李欣怡，孫雪梅，付 燦，岳鵬鵬，于鴻浩，李 勇

(桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541199)

CRISPR系統(tǒng)是從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的天然免疫系統(tǒng)，當(dāng)病毒入侵時，該系統(tǒng)可改變外來基因組，以保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞免受外來基因侵害。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)變化來的，使用CRISPR/Cas9技術(shù)可進(jìn)行基因定向敲除、插入操作。與傳統(tǒng)技術(shù)比較，其優(yōu)勢在于設(shè)計構(gòu)建較為簡單、操作簡易、成本低、編輯效率高、可同時打靶多個基因等。基于CRISPR/Cas9的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，對人類產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，有利于推動醫(yī)藥、育種等領(lǐng)域的快速發(fā)展[1-2]。

威爾遜病(WD)的全球患病率約為1/30 000，致病基因攜帶率約為1/90，在中國比較常見，是由銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型三磷酸腺苷(ATP)酶基因突變引起[3]。WD的臨床特點(diǎn)是代謝損傷會導(dǎo)致銅在各種組織(主要是肝臟和大腦)中的有毒積累，從而導(dǎo)致復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，如神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、肝硬化惡化、腎臟損傷、角膜色素環(huán)和其他癥狀[4-5]，嚴(yán)重危害人類健康。本研究通過NCBI ClinVar等數(shù)據(jù)庫比對分析，發(fā)現(xiàn)c.2333G>T(p.Arg778Leu)突變是中國人群突變的熱點(diǎn)[6-7]，故使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)穩(wěn)定編輯小鼠ATP7B基因c.2333G>T位點(diǎn)(p.Arg778Leu)，建立高效、可模擬人ATP7B致病突變的小鼠ATP7B CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，為進(jìn)一步構(gòu)建小鼠ATP7B基因突變動物模型奠定基礎(chǔ)，也對精準(zhǔn)模擬WD、深入理解WD的致病機(jī)制及探索可行的治療策略具有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α購于北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；小鼠腦神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞由廣州大學(xué)周建奎博士惠贈；pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin (addgene#51133)和Cas9表達(dá)質(zhì)粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(addgene#44758)均由上?？萍即髮W(xué)黃行許教授惠贈。T載體(pMDTM19-T Vector Cloning Kit)購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.1.2試劑及儀器 TransDirect?Animal Tissue PCR Kit(AD201-01)購于北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒(CW2105)購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA純化回收試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；TaKaRa TaqTM(R001A)、Premix Taq均購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Bsa Ⅰ購于NEB公司；Lipo fectamineTM3000 Transfection Reagent(InvitrogenTM)試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、殺稻瘟霉素和嘌呤霉素均購于賽默飛世爾科技公司；引物合成及DNA測序由北京擎科生物科技有限公司完成。實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器包括超凈工作臺、臺式離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀、低溫冷凍離心機(jī)、恒溫?fù)u床等。

1.2方法

1.2.1擬編輯位點(diǎn)的確定與sgRNA的設(shè)計 利用OMIM在線數(shù)據(jù)庫篩查人ATP7B基因的功能失活突變，共篩查到25個突變位點(diǎn)(表1)；為更廣泛地篩查ATP7B致病突變，利用C1inVar數(shù)據(jù)庫檢索拼接位點(diǎn)突變的致病情況，發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)多達(dá)300多個(表2)[8]。據(jù)研究可知，人ATP7B基因突變有明顯的地域性，通過相關(guān)文獻(xiàn)，找到在我國出現(xiàn)、明確、典型的致病突變，最終確定了人ATP7B.2333G>T(p.Arg778Leu)為擬突變位點(diǎn)。利用Ensembl數(shù)據(jù)庫查詢?nèi)薃TP7B和小鼠ATP7B基因的結(jié)構(gòu)，從Ensembl數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出小鼠ATP7B基因序列，利用Vector NTI軟件定位c.2333G> T位點(diǎn)序列，在其附近設(shè)計基因打靶位點(diǎn)，設(shè)計3個單向?qū)NA(sgRNA)序列。

1.2.2sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計好3個sgRNAs后，在各序列的5′端上添加ACCG合成正鏈，然后在其對應(yīng)互補(bǔ)鏈的5′端上添加AAAC合成相應(yīng)負(fù)鏈。將正負(fù)鏈退火得到黏性末端雙鏈DNA片段。退火反應(yīng)體系為：ddH2O 8 μL；正負(fù)鏈各5 μL(10 μmol/L)，T7 Endonuclease I buffer 2 μL(10×)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃>85 ℃，共10個循環(huán)(每個循環(huán)降低1 ℃)；85 ℃>25 ℃，共60個循環(huán)(每個循環(huán)降低1 ℃)，-20 ℃保存。利用BsaⅠ酶對pGL3-U6-sgRNA載體進(jìn)行酶切，得到產(chǎn)物pGL3-U6-sgRNA-BsaⅠ。連接酶切產(chǎn)物pGL3-U6-sgRNA-BsaⅠ和sgRNA的正負(fù)鏈退火后得到的具有黏性末端的雙鏈DNA片段，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(DH5α)中，并涂布于LB固體培養(yǎng)基(氨芐抗性)，在37 ℃環(huán)境下過夜培養(yǎng)18 h。用槍頭在培養(yǎng)基上挑取單克隆，采用引物U6(通用)進(jìn)行測序，鑒定陽性克隆。利用去內(nèi)毒素中提試劑盒(CW2105 WBIO)提取出陽性克隆子的質(zhì)粒，即pGL3-U6-ATP7B-sgRNA重組質(zhì)粒。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選 復(fù)蘇小鼠N2a細(xì)胞，將之接種于DMEM完全培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)，在5% CO2、37 ℃設(shè)定的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換培養(yǎng)基，持續(xù)觀察細(xì)胞狀態(tài)。當(dāng)其匯合度達(dá)到75%～85%時，用0.25%胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行消化處理并傳代至6孔板中，細(xì)胞懸液按比例分配，繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h，對比觀察細(xì)胞形態(tài)、生長狀況。當(dāng)每孔內(nèi)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。利用LipofectamineTM3000 Transfection Reagen試劑盒將pST1374-NLS-flag-linker-Cas9質(zhì)粒和相應(yīng)的pGL3-U6-ATP7B-sgRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染小鼠N2a細(xì)胞，轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。培養(yǎng)24 h后將轉(zhuǎn)染液換成完全培養(yǎng)基，同時加入5 μg/mL嘌呤霉素和10 μg/mL殺稻瘟菌素進(jìn)行藥篩60 h，藥篩后得到了陽性的sgRNA-Cas9共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

表1 OMIM數(shù)據(jù)庫中的ATP7B基因致病突變情況

1.2.4打靶位點(diǎn)處DNA的PCR擴(kuò)增及測序、TA克隆 將藥篩得到的陽性共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行裂解，收集細(xì)胞裂解液，以細(xì)胞裂解液為模板對打靶位點(diǎn)處的目的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：細(xì)胞裂解液2 μL，上下游引物各1 μL；dNTP Mixture 2 μL，TaKaRa Ex Taq 1 μL、10×Ex Taq Buffer 2.5 μL；滅菌水加至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s(共35個循環(huán))；72 ℃ 5 min，16 ℃無限時間。上述上游引物序列為5′-GGC AAG CGA CCC AGC AAG AAC C-3′，下游引物序列為 5′-TGC AGG CTG CCA GGA AAC TTC G-3′。擴(kuò)增所得產(chǎn)物外送測序。將上步所得的PCR產(chǎn)物膠回收，得到的回收產(chǎn)物與pMDTM19-T載體連接，反應(yīng)體系為：PMD19載體0.5 μL；Solution Ⅰ 2.5 μL；PCR純化產(chǎn)物40 ng；加水補(bǔ)充至5 μL，16 ℃孵育1 h，得到連接產(chǎn)物。將所得產(chǎn)物快速轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，涂布于具有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素濃度為50 μg/mL)表面，37 ℃過夜培養(yǎng)20 h后，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)驗(yàn)證。根據(jù)電泳結(jié)果初步判斷陽性克隆，再外送測序(Sanger)鑒定。

1.2.5打靶位點(diǎn)的基因型分析 針對打靶位點(diǎn)處的DNA序列與野生型DNA序列進(jìn)行比對分析，在sgRNA3靶點(diǎn)位置發(fā)生了堿基的隨機(jī)插入和缺失，記錄每種改變情況并計算編輯效率。編輯效率=測序結(jié)果在打靶位點(diǎn)處發(fā)生堿基變化數(shù)/送測總數(shù)。

表2 ClinVar數(shù)據(jù)庫中WD的ATP7B錯義突變情況

2 結(jié) 果

2.1sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功 根據(jù)sgRNA符合5′-N(21)GG的原則，在ATP7B基因的打靶位點(diǎn)處設(shè)計3條sgRNAs，分別是sgRNA1(5′-TCA TGT GTT TTG AAT ATT GA-3′)、sgRNA2(5′-GCA TGC CGT CTA TTC TTA GT-3′)、sgRNA3(5′-GGA AAT ATA GGC CAA CTC CC-3′)。pGL3-U6-ATP7B-sgRNA 重組質(zhì)粒的測序峰圖(圖1)中，選中部分為sgRNA的編碼序列，與設(shè)計的3條sgRNAs一致，證明sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。pGL3-U6-ATP7B-sgRNA重組質(zhì)粒的凝膠電泳圖，見圖2。

A、B、C分別為pGL3-U6-ATP7B-sgRNA1、pGL3-U6-ATP7B-sgRNA2和pGL3-U6-ATP7B-sgRNA3質(zhì)粒的測序峰圖。

M、C、G1、G2、G3分別為Marker、Cas9、pGL3-U6-Galt-sgRNA1、pGL3-U6-Galt-sgRNA2和pGL3-U6-Galt-sgRNA3。

2.2獲得sgRNA-Cas9陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞 將pGL3-U6-ATP7B-sgRNA質(zhì)粒和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染小鼠N2a細(xì)胞，按照1.2.3方法成功篩選出sgRNA-Cas9陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這些陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)過藥篩作用后仍然正常生長，見圖3。

A、B、C分別為藥篩60 h后sgRNA1-Cas9、sgRNA2-Cas9和sgRNA3-Cas9陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞圖。

2.3sgRNA3導(dǎo)向序列打靶成功 將收集的陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解后作為模板，按照1.2.4方法進(jìn)行打靶位點(diǎn)處DNA的PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果(圖4)顯示，擴(kuò)增條帶清晰，片段大小也在預(yù)期的550 bp左右，可用于后續(xù)測序分析。測序峰圖顯示，只有sgRNA3靶點(diǎn)序列出現(xiàn)明顯套峰(圖5)，初步說明sgRNA3導(dǎo)向序列打靶成功，靶位點(diǎn)發(fā)生了基因編輯；sgRNA1和sgRNA2靶點(diǎn)序列未出現(xiàn)明顯套峰，說明這2個導(dǎo)向序列打靶不成功、靶位點(diǎn)未發(fā)生基因編輯或編輯效率較低。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)只針對sgRNA3導(dǎo)向序列分析打靶效率。

M代表相對分子質(zhì)量；NC表示野生型，G1、G2和G3分別為sgRNA1-Cas9、sgRNA2-Cas9和sgRNA3-Cas9轉(zhuǎn)染型。

圖5 sgRNA3打靶位點(diǎn)DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序峰圖

2.4sgRNA3打靶效率評價 按照1.2.5方法，利用TA克隆將sgRNA3靶位點(diǎn)DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體上，通過菌落PCR初篩陽性克隆(圖6)，將陽性克隆子測序分析得到sgRNA3打靶位點(diǎn)的基因型(表3)。基因型分析結(jié)果顯示，送測的克隆子部分發(fā)生了基因編輯，既有插入突變也有缺失突變，sgRNA3導(dǎo)向序列可以介導(dǎo)Cas9蛋白高效、特異性地切割靶點(diǎn)DNA，實(shí)現(xiàn)對小鼠ATP7B基因的編輯，編輯效率為53.85%[(4+1+2)/13]。

表3 sgRNA3靶點(diǎn)基因型分析

M代表Marker；1～15代表TA克隆的菌落序號。

3 討 論

WD患者如不能及時進(jìn)行積極治療，至晚期則因嚴(yán)重肝硬化、肝功能衰竭或并發(fā)感染而死亡[9]。在1948年以前，WD因無有效療法，病程大多為3～4年。WD的發(fā)病率為1/100 000～1/30 000，在中國較多見，且多見于青少年[10]。目前，已有學(xué)者建立人ATP7B轉(zhuǎn)基因大鼠模型，并對轉(zhuǎn)基因大鼠體內(nèi)的表達(dá)分析進(jìn)行研究[11]。當(dāng)前的醫(yī)療手段并不能完全治愈WD，只能通過長期控制飲食、服用藥物來維持體內(nèi)酮含量水平正常[12-15]。目前，大部分WD相關(guān)研究仍然集中在蛋白分析或臨床研究上，少見有關(guān)基因突變細(xì)胞模型、動物模型建立的相關(guān)研究，這在很大程度上制約了國內(nèi)WD研究的進(jìn)一步深入[16]。

本研究主要通過使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在N2a中穩(wěn)定編輯ATP7B基因，建立WD致病突變的細(xì)胞模型，為其分子機(jī)制的更深入研究與基因治療打下前期基礎(chǔ)。本研究基因型分析結(jié)果顯示，部分克隆子發(fā)生了基因編輯，sgRNA3導(dǎo)向序列能夠介導(dǎo)Cas9蛋白對目標(biāo)DNA的高效特異性切割，編輯效率為53.85%，但sgRNA1和sgRNA2沒能有效結(jié)合Cas9蛋白完成基因編輯，作者推測可能是這2種預(yù)設(shè)的sgRNA不能有效介導(dǎo)Cas9蛋白切割基因組，以后可能通過優(yōu)化sgRNA設(shè)計解決[17]，亦可嘗試使用保真度更高的核酸酶替代[18]。

本研究采用TA克隆方法分析基因型和敲除效率，此方法檢測快速，對樣品數(shù)量要求低，但使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)也面臨許多挑戰(zhàn)，例如非目標(biāo)效應(yīng)或DNA的大量破壞和重排，如果修復(fù)不當(dāng)，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的突變會誘導(dǎo)異常發(fā)育等[19-20]。仍然需要進(jìn)一步開展對CRISPR/Cas9靶向ATP7B非目標(biāo)效應(yīng)相關(guān)研究。

綜上所述，本研究成功采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行小鼠ATP7B基因的細(xì)胞水平編輯，編輯效率為53.85%，這為更深入開展WD的分子機(jī)制研究和疾病干預(yù)奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。