中量氨基酸，含量＜0.1 μg/mg劃分為微量氨基酸。

1.5.2 氨基酸含量測定方法

參照張金林等[24]的方法，具體步驟為：（1）如1.3 中所述，將收集到的羊草成苗，每株作為1 個樣本。（2）每個樣本先用0.5 mmol/L CuSO4·5H2O 清洗3 次，然后用去離子水漂洗3 次。105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重，將樣品研磨成粉末并充分混勻。（3）準確稱取10 mg 樣品粉末（精確到0.000 1 g），加入1 mL 蒸餾水和1 mL 8%的磺基水楊酸。（4）將樣品渦旋振蕩15 min，4 ℃，10 000g，離心20 min，取上清液至2 mL 的離心管中，作為待測液備用。（5）用日立L-8900 型全自動氨基酸分析儀測定氨基酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同刈割頻率對羊草葉中Ca、Fe、Zn 含量的影響

由圖2 和表2 可知，與“000”相比，刈割頻率為“101”時，羊草葉中Ca 含量提高1.2%，但二者無顯著差異（P＞0.05）；刈割頻率為“110”“111”“222”時，羊草葉中Ca 含量分別提高了13.6%、21.8%、11.8%，差異顯著（P＜0.05）。由圖2 可知，與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Fe、Zn 含量差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同刈割頻率下Ca 含量變化值 單位：%

圖2 不同刈割頻率羊草葉中Ca、Fe、Zn 含量

2.2 不同刈割頻率對羊草葉中氨基酸含量的影響

2.2.1 大量氨基酸含量變化

由圖3a 和表3 可知，與“000”相比，刈割頻率為“101”“110”的羊草葉中Ala 含量差異不顯著（P＞0.05）；刈割頻率為“111”和“222”的Ala 含量顯著降低（P＜0.05），“111”降低28.8%、“222”降低27.2%。與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Ser 含量均顯著降低（P＜0.05），“101”降低35.0%、“110”降低24.0%、“111”降低22.0%、“222”降低33.0%。與“000”相比，刈割頻率為“101”“110”“111”的羊草葉中Val 含量差異不顯著（P＞0.05）；刈割頻率為“222”的Val 含量顯著降低，為34.5%（P＜0.05）。

2.2.2 中量氨基酸含量變化

由圖3b 和表3 可知，與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Leu 含量均顯著增加（P<0.05），“101”增加38.0%、“110”增加44.0%、“111”增加66.0%、“222”增加53.0%。與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Arg 含量均顯著增加（P<0.05），“101”增加32.0%、“110”增加36.0%、“111”增加40.0%、“222”增加28.0%。不同刈割頻率羊草葉中Phe、His、Lys、Glu 含量差異均不顯著（P>0.05）。

2.2.3 微量氨基酸含量變化

由圖3c 和表3 可知，與“000”相比，刈割頻率為“101”“110”“111”的羊草葉中Cys 含量顯著增加（P<0.05），“101”增加49.5%、“110”增加41.9%、“111”增加52.0%；“000”與“222”差異不顯著（P>0.05）。

表3 不同刈割頻率羊草葉中14 種氨基酸含量變化值 單位：%

圖3 不同刈割頻率羊草葉中氨基酸含量

與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Tyr 含量顯著降低（P<0.05），“101”降低46.0%、“110”降低37.0%、“111”降低34.0%、“222”降低15.0%。與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Ile 含量顯著降低（P<0.05），“101”降低19.0%、“110”降低18.0%、“111”降低36.0%、“222”降低37.0%。與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Met 含量顯著降低（P<0.05），“101”降低35.0%、“110”降低24.0%、“111”降低29.0%、“222”降低35.0%。不同刈割頻率羊草葉中Gly 含量差異不顯著（P>0.05）。

2.2.4 14 種氨基酸總量變化

由表4 可知，與“000”相比，“101”“110”“111”刈割頻率下的羊草葉中14 種氨基酸總量分別上升了30.95%、40.19%、33.76%；“222”刈割頻率下的羊草葉中14 種氨基酸總量下降了99.76%。

表4 不同刈割頻率羊草葉中14 種氨基酸總量變化值 單位：%

3 討論與結(jié)論

試驗結(jié)果表明，與“000”（不刈割）相比，當刈割頻率為“101”（刈割1年休1年）時，羊草葉中Ca 含量無顯著變化（P>0.05）；而“110”（刈割2年休1年）、“111”（1年刈割1 次）、“222”（1年刈割2 次）這3 種刈割頻率下羊草葉中Ca 含量顯著增加（P<0.05）。仲延凱等[25-27]研究發(fā)現(xiàn)，刈割會促進羊草根、葉中Ca含量增加，這與本研究結(jié)果相符。植物補償生長是造成Ca 含量增加的主要原因，而刈割強度是決定植物補償生長的一個關(guān)鍵因素。由于刈割后植物的葉面積減少，光合作用以及碳、氮的吸收和同化過程減弱，植物體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)被動員起來以實現(xiàn)最優(yōu)化分配[28-29]，根系大量吸收水分、無機鹽，通過再生長補償去除的組織[30-31]，從而導(dǎo)致羊草葉中Ca 含量增加。本研究中，不同刈割頻率羊草葉中Fe、Zn 含量差異不顯著（P>0.05），這可能是由于刈割處理會促進根系大量吸收水分及無機鹽，在此過程中，Ca 與Fe、Zn 產(chǎn)生吸收競爭[32]，從而使得羊草葉中Fe、Zn的積累不明顯。

本研究表明，刈割后羊草葉中Leu、Arg、Cys（“222”除外）含量顯著增加（P<0.05），Ser、Tyr、Ile、Met 含量顯著降低（P<0.05），Ala 含量在“111”和“222”時顯著降低（P<0.05），Val 含量在“222”時顯著降低（P<0.05），而Phe、His、Lys、Glu 和Gly 的含量變化不大（P>0.05）。張海娜等[33]研究發(fā)現(xiàn)，檸條在刈割后的萌蘗株葉和根中Arg、Asp、Ser、Val、Tyr、Phe、His、Pro、Ala、Met 等的含量均有不同程度提高。田靈芝[34]研究發(fā)現(xiàn)，刈割-施氮后小黑麥中飼237 草中的Leu、Met 和Lys 含量增加。石蕾等[35]研究發(fā)現(xiàn)，通過剪葉處理，興安落葉松針葉內(nèi)Ile、Phe 的含量提高，而Asp、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Val 和Leu 的含量均有不同程度的下降。本研究中羊草刈割后氨基酸含量變化與上述研究結(jié)果有相同之處，也有一些不符，這可能是由于不同研究中所用的試驗材料、刈割方式、試驗地生態(tài)環(huán)境不同導(dǎo)致氨基酸的變化規(guī)律不相同。

高等植物生長過程中需要不斷利用氨基酸合成蛋白質(zhì)和其他有機氮化物，因此，游離氨基酸不會在體內(nèi)過多積累，由于不同氨基酸在植物生長中的作用不同，某種氨基酸含量的提高是植物有機體對其需求增大的一種表現(xiàn)[36]。MATTHEW 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，Leu 具有信號傳導(dǎo)的功能，能夠誘導(dǎo)許多逆境脅迫響應(yīng)基因的表達。本研究中，刈割后羊草葉中Leu 含量上升，推測可能是由于刈割脅迫下，植物體需要促進Leu 合成代謝，提高Leu 水平，進而誘導(dǎo)大量逆境響應(yīng)基因的表達，使植物啟動逆境響應(yīng)[38]；刈割后羊草葉中Arg 含量上升，這可能是由于刈割后的植物需要大量的氮素進行補償性生長，而Arg 是氮素的重要儲存形態(tài)，并且能夠合成二胺促進細胞分裂[39]，植物體內(nèi)Arg 含量提高，進而促進植物的補償性生長；刈割后羊草葉中Cys 含量上升，可能是由于刈割對植物造成刈割脅迫，使得植物在逆境條件下，需要啟動葉片內(nèi)抗氧化系統(tǒng)及其防御機制，而Cys 在植物抗氧化以及氧化還原反應(yīng)的調(diào)控中起著重要的作用[40]，刈割后羊草葉中Cys 含量提高，以響應(yīng)逆境脅迫。

有研究表明，植物能承受的刈割強度是有一定限度的，如果刈割強度達到植物能維持正常生長的極限，植物表現(xiàn)出等補償生長[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，與“000”相比，刈割頻率為“101”時，羊草葉中Ca 含量差異不顯著；刈割頻率為“110”“111”“222”時，羊草葉中Ca 含量差異顯著，分別提高了13.6%、21.8%、11.8%。刈割頻率為“101”“110”“111”“222”時，14 種氨基酸總量分別提高了30.95%、40.19%、33.76%以及降低了99.76%。由此可知，在4 種刈割頻率下羊草葉中Ca 含量“111”最高，“110”次之；14 種氨基酸總量“110”最高，“111”次之。本試驗結(jié)果說明，在“111”（1年刈割1 次）和“110”（刈割2年休1年）刈割頻率下，植物處于等補償生長點，能夠表現(xiàn)出最大的等補償生長效應(yīng)。對于天然羊草草原，1年刈割1 次和刈割2年休1年都是較為科學(xué)合理的刈割方式。