馮一帆,吳勵萍,張祎盈,錢大瑋,段金廒,宋孝雄,呂高虹,朱悅,許惠琴

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心,江蘇 南京 210023;3.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

糖尿病以高血糖為特征,伴有微血管、大血管并發(fā)癥如糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、心血管疾病等,會導(dǎo)致糖尿病患者失明、腎衰竭甚至死亡[1-2]。1型糖尿病約占所有糖尿病患者的5%～10%,胰島素抵抗在1型糖尿病的流行病學(xué)和代謝研究中已經(jīng)被證實(shí)和量化[3-6]。

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病屬于“消渴病”范疇,發(fā)病機(jī)制為氣陰兩虛,燥熱傷津。糖尿病發(fā)病初期以氣、血、痰、火、濕、食六郁為主,病位多在肝脾。臨床常用中藥有黃芪、丹參、山茱萸、枸杞子等,入脾、肝經(jīng)[7]。故中醫(yī)對糖尿病的論治可從肝入手,以清熱養(yǎng)陰,活血益氣為治法。杞丹方具有滋陰清熱、補(bǔ)氣活血的功效,全方由枸杞子、黃芪、桑葉、山茱萸、丹參組成。方中的枸杞子、黃芪、桑葉、山茱萸、丹參藥材均具有一定的降血糖作用[8-12]。研究表明IRS-1/PI3K/AKT是調(diào)控血糖的主要信號通路,該通路異常是糖尿病發(fā)生的重要原因[13-14]。故本實(shí)驗(yàn)以IRS-1/PI3K/AKT信號通路為切入點(diǎn),采用四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型,觀察杞丹方降血糖作用,為其臨床療效提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性ICR小鼠,體質(zhì)量22～24 g,由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK(浙)2019-0001。實(shí)驗(yàn)動物均用全價顆粒飼料喂養(yǎng),由南京江寧區(qū)協(xié)同中心提供。溫度:19～24 ℃;濕度:48%～67%。動物實(shí)驗(yàn)通過南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審查,倫理號:202105A026，實(shí)驗(yàn)過程符合動物倫理規(guī)范。

1.2 藥材

枸杞子LyciumbarbarumL.(17200522,寧夏)、黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao(22200365,甘肅)、桑葉MorusalbaL.(20201201,江蘇)、山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.(229200206,河南)、丹參SalviamiltiorrhizaBge.(20210401,山東)購自亳州市紫銳藥業(yè)有限公司,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定,各項(xiàng)檢查均符合《中國藥典》2020年版要求。

1.3 藥品與試劑

四氧嘧啶(批號:4457780),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;鹽酸二甲雙胍(批號:ABV0983),中美上海施貴寶制藥有限公司;檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(批號:Y-231566),上海源葉生物科技有限公司; 多聚甲醛(批號: XS191316),武漢賽維爾生物科技有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色液(批號:G1005),上海頤昌生物科技有限公司;SYBR Green PCR試劑盒(批號:#K0223)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:#K1622)、Trizol(批號:1596-026)、BCA蛋白定量試劑盒(批號:PICPI23223),美國 Thermo Fisher Scientific公司;RIPA組織細(xì)胞快速裂解液(批號:R0020),北京索萊寶科技有限公司;ECL 試劑盒(批號:WBKLS0100),美國 Millipore公司;p-PI3K抗體(批號：20584-1-AP)、PI3K抗體(批號:67071-1-Ig)、p-AKT抗體(批號:66444-1-Ig)、AKT抗體(批號:60203-2-Ig)、GLUT4抗體(批號:66846-1-Ig)、IRS-1抗體(批號:17509-1-AP),美國 Proteintech公司;p-IRS-1抗體(批號：ab109543)、β-actin抗體(批號:ab8226),英國 Abcam公司;小鼠胰島素(批號:ml001983),上海酶聯(lián)生物科技有限公司;無水乙醇(批號:100092680)、氯仿(批號:10023419)、異丙醇(批號:80109218),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

樣品制備:按黃芪16份、枸杞子8份、桑葉6份、山茱萸10份、丹參3份比例稱取藥材,20%乙醇加熱提取3次,合并濾液,靜置4 h后濾過,濾液濃縮后,經(jīng)干燥處理,制得干浸膏樣品(1 g干浸膏粉相當(dāng)于6 g生藥量),給藥前干浸膏樣品用超純水充分溶解, 即配即用。

1.4 儀器

AE240型十萬分之一電子分析天平,MS105型萬分之一電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);DF-100型粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司);Milli-Q型純水儀(美國Millipore公司);KQ-250E超聲清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);拜安康contour TS血糖儀(德國BAYER公司);R540小動物麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);JB-P5包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);DS-U3成像系統(tǒng)(日本Nikon公司);Real-time PCR檢測儀(美國 Thermo Fisher公司);低溫冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司);電動勻漿機(jī)(上海弗魯克科技公司);MK3芬蘭雷勃酶標(biāo)儀(美國 Thermo Fisher公司);SynergyHT酶標(biāo)儀(美國Bio-Tik公司);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

取SPF級ICR雄性小鼠,禁食16 h后腹腔注射四氧嘧啶120 mg·kg-1,5 d后禁食12 h測血糖,血糖值在10～25 mmol·L-1為糖尿病造模成功。選糖尿病模型動物50只,分為5組,即模型組、二甲雙胍組、杞丹方低劑量組、杞丹方中劑量組、杞丹方高劑量組,每組10只。另選正常小鼠10只為空白組。二甲雙胍組小鼠按0.25 g·kg-1劑量給予鹽酸二甲雙胍片溶液灌胃;杞丹方低、中、高劑量組小鼠分別按0.34、0.67、1.34 g·kg-1劑量給予杞丹方溶液灌胃;模型組和空白組小鼠灌胃給予同等體積蒸餾水。各組每天給藥1次,連續(xù)給藥30 d。

2.2 一般體征及空腹血糖(FBG)變化

每組小鼠每10 d記錄1次體質(zhì)量和1次FBG。

2.3 葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)

給藥30 d后小鼠禁食8 h,給予葡萄糖溶液(2 g·kg-1)灌胃,分別檢測0、30、120 min 的血糖值,作圖并計算曲線下面積(AUC),得到口服糖耐量值。

2.4 血清胰島素水平

將小鼠眼眶取血,離心,取上清(血清),按照ELISA試劑盒說明書，用多功能酶標(biāo)儀檢測吸光度,計算含量。

2.5 HE染色

取固定的胰腺、肝臟組織,進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、染色、封片等步驟,完成操作后將切片放置顯微鏡下拍照,觀察其形態(tài)特征。

2.6 Western blot檢測肝臟組織關(guān)鍵蛋白的表達(dá)

冰上將肝臟組織剪成細(xì)小的碎片,按每20 mg組織加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液,勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,取上清,進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,根據(jù)蛋白定量結(jié)果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液,沸水浴10 min后離心取上清上樣。冷卻后-20 ℃保存。SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,加入BSA(0.5 g·L-1)4 ℃過夜。次日,用PBST洗膜4次,每次15 min。分別加入二抗,室溫孵育2 h后,再用PBST洗膜4次,每次15 min,ECL顯色。以β-actin作為內(nèi)參,利用Image J軟件分析IRS-1、p-IRS-1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和GLUT4蛋白的灰度值,進(jìn)行計算定量。

2.7 qPCR檢測關(guān)鍵蛋白mRNA水平

采用Trizol一步法提取小鼠肝臟組織中總RNA,取2 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)。按試劑盒說明建立體積為20 μL的PCR反應(yīng)體系,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL、SYBR Green Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL。檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列為表1所示。

表1 PCR引物序列

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠一般體征觀察

空白組小鼠狀態(tài)良好,毛色鮮亮,毛發(fā)順滑,活動靈敏迅速。模型組小鼠毛色暗淡,毛發(fā)凌亂,活動遲緩,攝食量、攝水量明顯增加。杞丹方各劑量組與模型組比較，毛色毛發(fā)情況、攝食量、攝水量有所改善。體質(zhì)量測量結(jié)果表明:與空白組相比，模型組小鼠體質(zhì)量減輕(P<0.01),杞丹方各劑量組與模型組相比體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異,見圖1。

注:與空白組比較,##P<0.01?！纒,n=10。

3.2 各組小鼠FBG水平比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，模型組小鼠FBG水平升高,與空白組相比有顯著性差異(P<0.01);給藥第10天,各給藥組FBG水平出現(xiàn)降低,至第30天,杞丹方中、高劑量組，二甲雙胍組與模型組相比FBG水平均顯著降低(P<0.01)。

注:與空白組比較,##P<0.01; 與模型組比較,

3.3 各組小鼠OGTT結(jié)果比較

各組血糖值結(jié)果顯示,在30 min時,血糖達(dá)到峰值,空白組在120 min時血糖恢復(fù)正常血糖水平,其余各組血糖均未恢復(fù)正常血糖水平。OGTT結(jié)果顯示，模型組小鼠糖耐量升高,與空白組小鼠糖耐量相比有顯著性差異(P<0.01);杞丹方中、高劑量組，二甲雙胍組與模型組相比均顯著降低(P<0.01)。見圖3。

注:與空白組比較,##P<0.01; 與模型組比較,

3.4 各組小鼠血清胰島素水平比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,模型組血清胰島素水平下降,與空白組相比有顯著性差異(P<0.01);杞丹方各劑量組與模型組相比,血清胰島素水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。

注:與空白組比較,##P<0.01; 與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01?！纒,n=10。

3.5 各組小鼠胰腺組織病理變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5顯示，空白組胰腺組織正常,胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,胞膜清晰。模型組胰腺組織異常,胰腺組織中可見腺泡細(xì)胞排列松散,脫落、碎裂,如綠色箭頭所示;胰島形狀不規(guī)則,核固縮，如藍(lán)色箭頭所示;胰島出現(xiàn)裂隙,胞質(zhì)空泡化，如黑色箭頭所示;可見少量毛細(xì)血管淤血擴(kuò)張，如黃色箭頭所示。二甲雙胍組和杞丹方各劑量組胰腺組織、胰腺細(xì)胞排列緊密,胰島得到一定程度恢復(fù)。

圖5 杞丹方對糖尿病小鼠胰腺組織的病理學(xué)影響(HE,×400)

3.6 各組小鼠肝臟組織病理變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示,空白組肝臟組織正常,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,胞膜清晰。模型組肝臟組織異常,同一肝臟組織中可見多種細(xì)胞形態(tài),肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞界限不清,如紅色箭頭所示;細(xì)胞水腫,部分肝臟細(xì)胞核固縮,結(jié)構(gòu)不完整,胞核淡染,如黑色箭頭所示;該區(qū)域血管充血,如黃色箭頭所示。二甲雙胍組和杞丹方各劑量組肝部組織結(jié)構(gòu)有明顯改善,肝臟細(xì)胞偶有核固縮、形態(tài)異常,少見血管充血。

圖6 杞丹方對糖尿病小鼠肝臟組織的病理學(xué)影響(HE,×400)

3.7 各組小鼠肝臟組織關(guān)鍵蛋白表達(dá)的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示,模型組相關(guān)蛋白表達(dá)下降，與空白組相比有顯著性差異(P<0.01)；杞丹方低劑量組與模型組相比p-IRS-1/IRS-1, p-PI3K/PI3K蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；杞丹方中、高劑量組，二甲雙胍組與模型組相比p-IRS-1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和 GLUT4 蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。

注:與空白組比較,##P<0.01; 與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01?！纒,n=3。

3.8 各組小鼠肝臟組織關(guān)鍵蛋白mRNA表達(dá)的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示,模型組關(guān)鍵蛋白mRNA表達(dá)水平下降,與空白組相比有顯著性差異(P<0.01);杞丹方高劑量組、二甲雙胍組與模型組相比IRS-1、PI3Kp85α、AKT1和GLUT4 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。

注:與空白組比較,##P<0.01; 與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01?！纒,n=3。

4 討論

糖尿病是一種多因素、多基因疾病。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病屬消渴病,主要病機(jī)為陰虛氣盛,氣虛血瘀，故本病應(yīng)采取滋陰清熱、補(bǔ)氣活血法治療。杞丹方由黃芪、枸杞子、桑葉、山茱萸、丹參組成,滋陰清熱、補(bǔ)氣活血,臨床用于早期糖尿病的輔助治療。方中枸杞子、桑葉、山茱萸滋陰清熱，黃芪、丹參補(bǔ)氣活血?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸杞子中的甜菜堿可防止飲食引起的肥胖小鼠葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損,減少肝臟脂質(zhì)積累[15];黃芪中的黃芪甲苷可增強(qiáng)胰腺組織的抗氧化能力,改善胰腺組織損傷,降低DKA幼鼠的血糖并提高胰島素水平[16];桑葉中主要生物堿1-脫氧野尻霉素具有降糖作用,可顯著降低糖尿病小鼠血糖,逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗[17];山茱萸中環(huán)烯醚萜類成分如馬錢苷能增加小鼠體質(zhì)量,降低1型糖尿病大鼠血糖水平,提高糖耐量[18]；丹參中的丹酚酸B顯著降低db/db小鼠的FBG水平,降低肝臟葡萄糖異生基因表達(dá)[19]。因此推測杞丹方效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)可能為生物堿類如甜菜堿、1-脫氧野尻霉素,皂苷類如黃芪甲苷,環(huán)烯醚萜類如馬錢苷,酚酸類如丹酚酸B。據(jù)文獻(xiàn)報道[20]四氧嘧啶可破壞小鼠胰島細(xì)胞、損傷肝臟,造成小鼠胰島及肝臟受損、胰島素分泌不足及胰島素抵抗,形成糖尿病。故本研究采用腹腔注射四氧嘧啶的方法制備小鼠糖尿病模型,研究杞丹方降血糖作用。結(jié)果表明杞丹方可顯著降低小鼠血糖,升高胰島素水平,減輕胰腺組織損傷,有利于改善糖尿病的病理狀態(tài)。

1型糖尿病肝臟的代謝與胰島素供應(yīng)有關(guān),肝臟是胰島素作用的靶器官之一,在糖脂代謝過程中起重要的作用[21-22]。代謝分析顯示,1型糖尿病患者骨骼肌和肝臟的胰島素敏感性降低12%～61%,且多種細(xì)胞內(nèi)信號通路參與該過程,其中IRS-1是激活PI3K/AKT通路的重要配體,其表達(dá)的降低導(dǎo)致胰島素信號負(fù)調(diào)控[23-24]。胰島素與胰島素受體結(jié)合可誘導(dǎo)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存,活化IRS進(jìn)而激活PI3K;活化的PI3K可以促進(jìn)下游靶蛋白AKT發(fā)生磷酸化,使細(xì)胞質(zhì)膜上的p-AKT釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)內(nèi),促進(jìn)GLUT4表達(dá),維持全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)[25-26]。二甲雙胍是糖尿病臨床常用藥,Xu等[27]研究表明二甲雙胍可能增強(qiáng)胰島素受體信號傳導(dǎo),顯著增加AKT蛋白的磷酸化水平,增加GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞膜的聚集, 上調(diào)IRS β表達(dá)及下游PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)杞丹方對糖尿病小鼠的肝臟組織具有一定的保護(hù)作用,并能上調(diào)肝臟組織的關(guān)鍵蛋白IRS-1、PI3K、AKT和GLUT4及其相關(guān)mRNA表達(dá)水平。表明杞丹方能改善糖尿病小鼠的疾病狀態(tài),其降血糖機(jī)制與調(diào)節(jié)IRS-1/PI3K/AKT信號通路有關(guān),這為杞丹方臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。