許偉辰,羅子宸,何鈺,狄留慶,郭青,單進(jìn)軍

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所,江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023;2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210019;3.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程中心，江蘇 南京 210023)

桔梗是桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC的干燥根,性平,味苦、辛,歸肺經(jīng),具有宣肺、利咽、祛痰和排膿的功效[1]。桔梗中化學(xué)成分以皂苷類為主,現(xiàn)代研究表明,桔梗中皂苷類成分具有多種藥理作用,如桔梗皂苷D具有抗炎[2]、降脂[3]和保肝[4]作用;遠(yuǎn)志皂苷D與去芹糖桔梗皂苷D具有抗癌作用[5-6]等。目前《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定桔梗按干燥品計(jì)算,桔梗皂苷D含量不得少于0.10%[1]，但單一以桔梗皂苷D為含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)無法滿足桔梗質(zhì)量控制要求。桔梗分布廣泛,南北皆有產(chǎn)出,主產(chǎn)于安徽、河南、河北和內(nèi)蒙等地[7]。桔梗產(chǎn)地與其質(zhì)量密切相關(guān),現(xiàn)皆以南桔梗(即華東產(chǎn)區(qū))為較優(yōu)品種[8]。皂苷由于缺乏共軛體系,紫外吸收差,因此常使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)進(jìn)行含量測(cè)定[9]。Lu等[10]收集了11省(市)23個(gè)地區(qū)的桔梗樣品,采用HPLC-ELSD法建立了桔梗指紋圖譜,確定了19個(gè)共有峰,但該檢測(cè)方法依賴對(duì)照品。液相色譜聯(lián)用高分辨質(zhì)譜儀作為檢測(cè)工具,檢測(cè)物質(zhì)時(shí)不受紫外吸收的限制,同時(shí)能給出物質(zhì)的精準(zhǔn)分子質(zhì)量、二級(jí)碎片離子圖譜進(jìn)行匹對(duì)鑒定物質(zhì),從而提高了檢測(cè)物質(zhì)的通量。

本實(shí)驗(yàn)以秦嶺-淮河為分界線劃分桔梗的南、北產(chǎn)地,通過收集9個(gè)省(市)57批桔梗藥材,采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS對(duì)其中皂苷成分進(jìn)行鑒定及LC-MS/MS對(duì)其中10種皂苷成分進(jìn)行定量,通過比較皂苷譜的差異對(duì)南北產(chǎn)地的桔梗藥材加以區(qū)分,以期為桔梗藥材質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LTQ Orbitrap XL型串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司),TSQ Vantage型串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司),UltiMate 3000型超高效液相色譜(美國(guó)Thermo Fisher公司),CPA225D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司),Allegra 64Rcentrifuge型離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司),KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),Millipore Synergy型超純水系統(tǒng)(德國(guó)Merck公司)。

1.2 試劑

桔梗皂苷D(批號(hào):J-013120826)、桔梗皂苷D2(批號(hào):19070306)、去芹糖桔梗皂苷D(批號(hào):19070307)、去芹糖桔梗皂苷D2(批號(hào):19070308)、遠(yuǎn)志皂苷D(批號(hào):170623)均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;桔梗皂苷E(批號(hào):P06M10S81977)、桔梗皂苷D3(批號(hào):P28M8F32837)、3-O-β-葡萄糖苷-桔梗皂苷元(批號(hào):P27A9560106)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;去芹糖桔梗皂苷E(批號(hào):FY37239B0234)購(gòu)自南通飛宇生物科技有限公司;去芹糖桔梗皂苷D3(批號(hào):PB0761)購(gòu)自成都普思生物科技有限公司;瓜子金皂苷V(批號(hào):DST190302-016)購(gòu)自成都德斯特生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈(色譜純,德國(guó)Merk);甲酸(色譜純,美國(guó)ROE);水為超純水,其他試劑為分析純。

1.3 藥材

收集安徽、河南、陜西、四川等產(chǎn)地共57批藥材,經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院首席研究員黃璐琦鑒定為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC的根。根據(jù)秦嶺-淮河線分為南桔梗和北桔梗,詳見表1。

表1 桔梗樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 液質(zhì)條件

UPLC-LTQ-Orbitrap-MS色譜條件:Hypersil Gold-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm);流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，梯度洗脫：0～1 min(21%B),1～9 min(21%～23%B),9～15 min(23%B),15～25 min(23%～23.5%B),25～28 min(23.5%～40%B),28～29.5 min(40%～90%B),29.5～31 min(90%B),31～32 min(90%～21%B),32～35 min(21%B);流速0.3 mL·min-1;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

UPLC-LTQ-Orbitrap-MS質(zhì)譜條件:ESI離子源,負(fù)離子模式掃描,m/z掃描范圍120～1 600,氣化管溫度350 ℃,鞘氣壓力45 Arb,輔氣壓力10 Arb,毛細(xì)管溫度270 ℃,噴霧電壓負(fù)離子5 000 V,管狀透鏡電壓100 V,毛細(xì)管電壓-35 V。

LC-MS/MS色譜條件:Hypersil Gold-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm);流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，梯度洗脫：0～5 min(22%～28%B),5～9 min(28%～80%B),9～10 min(80%B),10～11 min(80%～22%B),11～14 min(22%B);流速0.3 mL·min-1;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

LC-MS/MS質(zhì)譜條件:ESI離子源,多反應(yīng)監(jiān)測(cè),負(fù)離子模式掃描,氣化管溫度350 ℃,鞘氣壓力45 Arb,輔氣壓力25 Arb,毛細(xì)管溫度270 ℃,噴霧電壓負(fù)離子3 200 V;各化合物的具體參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜條件

2.2 樣品溶液的制備

精密稱定0.2 g桔梗樣品,粉碎過篩(3號(hào)篩),精密加入水4 mL(含內(nèi)標(biāo)100 μg·mL-1),超聲處理60 min(300 W,40 kHz),取上清18 000 r·min-1離心10 min后0.22 μm濾膜過濾,UPLC-LTQ-Orbitrap-MS進(jìn)樣分析,取10 μL加50%甲醇稀釋至200 μL后LC-MS/MS進(jìn)行定量分析,樣品的提取離子流圖見圖1。

QC的制備:吸取各批次樣本提取液10 μL后混合均勻,18 000 r·min-1離心10 min后0.22 μm濾膜過濾,UPLC-LTQ-Orbitrap-MS進(jìn)樣分析。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D2、去芹糖桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D2、桔梗皂苷D3、桔梗皂苷E、遠(yuǎn)志皂苷D和3-O-β-葡萄糖苷-桔梗皂苷元的對(duì)照品適量,加入50%甲醇溶解,得到質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品貯備液。分別精密吸取各對(duì)照品溶液適量混勻,取10 μL加入50%甲醇180 μL,渦旋混勻,配制成桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D2、去芹糖桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D2、桔梗皂苷D3、桔梗皂苷E、遠(yuǎn)志皂苷D和3-O-β-葡萄糖苷-桔梗皂苷元質(zhì)量濃度分別為15.586、13.014、1.060、4.500、11.097、7.141、22.500、33.251、4.225、0.130 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液,混合對(duì)照品的提取離子流圖見圖1。

圖1 樣品和混合對(duì)照品的提取離子流圖譜

2.4 皂苷成分鑒定分析結(jié)果

按“2.1”項(xiàng)下的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣,得到負(fù)離子模式下的TIC圖,根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量、離子碎片及文獻(xiàn)確定皂苷化合物共3種母核結(jié)構(gòu)(桔梗皂苷型、遠(yuǎn)志皂苷型、桔梗二酸型)及48個(gè)成分,相關(guān)結(jié)果見圖2～3和表3。

表3 桔梗負(fù)離子模式下的皂苷化合物的鑒定

圖2 負(fù)離子模式下總離子流圖

2.5 LC-MS/MS方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 采用倍半稀釋法配制成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品系列溶液,結(jié)果見表4。

圖3 皂苷化合物母核結(jié)構(gòu)

表4 線性關(guān)系結(jié)果

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL,加入甲醇90 μL稀釋混勻,18 000 r·min-1離心10 min后取上清進(jìn)樣,進(jìn)樣體積為5 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次。按“2.1”項(xiàng)的LC-MS/MS條件測(cè)得桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D2、去芹糖桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D2、桔梗皂苷D3、桔梗皂苷E、遠(yuǎn)志皂苷D和3-O-β-葡萄糖苷-桔梗皂苷元的RSD分別為3.3%、2.2%、2.6%、2.1%、4.4%、1.9%、3.8%、3.4%、1.8%和4.3%,表明本實(shí)驗(yàn)所用的儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 稱取桔梗樣品(AH6),按“2.3”項(xiàng)中的供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備,室溫放置,分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h進(jìn)行測(cè)定,按“2.1”項(xiàng)的LC-MS/MS條件測(cè)得桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D2、去芹糖桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D2、桔梗皂苷D3、桔梗皂苷E、遠(yuǎn)志皂苷D和3-O-β-葡萄糖苷-桔梗皂苷元的RSD分別為4.3%、3.8%、3.7%、4.5%、2.3%、3.7%、4.5%、5.9%、4.5%和7.0%,結(jié)果表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批次(AH6)桔梗樣品6份,按“2.3”項(xiàng)中的供試品溶液的制備方法,平行處理,并按“2.1”項(xiàng)的LC-MS/MS條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D2、去芹糖桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D2、桔梗皂苷D3、桔梗皂苷E、遠(yuǎn)志皂苷D和3-O-β-葡萄糖苷-桔梗皂苷元的RSD分別為2.8%、4.8%、6.4%、3.8%、4.8%、5.5%、3.6%、4.8%、4.9%和7.9%,結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱取桔梗樣品粉末0.2 g,精密稱定,加入一定量的混合對(duì)照品溶液,按“2.3”項(xiàng)中的供試品溶液的制備方法處理,并按“2.1”項(xiàng)的LC-MS/MS條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D2、去芹糖桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D2、桔梗皂苷D3、桔梗皂苷E、遠(yuǎn)志皂苷D和3-O-β-葡萄糖苷-桔梗皂苷元的回收率分別為102.1%、101.0%、96.9%、102.0%、102.9%、98.3%、103.4%、104.2%、102.2%和101.1%,RSD值為2.9%、4.5%、5.4%、3.9%、4.9%、4.5%、4.5%、4.4%、2.7%和6.9%。

2.6 樣品測(cè)定

57批樣品按“2.3”項(xiàng)進(jìn)行制備,按“2.1”項(xiàng)的LC-MS/MS條件進(jìn)行含量測(cè)定,測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 樣品中10種皂苷成分含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1,n=2)

2.7 不同產(chǎn)地桔梗藥材測(cè)定結(jié)果分析

為了全面研究皂苷譜,將所有樣品混合得到QC,根據(jù)QC樣本的皂苷譜對(duì)所有樣本中的桔梗皂苷進(jìn)行鑒定和比對(duì)。將57批桔梗藥材皂苷譜成分定性結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件,通過主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)進(jìn)行聚類分析,得到桔梗南北產(chǎn)地聚集情況。從圖4A可見每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本,大部分點(diǎn)分布在95%置信區(qū)間內(nèi),顯示南北桔梗藥材聚集情況,發(fā)現(xiàn)皂苷譜有明顯差異,2者間有明顯區(qū)分,QC樣本較為集中,表明儀器穩(wěn)定性較好;圖4B中OPLS-DA得分圖的R2=0.7,Q2=0.728,表明數(shù)學(xué)模型的區(qū)分度與預(yù)測(cè)性較好,同時(shí)圖4C中1 000次的Permutation結(jié)果顯示OPLS-DA模型未過擬合,表明模型具有可靠性。根據(jù)圖4B構(gòu)建的OPLS-DA模型計(jì)算各變量的VIP值,并以VIP>1.0及P<0.05初步篩選差異物質(zhì),見表6,并對(duì)差異物質(zhì)進(jìn)行熱圖聚類分析,結(jié)果見圖5,紅色代表強(qiáng)度上升,藍(lán)色代表強(qiáng)度下降。

注:N.北桔梗;S.南桔梗

表6 桔梗差異皂苷成分

注:N.北桔梗;S.南桔梗

2.8 不同產(chǎn)地桔梗藥材含量測(cè)定結(jié)果分析

如圖6所示,靶標(biāo)定量結(jié)果顯示,桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、遠(yuǎn)志皂苷D和去芹糖桔梗皂苷D2的含量在南北桔梗中存在顯著差異,南桔梗均顯著高于北桔梗,差異皂苷結(jié)果與UPLC-LTQ-Orbitrap-MS測(cè)定結(jié)果相符,其余6種皂苷在南北產(chǎn)地中未見有顯著差異。

注：N.北桔梗;S.南桔梗;與北桔梗組比較,*P<0.05。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過收集不同產(chǎn)地的57批桔梗藥材,以秦嶺-淮河為分界線劃分桔梗的南北產(chǎn)地,對(duì)其中皂苷類成分進(jìn)行分析,結(jié)果表明南北產(chǎn)地桔梗皂苷譜可明顯區(qū)分,并找到23個(gè)差異性皂苷成分,并對(duì)其中部分皂苷使用LC-MS/MS進(jìn)行靶標(biāo)定量驗(yàn)證分析,桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、遠(yuǎn)志皂苷D及去芹糖桔梗皂苷D2靶標(biāo)定量結(jié)果顯示南桔梗中含量顯著高于北桔梗,與UPLC-LTQ-Orbitrap-MS測(cè)定結(jié)果相一致。

皂苷是植物中的次生代謝產(chǎn)物,其形成與含量積累是一個(gè)復(fù)雜的過程,與生長(zhǎng)環(huán)境等密切關(guān)聯(lián)[21]。Zhao等[22]對(duì)桔梗皂苷D及遠(yuǎn)志皂苷D等桔梗皂苷對(duì)脂肪酶的抑制作用進(jìn)行了探究,發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D抑制能力強(qiáng)于遠(yuǎn)志皂苷D。目前對(duì)于桔梗中皂苷成分的藥效研究以桔梗皂苷D和桔?？傇碥諡橹?對(duì)其他單一皂苷成分的藥理作用未有較多研究,本課題組對(duì)中藥桔梗的質(zhì)量標(biāo)志物曾進(jìn)行初步分析,發(fā)現(xiàn)皂苷類成分是其發(fā)揮效用的關(guān)鍵成分,可劃入質(zhì)量標(biāo)志物候選之中[23]。藥典所規(guī)定的單一以桔梗皂苷D成分為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無法全面評(píng)價(jià)桔梗藥材的質(zhì)量,因此需要盡可能增加有效成分的含量測(cè)定以進(jìn)一步完善藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)有必要對(duì)桔梗中除桔梗皂苷D以外的皂苷成分進(jìn)行研究,探究其藥理作用。